Imagem Multiplexada de Células Vivas para Respostas a Drogas em Modelos de Câncer Organoides Derivados de Pacientes

Resumo

Organoides tumorais derivados de pacientes são um sofisticado sistema modelo para pesquisa básica e translacional. Este artigo de métodos detalha o uso de imagens de células vivas fluorescentes multiplexadas para avaliação cinética simultânea de diferentes fenótipos organoides.

Resumo

Modelos organoides derivados do paciente (DOP) de câncer são um sistema de pesquisa multifuncional que recapitula melhor a doença humana em comparação com linhagens de células cancerosas. Modelos de DOP podem ser gerados pela cultura de células tumorais de pacientes em extratos extracelulares da membrana basal (EMB) e plaqueando-os como cúpulas tridimensionais. No entanto, reagentes comercialmente disponíveis que foram otimizados para ensaios fenotípicos em culturas de monocamada muitas vezes não são compatíveis com EMB. Neste artigo, descrevemos um método para plaquear modelos de DOP e avaliar os efeitos de drogas usando um sistema automatizado de imagens de células vivas. Além disso, aplicamos corantes fluorescentes compatíveis com medidas cinéticas para quantificar a saúde celular e a apoptose simultaneamente. A captura de imagem pode ser personalizada para ocorrer em intervalos de tempo regulares ao longo de vários dias. Os usuários podem analisar os efeitos da droga em imagens individuais do plano Z ou uma projeção Z de imagens seriais de múltiplos planos focais. Usando mascaramento, parâmetros específicos de interesse são calculados, como número de DOP, área e intensidade de fluorescência. Fornecemos dados de prova de conceito demonstrando o efeito de agentes citotóxicos na saúde celular, apoptose e viabilidade. Esta plataforma de imagem cinética automatizada pode ser expandida para outras leituras fenotípicas para entender diversos efeitos terapêuticos em modelos de PDO de câncer.

Introdução

Organoides tumorais derivados de pacientes (DOPs) estão emergindo rapidamente como um sistema modelo robusto para estudar o desenvolvimento de câncer e respostas terapêuticas. As DOPs são sistemas tridimensionais (3D) de cultura celular que recapitulam o complexo perfil genômico e a arquitetura^{do tumor primário1,2}. Ao contrário das culturas bidimensionais (2D) tradicionais de linhagens celulares de câncer imortalizadas, as DOPs capturam e mantêm a heterogeneidade intratumoral ^3,4, tornando-as uma ferramenta valiosa para pesquisas mecanicistas e transla....

Protocolo

Estudos utilizando espécimes de tumores humanos foram revisados e aprovados pelo Comitê de Revisão Institucional (IRB) da Universidade de Iowa, protocolo #201809807, e realizados de acordo com os padrões éticos estabelecidos na Declaração de Helsinque de 1964 e suas alterações posteriores. O termo de consentimento livre e esclarecido foi obtido de todos os sujeitos participantes do estudo. Os critérios de inclusão incluem o diagnóstico de câncer e a disponibilidade de espécimes tumorais.

1. Chapeamento de DOPs intactas em uma placa de 96 poços

1. Preparar reagentes.
   1. Pré-aqueça placas de 96 poços a 37 °C durant....

Discussão

As culturas de DOP estão se tornando um sistema modelo in vitro cada vez mais popular devido à sua capacidade de refletir respostas e comportamentos celulares². Avanços significativos foram feitos nas técnicas de geração, cultura e expansão de DOP, mas os métodos para analisar as respostas terapêuticas ficaram para trás. Os kits de viabilidade 3D disponíveis comercialmente são ensaios de desfecho lítico, perdendo dados de resposta cinética potencialmente valiosos e limitando análise.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrfuge tube	Dot Scientific Inc	1008113
15 mL conical centrifuge tube	Sarstedt	62.554.100
554 NM LED Cube	Agilent	1225012
96-well plate	Corning Costar	3596	Prewarmed to 37 °C
96-well plate	Agilent	204626-100	Prewarmed to 37 °C
A83-01	Tocris	2939	Final concentration is 500 nM (component of organoid culture media)
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634-010	component of organoid culture media
B27 Supplement	Gibco	17504044	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
BioTek BioSpa 8 Automated Incubator	Agilent	BIOSPAG-SN	Tabletop incubator; BioSpa OnDemand scheduling software comunicates with Gen5 to transfer plates between the BioSpa and the Cytation 5 for imaging (this protocol uses version 1.01.10)
BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader	Agilent	CYT5PW-SN	Plate reader; Gen5 software is used for this device (this protocol uses version 3.12.08)
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract	R&D Systems	BME001-10
Daunorubicin HCl	Sigma-Aldrich	S3035	Reconstituted in DMSO
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2438
EDTA (0.5 M)	Thermo Fisher	AM9260G
Forskolin	Tocris	1099	Final concentration is 10 µM (component of organoid culture media)
Glutamax	Gibco	35050-061	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Human EGF, Animal-Free Recombinant Protein	Gibco	AF-100-15-1MG	Final concentration is 0.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Human FGF-10 Recombinant Protein	Gibco	100-26-1MG	Final concentration is 10 ng/mL (component of organoid culture media)
Human R-Spondin 1 Recombinant Protein	Gibco	120-38-5UG	Final concentration is 250 ng/mL (component of organoid culture media)
Hydrocortisone Stock Solution	StemCell Technologies	7926	Final concentration is 500 ng/mL (component of organoid culture media)
Imaging Filter Cube- GFP	Agilent	1225101
Imaging Filter Cube- TRITC	Agilent	1225125
Imaging LED GFP/CFP	Agilent	1225001
Incucyte Annexin V Red Dye	Sartorius	4641	Reconstituted in organoid culture media
Incucyte Cytotox Green Dye	Sartorius	4633	DMSO solution
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A7250	Final concentration is 1.25 mM (component of organoid culture media)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining Solution	Fisher-Scientific	13366169	Add 1:50 volume
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Noggin	R&D Systems	6057-NG	Final concentration is 100 ng/mL (component of organoid culture media)
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Final concentration is 10 units/mL (component of organoid culture media)
Phosphate Buffered Saline (1x)	Gibco	14190-144
Primocin	InvivoGen	ant-pm-05	Final concentration is 100 µg/mL (component of organoid culture media)
Recombinant Human Heregulinβ-1	Pepro Tech	100-03	Final concentration is 37.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Staurosporine solution from Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	S6942
TrypLE Express	Life Technologies	12604013
Y-27632, CAS 331752-47-7	Sigma-Aldrich	688000	Final concentration is 5 µM (component of organoid culture media)
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	Final concentration is 100 nM (component of organoid culture media)