Kanserin Hasta Kaynaklı Organoid Modellerinde İlaç Yanıtları için Çoğullanmış Canlı Hücre Görüntüleme

Özet

Hasta kaynaklı tümör organoidleri, temel ve translasyonel araştırmalar için gelişmiş bir model sistemdir. Bu yöntem makalesi, farklı organoid fenotiplerin eşzamanlı kinetik değerlendirmesi için çoğullanmış floresan canlı hücre görüntülemenin kullanımını detaylandırmaktadır.

Özet

Hasta kaynaklı organoid (PDO) kanser modelleri, kanser hücre dizilerine kıyasla insan hastalıklarını daha iyi özetleyen çok işlevli bir araştırma sistemidir. PDO modelleri, hücre dışı bazal membran ekstraktlarında (BME) hasta tümör hücrelerinin kültürlenmesi ve üç boyutlu kubbeler olarak kaplanmasıyla oluşturulabilir. Bununla birlikte, tek katmanlı kültürlerde fenotipik testler için optimize edilmiş ticari olarak temin edilebilen reaktifler genellikle BME ile uyumlu değildir. Burada, otomatik bir canlı hücre görüntüleme sistemi kullanarak PDO modellerini plakalamak ve ilaç etkilerini değerlendirmek için bir yöntem açıklıyoruz. Ek olarak, hücre sağlığını ve apoptozu aynı anda ölçmek için kinetik ölçümlerle uyumlu floresan boyalar uyguluyoruz. Görüntü yakalama, birkaç gün boyunca düzenli zaman aralıklarında gerçekleşecek şekilde özelleştirilebilir. Kullanıcılar, tek tek Z-düzlemi görüntülerinde veya birden fazla odak düzleminden seri görüntülerin Z Projeksiyonunda ilaç etkilerini analiz edebilir. Maskeleme kullanılarak, PDO sayısı, alan ve floresan yoğunluğu gibi ilgilenilen belirli parametreler hesaplanır. Sitotoksik ajanların hücre sağlığı, apoptoz ve canlılık üzerindeki etkisini gösteren kavram kanıtı verileri sağlıyoruz. Bu otomatik kinetik görüntüleme platformu, PDO kanser modellerindeki çeşitli terapötik etkileri anlamak için diğer fenotipik okumalara genişletilebilir.

Giriş

Hasta kaynaklı tümör organoidleri (PDO'lar), kanser gelişimini ve terapötik yanıtları incelemek için sağlam bir model sistem olarak hızla ortaya çıkmaktadır. PDO'lar, primer tümörün karmaşık genomik profilini ve mimarisini özetleyen^üç boyutlu (3D) hücre kültürü sistemleridir ^1,2. Ölümsüzleştirilmiş kanser hücre hatlarının geleneksel iki boyutlu (2D) kültürlerinden farklı olarak, PDO'lar intratümöral heterojenliği yakalar ve korur ^3,4, bu da onları hem mekanik hem de translasyonel araştırmalar için değerli bir araç haline getirir. PDO'lar giderek daha p....

Protokol

İnsan tümör örneklerini kullanan çalışmalar, Iowa Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB), protokol #201809807 tarafından gözden geçirildi ve onaylandı ve 1964 Helsinki Deklarasyonu'nda ve daha sonraki değişikliklerinde belirtilen etik standartlara uygun olarak gerçekleştirildi. Çalışmaya katılan tüm deneklerden bilgilendirilmiş onam alındı. Dahil edilme kriterleri, kanser teşhisini ve tümör örneklerinin mevcudiyetini içerir.

1. Sağlam PDO'ların 96 oyuklu bir plakada kaplanması

1. Reaktifleri hazırlayın.
   1. 96 oyuklu plakaları gece boyunca 37 °C'de önceden ısıtın ve BME'yi gece boyunca 4 °C'de çözdürün.
   ....

Tartışmalar

PDO kültürleri, hücresel tepkileri ve davranışları yansıtma yetenekleri nedeniyle giderek daha popüler bir in vitro model sistemi haline gelmektedir². PDO üretimi, kültürü ve genişletme tekniklerinde önemli ilerlemeler kaydedilmiştir, ancak terapötik yanıtları analiz etme yöntemleri gecikmiştir. Ticari olarak temin edilebilen 3D canlılık kitleri, potansiyel olarak değerli kinetik yanıt verilerini kaçıran ve sonraki analizleri diğer yöntemlerle sınırlayan

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrfuge tube	Dot Scientific Inc	1008113
15 mL conical centrifuge tube	Sarstedt	62.554.100
554 NM LED Cube	Agilent	1225012
96-well plate	Corning Costar	3596	Prewarmed to 37 °C
96-well plate	Agilent	204626-100	Prewarmed to 37 °C
A83-01	Tocris	2939	Final concentration is 500 nM (component of organoid culture media)
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634-010	component of organoid culture media
B27 Supplement	Gibco	17504044	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
BioTek BioSpa 8 Automated Incubator	Agilent	BIOSPAG-SN	Tabletop incubator; BioSpa OnDemand scheduling software comunicates with Gen5 to transfer plates between the BioSpa and the Cytation 5 for imaging (this protocol uses version 1.01.10)
BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader	Agilent	CYT5PW-SN	Plate reader; Gen5 software is used for this device (this protocol uses version 3.12.08)
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract	R&D Systems	BME001-10
Daunorubicin HCl	Sigma-Aldrich	S3035	Reconstituted in DMSO
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2438
EDTA (0.5 M)	Thermo Fisher	AM9260G
Forskolin	Tocris	1099	Final concentration is 10 µM (component of organoid culture media)
Glutamax	Gibco	35050-061	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Human EGF, Animal-Free Recombinant Protein	Gibco	AF-100-15-1MG	Final concentration is 0.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Human FGF-10 Recombinant Protein	Gibco	100-26-1MG	Final concentration is 10 ng/mL (component of organoid culture media)
Human R-Spondin 1 Recombinant Protein	Gibco	120-38-5UG	Final concentration is 250 ng/mL (component of organoid culture media)
Hydrocortisone Stock Solution	StemCell Technologies	7926	Final concentration is 500 ng/mL (component of organoid culture media)
Imaging Filter Cube- GFP	Agilent	1225101
Imaging Filter Cube- TRITC	Agilent	1225125
Imaging LED GFP/CFP	Agilent	1225001
Incucyte Annexin V Red Dye	Sartorius	4641	Reconstituted in organoid culture media
Incucyte Cytotox Green Dye	Sartorius	4633	DMSO solution
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A7250	Final concentration is 1.25 mM (component of organoid culture media)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining Solution	Fisher-Scientific	13366169	Add 1:50 volume
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Noggin	R&D Systems	6057-NG	Final concentration is 100 ng/mL (component of organoid culture media)
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Final concentration is 10 units/mL (component of organoid culture media)
Phosphate Buffered Saline (1x)	Gibco	14190-144
Primocin	InvivoGen	ant-pm-05	Final concentration is 100 µg/mL (component of organoid culture media)
Recombinant Human Heregulinβ-1	Pepro Tech	100-03	Final concentration is 37.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Staurosporine solution from Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	S6942
TrypLE Express	Life Technologies	12604013
Y-27632, CAS 331752-47-7	Sigma-Aldrich	688000	Final concentration is 5 µM (component of organoid culture media)
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	Final concentration is 100 nM (component of organoid culture media)