Imaging multiplexato di cellule vive per le risposte ai farmaci in modelli di organoidi derivati da pazienti

Riepilogo

Gli organoidi tumorali derivati da pazienti sono un sofisticato sistema modello per la ricerca di base e traslazionale. Questo articolo sui metodi descrive in dettaglio l'uso dell'imaging fluorescente multiplexato di cellule vive per la valutazione cinetica simultanea di diversi fenotipi organoidi.

Abstract

I modelli di cancro con organoidi derivati dal paziente (PDO) sono un sistema di ricerca multifunzionale che ricapitola meglio la malattia umana rispetto alle linee cellulari tumorali. I modelli PDO possono essere generati coltivando cellule tumorali del paziente in estratti di membrana basale extracellulare (BME) e placcandole come cupole tridimensionali. Tuttavia, i reagenti disponibili in commercio che sono stati ottimizzati per i saggi fenotipici nelle colture monostrato spesso non sono compatibili con il BME. In questo articolo, descriviamo un metodo per placcare modelli di PDO e valutare gli effetti dei farmaci utilizzando un sistema automatizzato di imaging di cellule vive. Inoltre, applichiamo coloranti fluorescenti compatibili con le misurazioni cinetiche per quantificare contemporaneamente la salute delle cellule e l'apoptosi. L'acquisizione delle immagini può essere personalizzata in modo che avvenga a intervalli di tempo regolari per diversi giorni. Gli utenti possono analizzare gli effetti dei farmaci in singole immagini del piano Z o in una proiezione Z di immagini seriali da più piani focali. Utilizzando il mascheramento, vengono calcolati parametri specifici di interesse, come il numero di DOP, l'area e l'intensità della fluorescenza. Forniamo dati proof-of-concept che dimostrano l'effetto degli agenti citotossici sulla salute, l'apoptosi e la vitalità cellulare. Questa piattaforma di imaging cinetico automatizzato può essere estesa ad altre letture fenotipiche per comprendere i diversi effetti terapeutici nei modelli PDO di cancro.

Introduzione

Gli organoidi tumorali derivati da pazienti (PDO) stanno rapidamente emergendo come un robusto sistema modello per studiare lo sviluppo del cancro e le risposte terapeutiche. I PDO sono sistemi di coltura cellulare tridimensionali (3D) che ricapitolano il complesso profilo genomico e l'architettura del tumore primario ^1,2. A differenza delle tradizionali colture bidimensionali (2D) di linee cellulari tumorali immortalizzate, i PDO catturano e mantengono l'eterogeneità intratumorale ^3,4, rendendoli uno strumento prezioso sia per la ricerca meccanicistic....

Protocollo

Gli studi che utilizzano campioni tumorali umani sono stati esaminati e approvati dall'Institutional Review Board (IRB) dell'Università dell'Iowa, protocollo #201809807, ed eseguiti in conformità con gli standard etici stabiliti nella Dichiarazione di Helsinki del 1964 e nei suoi successivi emendamenti. Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i soggetti che hanno partecipato allo studio. I criteri di inclusione includono una diagnosi di cancro e la disponibilità di campioni tumorali.

1. Placcatura di PDO intatti in una piastra a 96 pozzetti

1. Preparare i reagenti.
   1. Preriscaldare le piastre a 96 pozzett....

Discussione

Le colture di PDO stanno diventando un sistema modello in vitro sempre più popolare grazie alla loro capacità di riflettere le risposte e i comportamenti cellulari². Sono stati compiuti progressi significativi nella generazione, nella coltura e nelle tecniche di espansione della DOP, ma i metodi per analizzare le risposte terapeutiche sono rimasti indietro. I kit di vitalità 3D disponibili in commercio sono saggi di endpoint litico, che perdono dati di risposta cinetica potenzialmente preziosi .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrfuge tube	Dot Scientific Inc	1008113
15 mL conical centrifuge tube	Sarstedt	62.554.100
554 NM LED Cube	Agilent	1225012
96-well plate	Corning Costar	3596	Prewarmed to 37 °C
96-well plate	Agilent	204626-100	Prewarmed to 37 °C
A83-01	Tocris	2939	Final concentration is 500 nM (component of organoid culture media)
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634-010	component of organoid culture media
B27 Supplement	Gibco	17504044	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
BioTek BioSpa 8 Automated Incubator	Agilent	BIOSPAG-SN	Tabletop incubator; BioSpa OnDemand scheduling software comunicates with Gen5 to transfer plates between the BioSpa and the Cytation 5 for imaging (this protocol uses version 1.01.10)
BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader	Agilent	CYT5PW-SN	Plate reader; Gen5 software is used for this device (this protocol uses version 3.12.08)
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract	R&D Systems	BME001-10
Daunorubicin HCl	Sigma-Aldrich	S3035	Reconstituted in DMSO
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2438
EDTA (0.5 M)	Thermo Fisher	AM9260G
Forskolin	Tocris	1099	Final concentration is 10 µM (component of organoid culture media)
Glutamax	Gibco	35050-061	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Human EGF, Animal-Free Recombinant Protein	Gibco	AF-100-15-1MG	Final concentration is 0.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Human FGF-10 Recombinant Protein	Gibco	100-26-1MG	Final concentration is 10 ng/mL (component of organoid culture media)
Human R-Spondin 1 Recombinant Protein	Gibco	120-38-5UG	Final concentration is 250 ng/mL (component of organoid culture media)
Hydrocortisone Stock Solution	StemCell Technologies	7926	Final concentration is 500 ng/mL (component of organoid culture media)
Imaging Filter Cube- GFP	Agilent	1225101
Imaging Filter Cube- TRITC	Agilent	1225125
Imaging LED GFP/CFP	Agilent	1225001
Incucyte Annexin V Red Dye	Sartorius	4641	Reconstituted in organoid culture media
Incucyte Cytotox Green Dye	Sartorius	4633	DMSO solution
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A7250	Final concentration is 1.25 mM (component of organoid culture media)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining Solution	Fisher-Scientific	13366169	Add 1:50 volume
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Noggin	R&D Systems	6057-NG	Final concentration is 100 ng/mL (component of organoid culture media)
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Final concentration is 10 units/mL (component of organoid culture media)
Phosphate Buffered Saline (1x)	Gibco	14190-144
Primocin	InvivoGen	ant-pm-05	Final concentration is 100 µg/mL (component of organoid culture media)
Recombinant Human Heregulinβ-1	Pepro Tech	100-03	Final concentration is 37.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Staurosporine solution from Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	S6942
TrypLE Express	Life Technologies	12604013
Y-27632, CAS 331752-47-7	Sigma-Aldrich	688000	Final concentration is 5 µM (component of organoid culture media)
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	Final concentration is 100 nM (component of organoid culture media)