Imaging multiplexato di cellule vive per le risposte ai farmaci in modelli di organoidi derivati da pazienti

Riepilogo

Gli organoidi tumorali derivati da pazienti sono un sofisticato sistema modello per la ricerca di base e traslazionale. Questo articolo sui metodi descrive in dettaglio l'uso dell'imaging fluorescente multiplexato di cellule vive per la valutazione cinetica simultanea di diversi fenotipi organoidi.

Abstract

I modelli di cancro con organoidi derivati dal paziente (PDO) sono un sistema di ricerca multifunzionale che ricapitola meglio la malattia umana rispetto alle linee cellulari tumorali. I modelli PDO possono essere generati coltivando cellule tumorali del paziente in estratti di membrana basale extracellulare (BME) e placcandole come cupole tridimensionali. Tuttavia, i reagenti disponibili in commercio che sono stati ottimizzati per i saggi fenotipici nelle colture monostrato spesso non sono compatibili con il BME. In questo articolo, descriviamo un metodo per placcare modelli di PDO e valutare gli effetti dei farmaci utilizzando un sistema automatizzato di imaging di cellule vive. Inoltre, applichiamo coloranti fluorescenti compatibili con le misurazioni cinetiche per quantificare contemporaneamente la salute delle cellule e l'apoptosi. L'acquisizione delle immagini può essere personalizzata in modo che avvenga a intervalli di tempo regolari per diversi giorni. Gli utenti possono analizzare gli effetti dei farmaci in singole immagini del piano Z o in una proiezione Z di immagini seriali da più piani focali. Utilizzando il mascheramento, vengono calcolati parametri specifici di interesse, come il numero di DOP, l'area e l'intensità della fluorescenza. Forniamo dati proof-of-concept che dimostrano l'effetto degli agenti citotossici sulla salute, l'apoptosi e la vitalità cellulare. Questa piattaforma di imaging cinetico automatizzato può essere estesa ad altre letture fenotipiche per comprendere i diversi effetti terapeutici nei modelli PDO di cancro.

Introduzione

Gli organoidi tumorali derivati da pazienti (PDO) stanno rapidamente emergendo come un robusto sistema modello per studiare lo sviluppo del cancro e le risposte terapeutiche. I PDO sono sistemi di coltura cellulare tridimensionali (3D) che ricapitolano il complesso profilo genomico e l'architettura del tumore primario ^1,2. A differenza delle tradizionali colture bidimensionali (2D) di linee cellulari tumorali immortalizzate, i PDO catturano e mantengono l'eterogeneità intratumorale ^3,4, rendendoli uno strumento prezioso sia per la ricerca meccanicistica che traslazionale. Sebbene i PDO stiano diventando un sistema modello sempre più popolare, i reagenti disponibili in commercio e i metodi di analisi per gli effetti cellulari compatibili con le colture PDO sono limitati.

La mancanza di metodi robusti per analizzare i sottili cambiamenti nella risposta al trattamento ostacola la traduzione clinica. Il reagente gold standard per la salute cellulare nelle colture 3D, CellTiter-Glo 3D, utilizza i livelli di ATP come determinante della vitalità cellulare ^5,6. Sebbene questo reagente sia utile per i saggi endpoint, ci sono diverse avvertenze, in particolare l'impossibilità di utilizzare i campioni per altri scopi dopo il completamento del test.

L'imaging di cellule vive è una forma sofisticata di microscopia cinetica che, se combinata con reagenti fluorescenti, ha la capacità di quantificare una varietà di letture della salute cellulare all'interno dei modelli PDO, tra cui l'apoptosi ^7,8,9 e la citotossicità¹⁰. In effetti, l'imaging di cellule vive è stato parte integrante dello screening ad alto rendimento di composti in piattaforme 2D^11,12. Sistemi come l'Incucyte hanno reso la tecnologia conveniente e quindi accessibile ai gruppi di ricerca in una varietà di contesti. Tuttavia, l'applicazione di questi sistemi per analizzare le colture 3D è ancora agli inizi.

In questo articolo, descriviamo un metodo per valutare la risposta ai farmaci in modelli PDO di cancro utilizzando l'imaging multiplexato su cellule vive (Figura 1). Attraverso l'analisi di immagini in campo chiaro, è possibile monitorare cineticamente i cambiamenti nelle dimensioni e nella morfologia della DOP. Inoltre, i processi cellulari possono essere quantificati simultaneamente nel tempo utilizzando reagenti fluorescenti, come il colorante rosso Annexin V per l'apoptosi e il colorante verde Cytotox per la citotossicità. I metodi presentati sono ottimizzati per il sistema di imaging di cellule vive Cytation 5, ma questo protocollo può essere adattato a diverse piattaforme di imaging di cellule vive.

Protocollo

Gli studi che utilizzano campioni tumorali umani sono stati esaminati e approvati dall'Institutional Review Board (IRB) dell'Università dell'Iowa, protocollo #201809807, ed eseguiti in conformità con gli standard etici stabiliti nella Dichiarazione di Helsinki del 1964 e nei suoi successivi emendamenti. Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i soggetti che hanno partecipato allo studio. I criteri di inclusione includono una diagnosi di cancro e la disponibilità di campioni tumorali.

1. Placcatura di PDO intatti in una piastra a 96 pozzetti

1. Preparare i reagenti.
   1. Preriscaldare le piastre a 96 pozzetti a 37 °C durante la notte e scongelare il BME durante la notte a 4 °C.
   2. Preparare terreni di coltura di organoidi completi ottimizzati per la coltura del tipo di cancro di interesse. I terreni di coltura specifici utilizzati per gli esperimenti qui illustrati sono forniti nella Tabella supplementare 1.
      NOTA: Potrebbe essere necessario modificare i componenti del supporto per diversi tipi di tumore. Ad esempio, il terreno di coltura degli organoidi è integrato con estradiolo 100 nM per i tumori ginecologici¹³. Il terreno preparato è stabile a 4 °C per 1 mese. Per la conservazione a lungo termine, aliquotare il terreno in provette da 50 mL e conservare a -20 °C.
2. Preparare due aliquote separate di terreni di coltura organoidi a 4 °C e 37 °C. Ad esempio, se si stanno placcando 60 pozzetti in una piastra da 96 pozzetti, utilizzare 6 mL di terreno di coltura di organoidi caldo e 150 μL di terreno di coltura di organoidi ghiacciato.
3. Preparare il tampone di lavaggio degli organoidi: Integrare 1x PBS con 10 mM di HEPES, 1x Glutamax, 5 mM di EDTA e 10 μM Y-27632. Conservare a 4 °C
4. Raccogliere le DOP coltivate in una piastra a 24 pozzetti. Eseguire tutti i passaggi su ghiaccio o a 4 °C, se non diversamente specificato.
   1. Aspirare i terreni da ciascun pozzetto utilizzando un sistema di linea del vuoto.
   2. Aggiungere 500 μL di tampone per il lavaggio degli organoidi ghiacciati e pipettare delicatamente 2-3 volte utilizzando un pipettor da 1000 μL. Incubare la piastra su ghiaccio per 10 min.
   3. Trasferire il contenuto di ciascun pozzetto in una provetta conica da 50 mL. Per garantire che tutti i DOP siano in sospensione, sciacquare ogni pozzetto con altri 300 μL di tampone di lavaggio degli organoidi e trasferire nella provetta conica da 50 mL. Centrifugare per 5 min a 350 x g a 4 °C
   4. Aspirare il surnatante dal pellet BME/organoide utilizzando un sistema di linea a vuoto, lasciando ~ 5 mL rimanenti nella provetta. Aggiungere 20 mL di tampone organoide di lavaggio e risospendere delicatamente il pellet utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL. Incubare su ghiaccio per 10 min.
   5. Centrifugare per 5 minuti a 350 x g a 4 °C. Aspirare il surnatante con un sistema a linea di vuoto, facendo attenzione a non disturbare il pellet DOP.
5. Placcatura dei PDO in una piastra a 96 pozzetti: Eseguire tutti i passaggi sul ghiaccio, se non diversamente specificato.
   1. Risospendere il pellet PDO in una quantità appropriata di terreno di coltura organoide ghiacciato per creare una sospensione PDO. Trasferire la sospensione di PDO in una provetta per microcentrifuga ghiacciata da 1,5 mL.
      NOTA: Per calcolare la quantità di terreni di coltura organoidi, determinare il numero di pozzetti da placcare in una piastra a 96 pozzetti, tenendo presente che i PDO sono placcati in una cupola da 5 μL in un rapporto 1:1 tra terreni di coltura organoidi e BME. Ad esempio, quando si placca una piastra da 96 pozzetti e si utilizzano solo i 60 pozzetti interni, la quantità totale di sospensione di PDO necessaria sarà di 300 μL: 150 μL di terreni di coltura organoidi e 150 μL di BME. Per i modelli che mostrano una crescita ottimale a diverse percentuali di BME, il rapporto BME:terreni può essere modificato in questa fase, anche se è importante standardizzare il rapporto tra tutti i saggi per ogni modello specifico. Per tenere conto dell'errore di pipettaggio, aggiungere il 10% del volume a ciascun componente.
   2. Contare il numero di DOP.
      1. Trasferire 2,5 μL della sospensione di PDO in una provetta per microcentrifuga ghiacciata da 1,5 mL e miscelare con 2,5 μL di BME. Trasferire la miscela da 5 μL su un vetrino da microscopio pulito. Non vetrino coprivetrino. La miscela si solidificherà in una cupola.
      2. Visualizzare utilizzando un microscopio a campo chiaro a 4x. Contare il numero di PDO nella miscela da 5 μL; l'obiettivo è quello di avere circa 25-50 PDO per cupola da 5 μL.
         NOTA: Se nella miscela di prova non viene raggiunta la densità desiderata, regolare il volume finale della sospensione di PDO aggiungendo più terreni di coltura di organoidi o centrifugando la sospensione di PDO e risospendendo il pellet di PDO in un volume inferiore di terreno di coltura di organoidi ghiacciato. Indipendentemente da come viene modificata la sospensione PDO in questa fase, il rapporto finale tra BME e sospensione PDO nella fase 1.5.3. dovrebbe essere 1:1.
   3. Utilizzando un pipettatore da 200 μL con punte a foro largo, miscelare con cura la sospensione di PDO con una quantità uguale di BME per ottenere un rapporto 1:1 tra terreni di coltura organoidi e BME. Evita le bolle, che interromperanno l'integrità delle cupole.
   4. Utilizzando un pipettor da 20 μL, seminare cupole da 5 μL al centro di ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti preriscaldata, seminando solo i 60 pozzetti interni. Per garantire un'equa distribuzione dei PDO, pipettare periodicamente il contenuto della provetta da 1,5 mL con un pipettatore da 200 μL con puntali a foro largo.
   5. Dopo che tutti i pozzetti sono stati seminati, posizionare il coperchio sul piatto e capovolgere delicatamente. Incubare la piastra rovesciata a 37 °C per 20 minuti nell'incubatore per colture tissutali per consentire alle cupole di solidificarsi.
      NOTA: L'inversione della piastra assicura che la cupola del terreno di coltura BME/organoide mantenga la struttura 3D per fornire uno spazio adeguato per la formazione di PDO.
   6. Capovolgere la piastra in modo che sia appoggiata con il coperchio rivolto verso l'alto e incubare per 5 minuti a 37 °C.

2. Trattamenti e aggiunta di coloranti fluorescenti per multiplexing

1. Mentre le cupole BME si solidificano nelle piastre a 96 pozzetti, preparare diluizioni di reagenti fluorescenti per l'imaging di cellule vive. Di seguito sono riportati i parametri specifici per il multiplexing del colorante rosso Annexin V e del colorante verde Cytotox.
2. Preparazione di reagenti fluorescenti (giorno -1): calcolare il volume appropriato di terreni di coltura organoidi in base al numero di pozzetti da trattare, supponendo che ogni pozzetto venga trattato con 100 μL di terreno dosato con colorante. Diluire il colorante in terreni di coltura organoidi preriscaldati alla concentrazione desiderata.
   NOTA: La quantità totale di supporti necessari varia a seconda dell'esperimento. Aggiungere il 10% al volume finale per tenere conto dell'errore di pipettaggio. Ad esempio, per trattare i 60 pozzetti interni di una piastra a 96 pozzetti, preparare 6,6 mL di terreno dosato con colorante (Tabella 1).
3. Trattare ogni pozzetto con 100 μL di terreno di coltura organoide dosato con 2x colorante. Aggiungere 200 μL di PBS sterile 1x ai pozzetti vuoti esterni della piastra. Incubare a 37 °C per una notte.
   NOTA: Il PBS nei pozzetti periferici riduce l'evaporazione dei fluidi dai pozzetti interni.
4. Aggiunta di farmaci/agenti di trattamento (Giorno 0): Preparare i farmaci in terreni di coltura di organoidi preriscaldati a una concentrazione 2x in un volume di 100 μL per pozzetto.
   NOTA: Il DMSO può essere tossico per le cellule ad alte concentrazioni. Una concentrazione dello 0,1% di DMSO non viene superata negli esperimenti eseguiti in questo studio. Oltre ai farmaci, alcuni reagenti fluorescenti sono distribuiti come soluzione DMSO. È importante tenere conto della concentrazione totale di DMSO quando si lavora con tali reagenti.
5. Aggiungere 100 μL di 2 terreni dosati con colorante in ciascun pozzetto; Evitare di creare bolle.

3. Impostazione dei parametri di imaging

1. Posizionare la piastra in Cytation 5. Aperto Software Gen5. Fare clic su Nuova attività > modalità manuale dell'imager. Selezionare Cattura ora e immettere le seguenti impostazioni: Obiettivo (selezionare l'ingrandimento desiderato); Filtro (selezionare la micropiastra); Formato micropiastra (selezionare il numero di pozzetti); e Tipo di recipiente (selezionare il tipo di piastra). Fare clic su Usa coperchio e Usa velocità del vettore più lenta. Fare clic su OK.
   NOTA: Tipo di recipiente: Essere il più specifici possibile quando si selezionano le informazioni sulla piastra perché il software è calibrato sulla distanza specifica dall'obiettivo al fondo della piastra per ogni tipo di piastra e spessore della plastica.
   Velocità di trasporto più lenta: selezionare questa casella per evitare di interrompere le cupole durante il carico/scarico delle piastre.
2. Crea uno Z-Stack che immaginerà l'intera cupola BME.
   1. Selezionare un pozzo di interesse da visualizzare (pannello di sinistra, sotto l'istogramma).
   2. Selezionare il canale Campo chiaro (pannello di sinistra, in alto). Fare clic su Esposizione automatica e regolare le impostazioni in base alle esigenze.
   3. Impostare la parte inferiore e superiore della scheda Z-Stack: Expand Imaging Mode (pannello di sinistra, al centro). Seleziona la casella Z-Stack . Utilizzando le frecce di regolazione della rotta (pannello di sinistra, al centro), fare clic sulla regolazione verso il basso fino a quando tutti i PDO non sono entrati e poi sono sfocati e sono sfocati. Impostalo come parte inferiore dello Z-Stack. Ripeti nella direzione opposta utilizzando le frecce di regolazione della rotta per impostare la parte superiore dello Z-Stack.
   4. Per assicurarsi che le impostazioni dello Z-Stack siano appropriate per altri pozzetti di interesse, selezionare un altro pozzetto (pannello di sinistra, sotto l'istogramma) e visualizzare la parte superiore e inferiore dello Z-Stack.
   5. Per inserire manualmente le posizioni focali, fare clic sui tre punti accanto alla regolazione fine (pannello di sinistra, in alto). Si aprirà una finestra; digitare il valore Z-Stack superiore (che si trova nel pannello di sinistra, al centro, in Modalità imaging). Ripetere l'operazione per il valore Z-Stack inferiore. Regolare se necessario per acquisire l'intervallo Z desiderato ripetendo il passaggio 3.2.3. Se sono necessarie regolazioni, selezionare un altro pozzetto per verificare le impostazioni.
3. Impostare le impostazioni di esposizione per i canali fluorescenti. Le impostazioni sono descritte per due canali fluorescenti (GFP e TRITC). Il numero specifico di canali fluorescenti dipenderà dall'esperimento e da quali cubi fluorescenti sono installati nel sistema di imaging delle cellule vive.
   NOTA: Se si prevede che l'intensità del segnale sia significativamente più alta alla fine dell'esperimento, gli utenti dovrebbero prendere in considerazione l'esecuzione di esperimenti di prova per determinare le impostazioni di esposizione ottimali alla fine dell'esperimento che possono quindi essere applicate durante l'impostazione dei parametri iniziali.
   1. Espandi la scheda Modalità di imaging (pannello di sinistra, al centro) e apri Modifica passaggio di imaging. Apparirà una finestra pop-up.
   2. In Canali, fare clic sulla bolla per il numero desiderato di canali. Designare un canale per il campo chiaro e canali aggiuntivi per ciascun canale fluorescente. In questo esempio, Canale 1 = Campo chiaro; Canale 2 = GFP; Canale 3 = TRITC. Utilizzando i menu a discesa Colore, selezionare l'impostazione appropriata per ciascun canale. Chiudere la finestra di modifica facendo clic su OK.
   3. Impostare ciascun canale fluorescente.
      1. Cambia il canale su GFP (pannello di sinistra, in alto).
      2. Fare clic su Esposizione automatica (pannello di sinistra, in alto). Espandi la scheda Esposizione (pannello di sinistra, al centro) e regola le impostazioni di esposizione per ridurre al minimo il segnale di sfondo.
      3. Copiare le impostazioni di esposizione nella scheda Modalità immagine seguendo i passaggi 3.3.3.3-3.3.3.6.
      4. Fare clic sull'icona Copia accanto alla casella Modifica passaggio di imaging . Fare clic su Modifica passaggio di imaging, che aprirà un'altra finestra.
      5. Sotto il canale GFP, fare clic sull'icona Appunti nella riga Esposizione per aggiungere le impostazioni Illuminazione, Tempo di integrazione e Guadagno fotocamera al canale.
      6. Ripetere i passaggi 3.3.3.4-3.3.3.5 per il canale TRITC. Fare clic su OK per chiudere la finestra.
4. Impostare le fasi di pre-elaborazione dell'immagine e proiezione Z per automatizzare la pre-elaborazione dell'immagine.
   1. Fare clic sull'icona della fotocamera (pannello di sinistra, angolo in basso). Si aprirà una nuova finestra.
   2. In Aggiungi fase di elaborazione (pannello di sinistra, in basso), fai clic su Pre-elaborazione dell'immagine. Si aprirà una nuova finestra.
   3. Nella scheda Campo chiaro , deselezionate Applica pre-elaborazione immagine.
   4. Per ogni scheda Canale fluorescente , assicurarsi che sia selezionata l'opzione Applica pre-elaborazione immagine . Deselezionate Usa le stesse opzioni del canale 1 e fate clic su OK. La finestra si chiuderà.
   5. In Aggiungi fase di elaborazione, fare clic su Proiezione Z. Si aprirà una nuova finestra. Se lo si desidera, regolare l'intervallo di sezioni (ad esempio, per restringere l'intervallo Z). Chiudere la finestra selezionando OK.
5. Creare il protocollo.
   1. Fare clic su Set di immagini nella barra degli strumenti. Nel menu a discesa, fai clic su Crea esperimento da questo set di immagini. La finestra di imaging si chiude e si apre la finestra della procedura .
      NOTA: I parametri selezionati in Imager Manual Mode (Modo manuale dell'imager ) verranno caricati automaticamente nella nuova finestra, per cui sarà possibile creare un protocollo sperimentale.
   2. Impostare la temperatura e il gradiente: fai clic su "Imposta temperatura" sotto l'intestazione Azioni (a sinistra). Si aprirà una nuova finestra. Selezionare Incubatrice accesa e inserire manualmente la temperatura desiderata in Temperatura. Quindi, in Sfumatura, immettere manualmente 1. Chiudere la finestra selezionando OK.
      NOTA: La creazione di un gradiente di 1 °C impedirà la formazione di condensa sul coperchio della piastra.
   3. Designare i pozzetti all'immagine.
      1. Fare doppio clic sul passaggio dell'immagine in Descrizione. Fare clic su Piastra completa (angolo destro, in alto). Si aprirà la finestra Layout piastra .
      2. Evidenziare i pozzetti di interesse utilizzando il cursore. Fare clic su OK. Se lo si desidera, selezionare le caselle Raggruppamento messa a fuoco automatica e Contenitore acquisizione . Fare clic su OK per chiudere la finestra.
         NOTA: Il binning richiederà la regolazione dell'esposizione, come descritto al punto 3.3.3.2 sopra. Fare riferimento alla sezione Discussione per scenari specifici in cui questa funzione può essere utilizzata.
   4. Impostare gli intervalli per l'imaging cinetico.
      1. Fare clic su Opzioni sotto l'intestazione Altro (a sinistra). Selezionare la casella Procedura cinetica discontinua .
      2. In Tempo totale stimato, inserisci il tempo di esecuzione dell'esperimento (ad esempio, 5 giorni). In Intervallo stimato, immettere l'intervallo per l'immagine della lastra (ad esempio, ogni 6 ore).
      3. Fare clic su Pausa dopo ogni corsa per consentire il trasferimento della piastra nell'incubatrice. Chiudere la finestra selezionando OK.
   5. Aggiorna i passaggi per la riduzione dei dati.
      1. Fare clic su OK per chiudere la finestra della procedura. Si aprirà una scheda per aggiornare i passaggi di riduzione dei dati. Selezionare Sì. Fare doppio clic su Pre-elaborazione dell'immagine. Fare clic sui diversi canali per verificare le impostazioni e fare clic su OK.
      2. Fare doppio clic su Proiezione Z. Fare clic sui diversi canali per verificare le impostazioni. Fare clic su OK. Quindi, fare di nuovo clic su OK per chiudere la finestra Riduzione dati.
   6. Formattare il layout della piastra.
      1. Aprire la procedura guidata di layout delle piastre e designare i tipi di pozzetti seguendo i passaggi 3.6.2-3.6.3.
      2. Fare clic sull'icona Layout piastra nella barra degli strumenti (angolo sinistro, in alto) per aprire la Creazione guidata layout piastra.
      3. Seleziona le caselle accanto ai tipi di pozzetti utilizzati nell'esperimento. In Controlli del saggio, immettere il numero di diversi tipi di controllo utilizzando le frecce. Fare clic su Next (Avanti ) per aprire la finestra Assay Control #1 (Controllo del saggio #1 ).
      4. Impostare le condizioni del pozzetto di controllo del saggio seguendo i passaggi 3.6.5-3.6.8.
      5. Nella finestra Assay Control #1 immettere l'etichetta di controllo nella casella ID layout piastra . Se lo si desidera, immettere il nome completo nella casella adiacente. Selezionare il numero di repliche per la rispettiva condizione di controllo utilizzando le frecce.
      6. Se si utilizzano più concentrazioni o una serie di diluizioni all'interno del controllo, fare clic su Definisci diluizioni/concentrazioni e utilizzare il menu a discesa per selezionare il Tipo. Immettere i valori per ciascuna concentrazione/diluizione nella tabella.
         NOTA: La funzione automatica può essere utilizzata se le concentrazioni cambiano di un incremento costante.
      7. Seleziona la scheda Colore nella barra degli strumenti. Scegli il colore del testo desiderato e il colore di sfondo per il controllo nel menu a discesa. Fare clic su Next (Avanti).
      8. Ripetere l'operazione se necessario con controlli aggiuntivi.
      9. Impostare le condizioni del pozzetto campione dopo i punti 3.6.10-3.6.12.
      10. Nella pagina Sample Setup (Configurazione esempio ), immettere il prefisso dell'ID di esempio (ad esempio, SPL). Selezionare il numero di repliche utilizzando le frecce. Se si utilizzano campioni con concentrazioni di trattamento variabili, selezionare Concentrazioni o Diluizioni nel menu a discesa Tipo . Immettere le diluizioni/concentrazioni nella tabella e immettere le unità nella casella Unità .
      11. Selezionare Campi di identificazione nella barra degli strumenti. Immettere i nomi delle categorie desiderate (ad es. ID campione, farmaco) nella tabella.
      12. Selezionare la scheda Colore nella barra degli strumenti. Selezionare un colore diverso per ogni gruppo/campione di trattamento. Fare clic su Fine. Si aprirà la pagina Layout piastra.
          NOTA: I numeri sul lato sinistro sono correlati ai diversi numeri di campione.
      13. Assegnare gli ID di esempio seguendo i passaggi 3.6.14-3.6.16.
      14. Selezionare SPL1 dal pannello di sinistra. Utilizzare il cursore per selezionare i pozzetti.
          NOTA: Gli strumenti di selezione automatica possono essere regolati nella casella di assegnazione seriale. Il numero di repliche e l'orientamento del layout possono essere predefiniti.
      15. Ripetere l'operazione con altri campioni per completare il layout della piastra. Una volta soddisfatto, fare clic su OK.
      16. Nella barra degli strumenti File selezionare ID di esempio. Compila le colonne ID campione con le informazioni appropriate per ogni campione (ad esempio, il tipo di farmaco). Premere OK.
   7. Salvare il protocollo.
      1. Nella barra degli strumenti, fare clic su File > Salva protocollo con nome. Selezionare il percorso in cui salvare il file. Immettere un nome per il file. Fare clic su Salva per chiudere la finestra.
      2. Fare clic su File > Esci nella barra degli strumenti. Si aprirà una scheda per salvare le modifiche apportate alla modalità manuale dell'imager. Selezionare No.
      3. Si aprirà una scheda per salvare le modifiche apportate all'Esperimento 1. Selezionare No. Si aprirà una scheda per aggiornare la definizione del protocollo. Seleziona Aggiorna. Chiudere il software.
6. Importare il protocollo in BioSpa OnDemand e completare la configurazione dell'esperimento.
   1. Aprire il software BioSpa OnDemand (software di pianificazione).
   2. Selezionare uno slot disponibile nel software.
   3. Rimuovere la piastra dal sistema di imaging delle cellule vive. Fare clic su Apri cassetto per accedere allo slot appropriato nel software di pianificazione e inserire la piastra. Fai clic su Chiudi cassetto.
      NOTA: Questo passaggio può essere eseguito in qualsiasi momento dopo che il protocollo è stato creato nel passaggio 3.5.7 precedente. Tuttavia, la piastra deve essere nella Cytation 5 per eseguire un'esecuzione di temporizzazione nel passaggio 3.6.4.3 seguente.
   4. Importare il protocollo.
      1. Nella scheda Informazioni sulla procedura , selezionare Utente nel menu a discesa. Accanto allo slot Protocollo , fai clic su Seleziona > Aggiungi una nuova voce.
      2. Accanto allo slot Protocollo, fai clic su Seleziona. Si aprirà una nuova finestra per passare al protocollo desiderato nell'architettura del file. Fare clic su Apri per importare il protocollo nel software di pianificazione.
      3. Immettere la quantità di tempo necessaria per creare l'immagine della lastra. Fare clic su OK per chiudere la finestra Elenco protocolli Gen5 .
         NOTA: questo passaggio è particolarmente importante quando si eseguono più esperimenti contemporaneamente. Per determinare il tempo necessario per l'immagine, fare clic su Esegui ora un'esecuzione di temporizzazione. Fare clic su OK.
   5. Imposta gli intervalli di imaging e pianifica l'esperimento.
      1. In Intervallo, immettere l'intervallo di imaging indicato al punto 3.5.4.
      2. In Opzioni ora di inizio, seleziona Quando disponibile. In Durata, seleziona Fisso o Continuo.
         NOTA: È possibile designare un'ora di inizio specifica invece di eseguire il protocollo al successivo orario disponibile. Se si seleziona Durata fissa , verrà impostato un endpoint specifico per l'esperimento e sarà necessario che l'utente designi un intervallo di tempo sperimentale. La durata continua consente l'esecuzione dell'esperimento senza endpoint e può essere terminata solo da un utente che interrompe l'esperimento.
      3. Fare clic su Abaco piastra/imbarcazione. Si aprirà la sequenza di convalida della piastra. Si aprirà una scheda con l'ora di prima lettura proposta. Fare clic su Sì per accettare questa pianificazione.

4. Analisi delle immagini nel software Gen5 (Figura 2)

1. Aprire il modulo Analisi delle immagini.
   1. Aprire Gen5. In Gestione attività, seleziona Esperimenti > Apri. Selezionare l'esperimento per aprire il file. Fare clic su Piastra > Vista nella barra degli strumenti.
   2. Modificare il menu a discesa Dati in Proiezione Z. Fare doppio clic su un pozzo di interesse. Selezionare Analizza > si desidera impostare un nuovo passaggio di riduzione dei dati di analisi delle immagini. Fare clic su OK.
2. Analisi cellulare
   1. Maschera primaria
      1. In Impostazioni analisi, selezionare Tipo: Canale di analisi e rilevamento cellulare: ZProj[Tsf[Campo chiaro]] (pannello sinistro, al centro).
      2. Fare clic su Opzioni. Si aprirà la pagina Maschera primaria e conteggio . Nella casella Soglia , selezionare Auto e fare clic su Applica. Fare clic sulla casella Evidenzia oggetti (pannello di destra, in basso) per visualizzare gli oggetti all'interno della soglia designata. Modificare in base alle esigenze per includere gli oggetti di interesse.
         NOTA: Le impostazioni della soglia si basano sull'intensità dei pixel. Ad esempio, se la soglia è impostata su 5000, i pixel con un'intensità superiore a 5000 verranno inclusi nell'analisi.
      3. In Selezione oggetto, designare la dimensione minima e massima dell'oggetto (μm). Regolare se necessario per escludere detriti cellulari/singole cellule.
         NOTA: Le dimensioni del PDO possono variare in modo significativo tra i diversi modelli e tipi. Utilizzare lo strumento di misurazione nel software Gen5 per determinare le soglie minime e massime delle dimensioni PDO per ciascun modello. Gli utenti possono scegliere una soglia minima di dimensione della PDO inferiore rispetto al valore fornito dallo strumento di misurazione al fine di evitare l'esclusione di frammenti di PDO in momenti successivi al trattamento farmacologico.
      4. Per limitare l'analisi a una determinata area del pozzetto, deselezionate Analizza l'intera immagine e fate clic su Collega. Nella finestra Spina immagine , utilizzare il menu a discesa per selezionare Forma spina . Regolare i parametri di dimensione e posizione in base alle esigenze per adattarli all'area di interesse.
         NOTA: È importante massimizzare il numero di PDO all'interno della spina, escludendo al contempo le aree prive di PDO per ridurre al minimo lo sfondo. Designare una dimensione della spina che acquisisca in modo coerente la maggior parte degli oggetti di interesse tra le repliche. Generare un tappo che escluda anche i bordi della cupola è importante in quanto esclude tutti gli oggetti che possono apparire distorti a causa della rifrazione della luce dovuta all'estrema curvatura della cupola attorno ai bordi. È inoltre possibile deselezionare gli oggetti Includi bordo primario per acquisire solo interi PDO all'interno del connettore.
   2. Analisi delle sottopopolazioni. Un esempio di designazione delle sottopopolazioni è fornito nella Figura 3.
      1. Fare clic su Metriche calcolate nella barra degli strumenti Analisi cellulare. Fai clic su Seleziona o crea metriche di interesse a livello di oggetto (angolo destro, in basso). In Metriche oggetto disponibili, seleziona le metriche di interesse (ad esempio, la circolarità) e fai clic sul pulsante Inserisci. Fare clic su OK.
         NOTA: La morfologia e la densità di ciascun modello PDO determineranno le migliori metriche di interesse per distinguere la sottopopolazione.
      2. Fare clic su Analisi sottopopolazione nella barra degli strumenti Analisi cellulare . Fare clic su Aggiungi per creare una nuova sottopopolazione. Si aprirà una finestra pop-up.
      3. Se lo si desidera, immettere un nome per la sottopopolazione. In Metriche oggetto, selezionare una metrica di interesse e premere Aggiungi condizione. Nella finestra Modifica condizione , immettere i parametri per la metrica dell'oggetto scelta. Ripetere l'operazione con altre metriche, se necessario.
         NOTA: I parametri possono essere regolati manualmente o impostati utilizzando lo strumento di ricerca. Ad esempio, per escludere i detriti, gli utenti possono aggiungere Area come metrica oggetto e selezionare oggetti di dimensioni inferiori a 800. La circolarità come metrica dell'oggetto viene utilizzata abitualmente e tutti gli oggetti con una circolarità maggiore di 0,2-0,5 sono inclusi, a seconda del modello.
      4. Nella tabella nella parte inferiore della finestra, selezionare i risultati desiderati da visualizzare. Fare clic su OK > su Applica.
      5. Per visualizzare gli oggetti all'interno della sottopopolazione, utilizzare il menu a discesa Dettagli oggetto (pannello di destra, al centro) per selezionare la sottopopolazione. Gli oggetti che rientrano nei parametri verranno evidenziati nell'immagine.
         NOTA: Per modificare i colori di evidenziazione della maschera principale e della sottopopolazione, fare clic su Impostazioni (pannello di destra, in basso).
      6. Per regolare i parametri delle sottopopolazioni, riaprire la finestra Analisi sottopopolazione dalla barra degli strumenti Analisi cellulare . Selezionare la sottopopolazione e fare clic su Modifica. Fai clic su Aggiungi passaggio.
         NOTA: In questo modo si applicherà la stessa analisi a tutti i pozzetti all'interno dell'esperimento in tutti i punti temporali. Nel menu a discesa della pagina Matrice, è possibile selezionare diverse metriche per la visualizzazione individuale.

5. Esportazione di dati da Gen5 a Excel

1. Per personalizzare un file di dati per l'esportazione, selezionare l'icona Generatori di report/esportazioni nella barra degli strumenti. Nella finestra popup, fai clic su Nuova esportazione in Excel.
2. Nella pagina Proprietà della finestra popup, selezionare Scope > Plate e Contenuto > Personalizzato. Fare clic sull'opzione Contenuto nella barra degli strumenti. Fare clic su Modifica modello, che aprirà il programma Excel.
3. All'interno del foglio di calcolo, seleziona Componenti aggiuntivi > Tabella > dati pozzetto. Passare il puntatore del mouse sulle varie selezioni per visualizzare le opzioni per l'esportazione. Selezionare la metrica di interesse (ad esempio, Object Mean[ZProj[Tsf[TRITC]]]).
   NOTA: Il layout della piastra può essere aggiunto al modello di analisi del foglio di calcolo selezionando Componenti aggiuntivi > Riepilogo protocollo > Layout.
4. Si aprirà una finestra di modifica . Nella casella Pozzetti , designare i pozzetti per l'esportazione in base a Well-ID o Well #. Selezionare OK. Un modello verrà caricato nel file del foglio di calcolo. Chiudi il foglio di calcolo. Il modello viene salvato automaticamente.
5. Fare clic su OK nella finestra Nuova esportazione in Excel e chiudere la finestra Generatori di report/esportazioni .
6. Fare clic sull'icona Esporta nella barra degli strumenti Gen5. Seleziona la casella accanto al file di esportazione desiderato. Fare clic su OK. Gen5 popolerà automaticamente il modello di foglio di calcolo e aprirà il file in Excel.

6. Analisi dei dati esterni

1. Apri il file Esporta (.xlsx) in Excel.
2. Per ogni pozzetto, dividere ogni singolo valore per il valore del punto temporale 0:00 per quel pozzetto. Questo imposterà il punto temporale 0 uguale a 1 e ogni valore oltre sarà relativo alla lettura iniziale.
3. Aprire un nuovo file nel software di analisi dei dati. Selezionare l'opzione di layout XY .
   NOTA: In questo protocollo è stato utilizzato GraphPad Prism (versione 9.5.1).
4. Etichette di input per ogni gruppo di dati. Copiare e incollare i punti temporali e i valori normalizzati corrispondenti per ciascun gruppo di trattamento nella tabella Prisma. Verrà generato automaticamente un grafico per i dati, disponibile in Grafici.

Risultati

Il nostro obiettivo era quello di dimostrare la fattibilità dell'utilizzo dell'imaging multiplexato su cellule vive per valutare la risposta terapeutica della PDO. Gli esperimenti di prova di concetto sono stati eseguiti in due modelli PDO separati di cancro dell'endometrio: ONC-10817 e ONC-10811 (vedere la Figura supplementare 1 e la Figura supplementare 2 per i dati ONC-10811). L'apoptosi (colorazione con annessina V) e la citotossicità (assorbimento di Cytotox Green) sono state moni...

Discussione

Le colture di PDO stanno diventando un sistema modello in vitro sempre più popolare grazie alla loro capacità di riflettere le risposte e i comportamenti cellulari². Sono stati compiuti progressi significativi nella generazione, nella coltura e nelle tecniche di espansione della DOP, ma i metodi per analizzare le risposte terapeutiche sono rimasti indietro. I kit di vitalità 3D disponibili in commercio sono saggi di endpoint litico, che perdono dati di risposta cinetica potenzialmente preziosi ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrfuge tube	Dot Scientific Inc	1008113
15 mL conical centrifuge tube	Sarstedt	62.554.100
554 NM LED Cube	Agilent	1225012
96-well plate	Corning Costar	3596	Prewarmed to 37 °C
96-well plate	Agilent	204626-100	Prewarmed to 37 °C
A83-01	Tocris	2939	Final concentration is 500 nM (component of organoid culture media)
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634-010	component of organoid culture media
B27 Supplement	Gibco	17504044	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
BioTek BioSpa 8 Automated Incubator	Agilent	BIOSPAG-SN	Tabletop incubator; BioSpa OnDemand scheduling software comunicates with Gen5 to transfer plates between the BioSpa and the Cytation 5 for imaging (this protocol uses version 1.01.10)
BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader	Agilent	CYT5PW-SN	Plate reader; Gen5 software is used for this device (this protocol uses version 3.12.08)
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract	R&D Systems	BME001-10
Daunorubicin HCl	Sigma-Aldrich	S3035	Reconstituted in DMSO
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2438
EDTA (0.5 M)	Thermo Fisher	AM9260G
Forskolin	Tocris	1099	Final concentration is 10 µM (component of organoid culture media)
Glutamax	Gibco	35050-061	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Human EGF, Animal-Free Recombinant Protein	Gibco	AF-100-15-1MG	Final concentration is 0.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Human FGF-10 Recombinant Protein	Gibco	100-26-1MG	Final concentration is 10 ng/mL (component of organoid culture media)
Human R-Spondin 1 Recombinant Protein	Gibco	120-38-5UG	Final concentration is 250 ng/mL (component of organoid culture media)
Hydrocortisone Stock Solution	StemCell Technologies	7926	Final concentration is 500 ng/mL (component of organoid culture media)
Imaging Filter Cube- GFP	Agilent	1225101
Imaging Filter Cube- TRITC	Agilent	1225125
Imaging LED GFP/CFP	Agilent	1225001
Incucyte Annexin V Red Dye	Sartorius	4641	Reconstituted in organoid culture media
Incucyte Cytotox Green Dye	Sartorius	4633	DMSO solution
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A7250	Final concentration is 1.25 mM (component of organoid culture media)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining Solution	Fisher-Scientific	13366169	Add 1:50 volume
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Noggin	R&D Systems	6057-NG	Final concentration is 100 ng/mL (component of organoid culture media)
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Final concentration is 10 units/mL (component of organoid culture media)
Phosphate Buffered Saline (1x)	Gibco	14190-144
Primocin	InvivoGen	ant-pm-05	Final concentration is 100 µg/mL (component of organoid culture media)
Recombinant Human Heregulinβ-1	Pepro Tech	100-03	Final concentration is 37.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Staurosporine solution from Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	S6942
TrypLE Express	Life Technologies	12604013
Y-27632, CAS 331752-47-7	Sigma-Aldrich	688000	Final concentration is 5 µM (component of organoid culture media)
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	Final concentration is 100 nM (component of organoid culture media)