הדמיה מרובת תאים חיים לתגובות תרופתיות במודלים אורגנואידים שמקורם בחולה של סרטן

Summary

אורגנואידים סרטניים שמקורם בחולה הם מערכת מודל מתוחכמת למחקר בסיסי ותרגומי. מאמר שיטות זה מפרט את השימוש בדימות תאים חיים פלואורסצנטיים מרובים להערכה קינטית בו זמנית של פנוטיפים אורגנואידים שונים.

Abstract

מודלים אורגנואידים הנגזרים ממטופל (PDO) של סרטן הם מערכת מחקר רב-תכליתית המשחזרת טוב יותר מחלות אנושיות בהשוואה לשורות תאים סרטניים. מודלים של PDO יכולים להיווצר על ידי תרבית תאי גידול של חולים בתמציות קרום מרתף חוץ-תאיות (BME) וציפוים ככיפות תלת-ממדיות. עם זאת, ריאגנטים זמינים מסחרית אשר עברו אופטימיזציה עבור בדיקות פנוטיפיות בתרבויות monolayer לעתים קרובות אינם תואמים BME. במאמר זה, אנו מתארים שיטה להצלחת מודלים של PDO ולהערכת השפעות של תרופות באמצעות מערכת הדמיה אוטומטית של תאים חיים. בנוסף, אנו מיישמים צבעים פלואורסצנטיים התואמים למדידות קינטיות כדי לכמת את בריאות התא ואת האפופטוזיס בו זמנית. ניתן להתאים אישית לכידת תמונה כך שתתרחש במרווחי זמן קבועים במשך מספר ימים. משתמשים יכולים לנתח השפעות של סמים בתמונות בודדות של מישור Z או הקרנת Z של תמונות טוריות ממישורי מוקד מרובים. באמצעות מיסוך מחושבים פרמטרים ספציפיים של עניין, כגון מספר PDO, שטח ועוצמת פלואורסצנטיות. אנו מספקים נתוני הוכחת היתכנות המדגימים את ההשפעה של חומרים ציטוטוקסיים על בריאות התא, אפופטוזיס וכדאיות. ניתן להרחיב פלטפורמת הדמיה קינטית אוטומטית זו לקריאות פנוטיפיות אחרות כדי להבין השפעות טיפוליות מגוונות במודלים של סרטן PDO.

Introduction

אורגנואידים סרטניים שמקורם בחולה (PDOs) מתפתחים במהירות כמערכת מודל חזקה לחקר התפתחות סרטן ותגובות טיפוליות. PDOs הן מערכות תרבית תאים תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) המשחזרות את הפרופיל הגנומי המורכב ואת הארכיטקטורה של הגידול הראשוני ^1,2. שלא כמו תרביות דו-ממדיות מסורתיות (2D) של קווי תאים סרטניים אימורטליים, PDOs לוכדים ושומרים על הטרוגניות תוך-גידולית ^3,4, מה שהופך אותם לכלי רב ערך הן למחקר מכניסטי והן למחקר תרגומי. למרות ש-PDOs הופכים למערכת מודל פופולרית יותר ויותר, ריאגנטים זמינים מסחרית ושיטות ניתוח עבור אפקטים תאיים התואמים לתרביות PDO מוגבלים.

היעדר שיטות חזקות לניתוח שינויים עדינים בתגובה לטיפול מעכב תרגום קליני. מגיב בריאות התא תקן הזהב בתרביות תלת-ממד, CellTiter-Glo 3D, משתמש ברמות ATP כגורם הקובע את כדאיות התא ^5,6. בעוד מגיב זה שימושי עבור בדיקות נקודות קצה, ישנם מספר אזהרות, בעיקר חוסר היכולת להשתמש בדגימות למטרות אחרות לאחר השלמת הבדיקה.

דימות תאים חיים הוא צורה מתוחכמת של מיקרוסקופ קינטי אשר, בשילוב עם ריאגנטים פלואורסצנטיים, יש לו את היכולת לכמת מגוון של קריאות בריאות התא בתוך מודלים PDO, כולל אפופטוזיס ^7,8,9 וציטוטוקסיות¹⁰. ואכן, הדמיה של תאים חיים הייתה חלק בלתי נפרד מסינון בתפוקה גבוהה של תרכובות בפלטפורמות דו-ממדיות^11,12. מערכות כגון Incucyte הפכו את הטכנולוגיה לזולה ולכן נגישה לקבוצות מחקר במגוון מסגרות. עם זאת, היישום של מערכות אלה לניתוח תרבויות תלת ממדיות עדיין בחיתוליו.

במאמר זה אנו מתארים שיטה להערכת תגובת תרופות במודלים של סרטן PDO באמצעות הדמיה מרובת תאים חיים (איור 1). באמצעות ניתוח של תמונות שדה בהירות, ניתן לנטר באופן קינטי שינויים בגודל PDO ובמורפולוגיה. יתר על כן, תהליכים תאיים יכולים להיות מכומתים בו זמנית לאורך זמן באמצעות ריאגנטים פלואורסצנטיים, כגון Annexin V Red Dye עבור אפופטוזיס ו Cytotox Green Dye עבור ציטוטוקסיות. השיטות המוצגות מותאמות למערכת ההדמיה Cytation 5 של תאים חיים, אך פרוטוקול זה עשוי להיות מותאם על פני פלטפורמות דימות שונות של תאים חיים.

Protocol

מחקרים המשתמשים בדגימות גידול אנושי נבדקו ואושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת איווה (IRB), פרוטוקול #201809807, ובוצעו בהתאם לסטנדרטים האתיים כפי שנקבעו בהצהרת הלסינקי משנת 1964 ותיקוניה המאוחרים יותר. הסכמה מדעת התקבלה מכל הנבדקים שהשתתפו במחקר. קריטריוני ההכללה כוללים אבחנה של סרטן וזמינות של דגימות גידול.

1. ציפוי PDO שלם בצלחת 96 בארות

1. הכינו ריאגנטים.
   1. מחממים מראש צלחות 96 באר ב 37 ° C לילה להפשיר BME לילה ב 4 ° C.
   2. הכינו מדיה מלאה של תרבית אורגנואידים המותאמת לטיפוח סוג הסרטן המעניין. אמצעי תרבות ספציפיים המשמשים לניסויים המוצגים כאן מובאים בטבלה משלימה 1.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך לשנות רכיבי מדיה עבור סוגי גידולים שונים. לדוגמה, מדיה תרבית אורגנואידים הוא בתוספת 100 ננומטר אסטרדיול עבור גידולים גינקולוגיים¹³. מדיה מוכנה יציבה ב 4 °C (75 °F) למשך חודש אחד. לאחסון לטווח ארוך, aliquot את המדיה לתוך צינורות 50 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C.
2. הכינו שני aliquots נפרדים של מדיה תרבית אורגנואיד ב 4 ° C ו 37 ° C. לדוגמה, אם 60 בארות מצופות בצלחת של 96 בארות, השתמש ב- 6 מ"ל של מדיה תרבית אורגנואידים חמה ו- 150 מיקרוליטר של מדיה של תרבית אורגנואידים קרה כקרח.
3. הכינו חיץ שטיפה אורגנואידי: יש להוסיף PBS אחד עם 10 mM HEPES, 1x Glutamax, 5 mM EDTA ו-10 μM Y-27632. יש לאחסן ב-4°C
4. קצרו PDOs בתרבית בצלחת של 24 בארות. בצעו את כל השלבים על קרח או בטמפרטורה של 4°C, אלא אם כן נאמר אחרת.
   1. שאפו מדיה מכל באר באמצעות מערכת קווי ואקום.
   2. הוסף 500 μL של חיץ שטיפת אורגנואידים קר כקרח ופיפטה עדינה 2-3x באמצעות פיפטור 1000 μL. דוגרים על הצלחת על קרח במשך 10 דקות.
   3. מעבירים את תכולת כל באר לצינור חרוטי של 50 מ"ל. כדי להבטיח שכל ה-PDOs נמצאים בהשעיה, שטפו כל באר ב-300 μL נוספים של חיץ שטיפה אורגנואידי והעבירו לצינור החרוטי של 50 מ"ל. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-350 x גרם ב-4°C
   4. שאפו את הסופרנאטנט מכדורית BME/אורגנואיד באמצעות מערכת קווי ואקום, והשאירו ~ 5 מ"ל שנותרו בצינור. הוסף 20 מ"ל של חיץ שטיפה אורגנואיד והשהה מחדש בעדינות את הגלולה באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל. דוגרים על קרח במשך 10 דקות.
   5. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 350 x גרם ב 4 ° C. שאפו את הסופרנאטנט עם מערכת קווי ואקום, תוך הקפדה שלא לשבש את גלולת ה-PDO.
5. ציפוי PDO בצלחת של 96 בארות: בצעו את כל השלבים על קרח אלא אם כן צוין אחרת.
   1. השהה מחדש את גלולת ה-PDO בכמות מתאימה של תרבית אורגנואידים קרה כקרח כדי ליצור מתלה PDO. העבר את מתלה PDO לצינור מיקרוצנטריפוגה קר כקרח של 1.5 מ"ל.
      הערה: כדי לחשב את כמות מדיית התרבית האורגנואידית, קבע את מספר הבארות שיש לצפות בצלחת של 96 בארות, תוך התחשבות בכך ש- PDO מצופים בכיפה של 5 μL ביחס של 1:1 של מדיה של תרבית אורגנואידים ו- BME. לדוגמה, כאשר מצפים צלחת אחת של 96 בארות ומשתמשים רק ב-60 הבארות הפנימיות, הסכום הכולל של מתלה PDO הדרוש יהיה 300 μL: 150 μL מדיה של תרבית אורגנואידים ו-150 μL BME. עבור מודלים המציגים צמיחה אופטימלית באחוזים שונים של BME, היחס בין BME: מדיה עשוי להשתנות בשלב זה, אם כי חשוב לתקנן את היחס בכל הבדיקות עבור כל מודל ספציפי. כדי להתחשב בשגיאת צנרת, הוסף 10% אמצעי אחסון לכל רכיב.
   2. ספור את מספר PDOs.
      1. העבר 2.5 μL של תרחיף PDO לצינור מיקרוצנטריפוגה קר כקרח של 1.5 מ"ל וערבב עם 2.5 μL של BME. העבירו את תערובת 5 μL למגלשת מיקרוסקופ זכוכית נקייה. אל תכסה את המגלשה. התערובת תתמצק לכיפה.
      2. דמיינו זאת באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר במהירות של 4x. לספור את מספר PDOs בתערובת 5 μL; המטרה היא שיהיו בערך 25-50 PDOs לכל 5 μL כיפה.
         הערה: אם הצפיפות הרצויה אינה מושגת בתערובת הבדיקה, התאם את הנפח הסופי של מתלה ה-PDO על-ידי הוספת מדיה נוספת של תרבית אורגנואידים או צנטריפוגה של מתלה ה-PDO והשעיה מחדש של כדורית ה-PDO בנפח נמוך יותר של מדיית תרבית אורגנואידים קרה כקרח. ללא קשר לאופן שבו מתלי PDO משתנים בשלב זה, היחס הסופי של BME: השעיית PDO בשלב 1.5.3. צריך להיות 1:1.
   3. באמצעות פיפטור של 200 μL עם קצוות רחבים, ערבבו בזהירות מתלי PDO עם כמות שווה של BME כדי להשיג יחס של 1:1 בין מדיה של תרבית אורגנואידים ל-BME. הימנעו מבועות, אשר ישבשו את שלמות הכיפות.
   4. באמצעות פיפטור 20 μL, זרע 5 μL כיפות למרכז כל באר של צלחת 96 בארות שחוממה מראש, זורע רק את 60 הבארות הפנימיות. כדי להבטיח חלוקה שווה של PDOs, מעת לעת pipet התוכן של צינור 1.5 מ"ל עם pipettor 200 μL עם קצוות רחבים.
   5. לאחר שכל הבארות נזרעו, מניחים את המכסה על הצלחת והופכים בעדינות. דגרו על הצלחת ההפוכה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות באינקובטור תרביות הרקמה כדי לאפשר לכיפות להתמצק.
      הערה: היפוך הצלחת מבטיח שכיפת המדיה של תרבית BME/אורגנואידים שומרת על המבנה התלת-ממדי כדי לספק מספיק מקום להיווצרות PDO.
   6. הופכים את הצלחת כך שהיא יושבת עם המכסה למעלה ודגרים במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.

2. טיפולים והוספת צבעים פלואורסצנטיים לריבוב

1. בעוד כיפות BME מתמצקות בלוחות 96 בארות, הכינו דילולים של ריאגנטים של הדמיה של תאים חיים פלואורסצנטיים. פרמטרים ספציפיים לריבוב Annexin V Red Dye ו- Cytotox Green Dye ניתנים כאן.
2. הכנת ריאגנט פלואורסצנטי (יום -1): חשב את הנפח המתאים של מדיה תרבית אורגנואידית בהתבסס על מספר הבארות שיש לטפל, בהנחה שכל באר תטופל עם 100 μL של מדיה במינון צבע. יש לדלל את הצבע בתרבית אורגנואידים שחוממה מראש לריכוז הרצוי.
   הערה: כמות המדיה הכוללת הדרושה תשתנה בהתאם לניסוי. הוסף 10% לאמצעי האחסון הסופי כדי להתחשב בשגיאת צנרת. לדוגמה, כדי לטפל ב-60 הבארות הפנימיות של צלחת בת 96 בארות, הכינו 6.6 מ"ל של מדיה במינון צבע (טבלה 1).
3. טפל בכל באר עם 100 μL של 2x מצע תרבית אורגנואידים במינון צבע. הוסף 200 μL של סטרילי 1x PBS לבארות הריקות החיצוניות של הצלחת. לדגור ב 37 °C (77 °F) במשך הלילה.
   הערה: PBS בבארות ההיקפיות מקטין את אידוי המדיה מהבארות הפנימיות.
4. הוספת תרופות/חומרי טיפול (יום 0): הכינו תרופות בתרבית אורגנואידים שחוממה מראש בריכוז של פי 2 בנפח של 100 מיקרוליטר לבאר.
   הערה: DMSO יכול להיות רעיל לתאים בריכוזים גבוהים. ריכוז של 0.1% DMSO אינו עולה על הניסויים שבוצעו במחקר זה. בנוסף לתרופות, כמה ריאגנטים פלואורסצנטיים מופצים כפתרון DMSO. חשוב לקחת בחשבון את ריכוז DMSO הכולל בעת עבודה עם ריאגנטים כאלה.
5. הוסף 100 μL של מדיה 2x מינון צבע לכל באר; הימנעו מיצירת בועות.

3. הגדרת פרמטרי הדמיה

1. מניחים את הצלחת בציטציה 5. פתוח תוכנת Gen5. לחץ על New Task > Imager Manual Mode. בחר לכוד כעת והזן את ההגדרות הבאות: מטרה (בחר הגדלה רצויה); מסנן (בחר microplate); פורמט Microplate (בחר מספר בארות); וסוג כלי (בחר סוג לוחית). לחצו על 'השתמש במכסה ' ועל 'השתמש במהירות ספק איטית יותר'. לחץ על אישור.
   הערה: סוג כלי: היה ספציפי ככל האפשר בעת בחירת מידע על הצלחת מכיוון שהתוכנה מכויילת למרחק הספציפי מהמטרה לתחתית הצלחת עבור כל סוג צלחת ועובי הפלסטיק.
   מהירות נשא איטית יותר: בחר תיבה זו כדי למנוע הפרעה לכיפות בעת טעינה/פריקה של לוחות.
2. צור Z-Stack שיצלם את כל כיפת BME.
   1. בחר באר מעניינת לצפייה (פאנל שמאלי, מתחת להיסטוגרמה).
   2. בחר בערוץ Bright Field (החלונית השמאלית, העליונה). לחץ על חשיפה אוטומטית והתאם הגדרות לפי הצורך.
   3. הגדר את החלק התחתון והעליון של הכרטיסיה Z-Stack: הרחב את הכרטיסיה 'מצב הדמיה ' (לוח שמאלי, אמצעי). סמן את התיבה Z-Stack . באמצעות חיצי התאמת המסלול (לוח שמאלי, אמצעי), לחץ על ההתאמה למטה עד שכל ה- PDO ייכנסו לתוקף ולאחר מכן יצאו מהמיקוד ויהיו מטושטשים. הגדר זאת כתחתית Z-Stack. חזור על הפעולה בכיוון ההפוך באמצעות חיצי התאמת המסלול כדי לקבוע את החלק העליון של מחסנית Z.
   4. כדי לוודא שהגדרות Z-Stack מתאימות לבארות מעניינות אחרות, בחר באר אחרת (לוח שמאלי, מתחת להיסטוגרמה) והצג באופן חזותי את החלק העליון והתחתון של Z-Stack.
   5. להזנה ידנית של מיקומי המוקד, לחצו על שלוש הנקודות שליד ההתאמה העדינה (החלונית השמאלית, העליונה). ייפתח חלון; הקלד בערך Z-Stack העליון (נמצא בחלונית השמאלית, במרכז, תחת מצב הדמיה). חזור על הפעולה עבור ערך Z-Stack התחתון. התאם לפי הצורך כדי ללכוד את טווח Z הרצוי על ידי חזרה על שלב 3.2.3. אם היה צורך בהתאמות, בחר באר אחרת כדי לאמת הגדרות.
3. קבעו את הגדרות החשיפה לתעלות הפלואורסצנטיות. ההגדרות מתוארות עבור שני ערוצים פלואורסצנטיים (GFP ו- TRITC). המספר הספציפי של תעלות פלואורסצנטיות יהיה תלוי בניסוי ואילו קוביות פלואורסצנטיות יותקנו במערכת הדמיה של תאים חיים.
   הערה: אם עוצמת האות צפויה להיות גבוהה משמעותית בסוף הניסוי, על המשתמשים לשקול לבצע ניסויי בדיקה כדי לקבוע את הגדרות החשיפה האופטימליות בסוף הניסוי שניתן ליישם בעת הגדרת הפרמטרים הראשוניים.
   1. הרחיבו את הכרטיסייה 'מצב הדמיה ' (החלונית השמאלית, האמצעית) ופתחו את 'עריכת שלב הדמיה'. יופיע חלון מוקפץ.
   2. תחת ערוצים, לחץ על הבועה עבור מספר הערוצים הרצוי. הקצו ערוץ אחד לשדה בהיר וערוצים נוספים לכל ערוץ פלואורסצנטי. בדוגמה זו, ערוץ 1 = שדה בהיר; ערוץ 2 = GFP; ערוץ 3 = TRITC. באמצעות התפריטים הנפתחים צבע , בחר את ההגדרה המתאימה לכל ערוץ. סגור את חלון העריכה על-ידי לחיצה על אישור.
   3. הגדר כל ערוץ פלורסנט.
      1. העבר את הערוץ ל- GFP (לוח שמאלי, למעלה).
      2. לחץ על חשיפה אוטומטית (החלונית השמאלית, למעלה). הרחב את הכרטיסיה חשיפה (חלונית שמאלית, אמצעית) וכוונן את הגדרות החשיפה כדי למזער את אות הרקע.
      3. העתק את הגדרות החשיפה לכרטיסייה מצב תמונה לפי השלבים 3.3.3.3-3.3.6.
      4. לחץ על העתק סמל לצד התיבה ערוך שלב הדמיה . לחץ על ערוך שלב הדמיה, שיפתח חלון אחר.
      5. תחת ערוץ GFP, לחץ על סמל הלוח בשורה חשיפה כדי להוסיף את ההגדרות 'תאורה', 'זמן שילוב' ו'רווח מצלמה ' לערוץ.
      6. חזור על שלבים 3.3.3.4-3.3.3.5 עבור ערוץ TRITC. לחץ על אישור כדי לסגור את החלון.
4. הגדירו את שלבי עיבוד התמונה המקדים והקרנת Z כדי להפוך את עיבוד התמונה המקדים לאוטומטי.
   1. לחץ על סמל המצלמה (פאנל שמאלי, פינה תחתונה). ייפתח חלון חדש.
   2. תחת Add Processing Step (החלונית השמאלית, התחתונה), לחץ על Image Preprocessing. ייפתח חלון חדש.
   3. בכרטיסיה שדה בהיר , בטל את הבחירה באפשרות החל עיבוד מקדים של תמונה.
   4. לכל כרטיסייה 'ערוץ פלואורסצנטי ', ודאו שהאפשרות 'החל עיבוד מקדים של תמונה ' נבחרה. בטלו את הבחירה באפשרות 'השתמש באותן אפשרויות כמו ערוץ 1 ' ולחצו על הלחצן 'אשר'. החלון ייסגר.
   5. תחת הוסף שלב עיבוד, לחץ על Z Projection. ייפתח חלון חדש. אם תרצה, התאימו את טווח הפרוסה (לדוגמה, כדי לצמצם את טווח Z). סגור את החלון על-ידי בחירה באפשרות אישור.
5. צור פרוטוקול.
   1. לחץ על Image Set בסרגל הכלים. בתפריט הנפתח, לחץ על צור ניסוי מתוך ערכת תמונות זו. חלון ההדמיה ייסגר וחלון ההליך ייפתח.
      הערה: הפרמטרים שנבחרו במצב Imager Manual ייטענו אוטומטית בחלון החדש, כך שניתן יהיה ליצור פרוטוקול ניסיוני.
   2. הגדרת הטמפרטורה ומעבר הצבע: לחץ/י על ״הגדר טמפרטורה״ תחת הכותרת ״פעולות״ (משמאל). ייפתח חלון חדש. בחר אינקובטור מופעל והזן ידנית את הטמפרטורה הרצויה תחת טמפרטורה. לאחר מכן, תחת הדרגתי, הזן ידנית 1. סגור את החלון על-ידי בחירה באפשרות אישור.
      הערה: יצירת שיפוע של 1°C תמנע היווצרות עיבוי על מכסה הצלחת.
   3. ייעד בארות לתמונה.
      1. לחץ פעמיים על שלב התמונה תחת תיאור. לחץ על צלחת מלאה (פינה ימנית, למעלה). פעולה זו תפתח את החלון פריסת לוחות .
      2. הדגש בארות עניין באמצעות הסמן. לחץ על אישור. אם תרצה, סמן את התיבות Autofocus Binning ו - Capture Binning . לחץ על אישור כדי לסגור את החלון.
         הערה: Binning ידרוש התאמת חשיפה, כמתואר בשלב 3.3.3.2 לעיל. עיין בסעיף דיון לקבלת תרחישים ספציפיים שבהם ניתן להשתמש בתכונה זו.
   4. הגדר מרווחי זמן עבור הדמיה קינטית.
      1. לחץ על אפשרויות תחת הכותרת אחר (משמאל). סמן את התיבה הליך קינטי לא רציף .
      2. תחת זמן כולל משוער, הזן את זמן הריצה של הניסוי (לדוגמה, 5 ימים). תחת מרווח זמן משוער, הזן את מרווח הזמן כדי לצלם את הלוח (לדוגמה, כל 6 שעות).
      3. לחץ על השהה לאחר כל ריצה כדי לאפשר זמן להעברת הצלחת לאינקובטור. סגור את החלון על-ידי בחירה באפשרות אישור.
   5. עדכן שלבים להפחתת נתונים.
      1. לחץ על אישור כדי לסגור את חלון הפרוצדורה. תיפתח כרטיסייה לעדכון שלבי הפחתת הנתונים. בחר כן. לחץ פעמיים על עיבוד מקדים של תמונה. לחץ בין הערוצים השונים כדי לאמת את ההגדרות ולחץ על אישור.
      2. לחץ פעמיים על Z Projection. לחץ בין הערוצים השונים כדי לאמת הגדרות. לחץ על אישור. לאחר מכן, לחץ שוב על אישור כדי לסגור את חלון הפחתת הנתונים.
   6. עצב את פריסת הלוחות.
      1. פתח את אשף פריסת הלוחות והקצה סוגי בארות לפי שלבים 3.6.2-3.6.3.
      2. לחץ על סמל פריסת לוחות בסרגל הכלים (פינה שמאלית, למעלה) כדי לפתוח את אשף פריסת הלוחות.
      3. סמן את התיבות לצד סוגי הבארות ששימשו בניסוי. תחת פקדי Assay, הזן את מספר סוגי הפקדים השונים באמצעות החצים. לחץ על הבא כדי לפתוח את החלון Assay Control #1 .
      4. הגדר תנאי באר של פקד assay לפי שלבים 3.6.5-3.6.8.
      5. בחלון Assay Control #1, הזן את תווית הפקד בתיבה מזהה פריסת לוחית . אם תרצה, הזן את השם המלא בתיבה הסמוכה. בחר את מספר העותקים המשוכפלים עבור תנאי הבקרה המתאים באמצעות החצים.
      6. אם אתה משתמש בריכוזים מרובים או בסדרת דילול בתוך הפקד, לחץ על הגדר דילולים/ריכוזים והשתמש בתפריט הנפתח כדי לבחור את סוג. הזן ערכים לכל ריכוז/דילול בטבלה.
         הערה: ניתן להשתמש בפונקציה האוטומטית אם הריכוזים משתנים בהפרש קבוע.
      7. בחר בכרטיסיה צבע בסרגל הכלים. בחר צבע טקסט וצבע רקע רצויים לשליטה בתפריט הנפתח. לחץ על הבא.
      8. חזור על הפעולה לפי הצורך באמצעות פקדים נוספים.
      9. הגדר תנאי באר לדוגמה לפי 3.6.10-3.6.12.
      10. בדף Sample Setup , הזן את קידומת מזהה הדוגמה (לדוגמה, SPL). בחר את מספר העותקים המשוכפלים באמצעות החצים. אם אתה משתמש בדגימות עם ריכוזי טיפול משתנים, בחר ריכוזים או דילולים בתפריט הנפתח סוג . הזן דילולים/ריכוזים בטבלה והזן יחידות בתיבה יחידה .
      11. בחר שדות זיהוי בסרגל הכלים. הזן את שמות הקטגוריות הרצויים (לדוגמה, מזהה מדגם, תרופה) בטבלה.
      12. בחר בכרטיסיה צבע בסרגל הכלים. בחר צבע שונה לכל קבוצת טיפול/דגימה. לחץ על סיום. פעולה זו תפתח את הדף פריסת לוחות.
          הערה: המספרים בצד שמאל תואמים למספרי המדגם השונים.
      13. הקצה מזהים לדוגמה לפי שלבים 3.6.14-3.6.16.
      14. בחר SPL1 מהפאנל השמאלי. השתמש בסמן כדי לבחור בארות.
          הערה: ניתן לכוונן כלי בחירה אוטומטית בתיבת ההקצאה הטורית. ניתן להגדיר מראש את מספר העותקים המשוכפלים והכיוון של הפריסה.
      15. חזור על הפעולה עם דוגמאות אחרות כדי להשלים את פריסת הלוחות. לאחר שביעות רצון, לחץ על אישור.
      16. בסרגל הכלים קובץ , בחר מזהים לדוגמה. מלא עמודות מזהה לדוגמה עם המידע המתאים עבור כל דגימה (לדוגמה, סוג תרופה). לחץ על אישור.
   7. שמור את הפרוטוקול.
      1. בסרגל הכלים, לחץ על File > Save Protocol as. בחר את המיקום לשמירת הקובץ. הזן שם קובץ. לחץ על שמור כדי לסגור את החלון.
      2. לחץ על File > Exit בסרגל הכלים. כרטיסייה תיפתח כדי לשמור שינויים במצב Imager ידני. בחר לא.
      3. תיפתח כרטיסייה לשמירת שינויים בניסוי 1. בחר לא. תיפתח כרטיסייה לעדכון הגדרת הפרוטוקול. בחר עדכן. סגור את התוכנה.
6. ייבא את הפרוטוקול לתוך BioSpa OnDemand וסיים את הגדרת הניסוי.
   1. פתח את תוכנת BioSpa OnDemand (תוכנת תזמון).
   2. בחר חריץ זמין בתוכנה.
   3. הסר את הצלחת ממערכת ההדמיה של תאים חיים. לחץ על פתח מגירה כדי לגשת לחריץ המתאים בתוכנת התזמון והכנס את הצלחת. לחץ על סגור מגירה.
      הערה: ניתן לבצע שלב זה בכל שלב לאחר יצירת הפרוטוקול בשלב 3.5.7 לעיל. עם זאת, הצלחת חייבת להיות ב- Cytation 5 כדי לבצע ריצת תזמון בשלב 3.6.4.3 להלן.
   4. ייבא את הפרוטוקול.
      1. תחת הכרטיסיה פרטי הליך , בחר משתמש בתפריט הנפתח. לצד חריץ הפרוטוקול , לחץ על בחר > הוסף ערך חדש.
      2. לצד חריץ הפרוטוקול, לחץ על בחר. פעולה זו תפתח חלון חדש כדי לנווט לפרוטוקול הרצוי בארכיטקטורת הקבצים. לחץ על פתח כדי לייבא את הפרוטוקול לתוכנת התזמון.
      3. הזן את משך הזמן הדרוש לתמונת הצלחת. לחץ על אישור כדי לסגור את החלון Gen5 Protocol List .
         הערה: שלב זה חשוב במיוחד בעת הפעלת מספר ניסויים בו זמנית. כדי לקבוע את הזמן הדרוש לתמונה, לחץ על בצע הפעלת תזמון כעת. לחץ על אישור.
   5. קבעו מרווחי הדמיה ותזמנו את הניסוי.
      1. תחת מרווח, הזן את מרווח הזמן להדמיה שצוין בשלב 3.5.4.
      2. תחת אפשרויות שעת התחלה, בחר כאשר זמין. תחת משך, בחר קבוע או רציף.
         הערה: ניתן לקבוע זמן התחלה ספציפי במקום להפעיל את הפרוטוקול בזמן הזמין הבא. בחירה באפשרות משך קבוע תגדיר נקודת קצה ספציפית לניסוי ותחייב את המשתמש להקצות מסגרת זמן לניסוי. משך רציף יאפשר לניסוי לפעול ללא נקודת קצה וניתן לסיים אותו רק על ידי משתמש שיפסיק את הניסוי.
      3. לחץ על לוח זמנים/כלי. פעולה זו תפתח את רצף אימות הלוחות. כרטיסייה תיפתח עם זמן הקריאה הראשונה המוצע. לחץ על כן כדי לקבל לוח זמנים זה.

4. ניתוח תמונות בתוכנת Gen5 (איור 2)

1. מודול ניתוח תמונה פתוחה.
   1. פתח את דור 5. במנהל המשימות, בחר ניסויים > פתוח. בחר את הניסוי כדי לפתוח את הקובץ. לחץ על Plate > View בסרגל הכלים.
   2. שנה את התפריט הנפתח נתונים ל - Z Projection. לחץ פעמיים על באר של עניין. בחר נתח > ברצוני להגדיר שלב חדש להפחתת נתוני ניתוח תמונות. לחץ על אישור.
2. אנליזה תאית
   1. מסיכה ראשית
      1. תחת הגדרות ניתוח, בחר סוג: ערוץ ניתוח וזיהוי תאים: ZProj[Tsf[שדה בהיר]] (לוח שמאלי, מרכז).
      2. לחץ על אפשרויות. פעולה זו תפתח את הדף מסיכה וספירה ראשיות . בתיבה סף , סמן את אוטומטי ולחץ על החל. לחצו על התיבה 'סימון עצמים ' (החלונית הימנית, התחתונה) כדי להציג עצמים בתוך הסף המיועד. התאם לפי הצורך כדי לכלול אובייקטים מעניינים.
         הערה: הגדרות הסף מבוססות על עוצמת הפיקסלים. לדוגמה, אם הסף מוגדר על 5000, פיקסלים בעוצמה גדולה מ- 5000 ייכללו בניתוח.
      3. תחת בחירת אובייקט, הגדר את גודל האובייקט המינימלי והמרבי (μm). התאימו לפי הצורך כדי לא לכלול פסולת תאית/תאים בודדים.
         הערה: גודל PDO עשוי להשתנות באופן משמעותי בין דגמים וסוגים שונים. השתמש בכלי המדידה בתוכנת Gen5 כדי לקבוע את ערכי הסף המינימליים והמרביים של גודל PDO עבור כל דגם. משתמשים יכולים לבחור סף גודל PDO מינימלי קטן יותר ביחס לערך שסופק על ידי כלי המדידה על מנת למנוע אי הכללה של מקטעי PDO בנקודות זמן מאוחרות יותר לאחר הטיפול התרופתי.
      4. להגבלת הניתוח לאזור מסוים בבאר, בטלו את הבחירה באפשרות 'נתח את כל התמונה ' ולחצו על 'הכנס'. בחלון תקע תמונה , השתמש בתפריט הנפתח כדי לבחור צורת תקע . התאם את פרמטרי הגודל והמיקום לפי הצורך כדי להתאים לאזור העניין.
         הערה: חשוב להגדיל את מספר ה-PDO בתוך התקע ובמקביל לא לכלול אזורים נטולי PDO כדי למזער את הרקע. הקצה גודל תקע שילכוד באופן עקבי את רוב האובייקטים המעניינים בעותקים משוכפלים. יצירת תקע שאינו כולל גם את שולי הכיפה חשובה מכיוון שהיא אינה כוללת עצמים שעלולים להיראות מעוותים עקב שבירת האור מהעקמומיות הקיצונית של הכיפה סביב הקצוות. ניתן גם לבטל את הבחירה באפשרות 'כלול אובייקטים בקצה הראשי ' כדי ללכוד רק רכיבי PDO שלמים בתוך התקע.
   2. ניתוח תת-אוכלוסייה. דוגמה להגדרת תת-אוכלוסייה מובאת באיור 3.
      1. לחצו על 'מדדים מחושבים' בסרגל הכלים 'ניתוח סלולרי '. לחץ על בחר או צור מדדי עניין ברמת האובייקט (פינה שמאלית, למטה). תחת מדדי אובייקטים זמינים , בחר מדדים בעלי עניין (לדוגמה, מעגליות) ולחץ על הלחצן הוסף . לחץ על אישור.
         הערה: המורפולוגיה והצפיפות של כל מודל PDO יקבעו את המדדים הטובים ביותר להבחנה בין תת-האוכלוסייה.
      2. לחצו על Subpopulation Analysis בסרגל הכלים Cellular Analysis . לחץ על הוסף כדי ליצור תת-אוכלוסייה חדשה. ייפתח חלון מוקפץ.
      3. אם תרצה, הזן שם עבור אוכלוסיית המשנה. תחת מדדי אובייקטים, בחר מדד מעניין ולחץ על הוסף תנאי. בחלון Edit Condition , הזן פרמטרים למדד האובייקט שנבחר. חזור על הפעולה עם מדדים נוספים לפי הצורך.
         הערה: ניתן לכוונן פרמטרים באופן ידני או להגדיר אותם באמצעות כלי האיתור. לדוגמה, כדי לא לכלול לכלוך, משתמשים יכולים להוסיף שטח כמדד אובייקט ולבחור עצמים קטנים מ- 800. מעגליות כמדד אובייקט נמצאת בשימוש שגרתי, וכל אובייקט עם מעגליות גדולה מ- 0.2-0.5 נכלל, בהתאם לדגם.
      4. בטבלה בתחתית החלון, בדוק את התוצאות הרצויות להצגה. לחץ על אישור > החל.
      5. כדי להציג את האובייקטים בתוך אוכלוסיית המשנה, השתמש בתפריט הנפתח פרטי אובייקט (חלונית ימנית, מרכז) כדי לבחור את אוכלוסיית המשנה. אובייקטים הנופלים בתוך הפרמטרים יודגשו בתמונה.
         הערה: כדי לשנות את צבעי הסימון של המסיכה הראשית ותת-האוכלוסייה, לחץ על הגדרות (לוח ימני, למטה).
      6. כדי להתאים פרמטרים של תת-אוכלוסייה, פתח מחדש את החלון ניתוח תת-אוכלוסייה מסרגל הכלים ניתוח תאים . בחר את אוכלוסיית המשנה ולחץ על ערוך. לחץ על הוסף שלב.
         הערה: פעולה זו תחיל את אותו ניתוח על כל הבארות בתוך הניסוי בכל נקודות הזמן. בתפריט הנפתח בדף מטריצה, ניתן לבחור מדדים שונים לצפייה אישית.

5. ייצוא נתונים מדור 5 לאקסל

1. כדי להתאים אישית קובץ נתונים לייצוא, בחר בסמל Report/Export Builders בסרגל הכלים. בחלון המוקפץ, לחץ על ייצוא חדש ל- Excel.
2. בדף Properties בחלון המוקפץ, בחר Scope > Plate and Content > Custom. לחץ על תוכן אפשרות בסרגל הכלים. לחץ על ערוך תבנית, אשר תפתח את תוכנית Excel.
3. בתוך הגיליון האלקטרוני, בחר תוספות > טבלה > נתוני תקינות. רחף מעל הבחירות השונות כדי לראות אפשרויות ייצוא. בחר מדד עניין (לדוגמה, Object Mean[ZProj[Tsf[TRITC]]]).
   הערה: ניתן להוסיף פריסת לוח לתבנית ניתוח הגליונות האלקטרוניים על-ידי בחירה באפשרות תוספות > פריסת סיכום פרוטוקול >.
4. ייפתח חלון עריכה . בתיבה בארות , ייעד את הבארות לייצוא על ידי Well-ID או באר #. בחר אישור. תבנית תיטען לקובץ הגיליון האלקטרוני. סגור גיליון אלקטרוני. התבנית נשמרת באופן אוטומטי.
5. לחץ על אישור בחלון ייצוא חדש ל- Excel וסגור את החלון בוני דוחות/ייצוא .
6. לחץ על סמל הייצוא בסרגל הכלים Gen5. סמן את התיבה לצד קובץ הייצוא הרצוי. לחץ על אישור. Gen5 יאכלס באופן אוטומטי את תבנית הגיליון האלקטרוני ויפתח את הקובץ ב- Excel.

6. ניתוח נתונים חיצוניים

1. פתח את קובץ הייצוא (.xlsx) ב- Excel.
2. עבור כל באר, חלק כל ערך בודד בערך נקודת הזמן 0:00 עבור אותה באר. פעולה זו תגדיר נקודת זמן 0 שווה ל- 1, וכל ערך מעבר לכך יהיה יחסי לקריאה הראשונית.
3. פתח קובץ חדש בתוכנת ניתוח הנתונים. בחר באפשרות פריסת XY .
   הערה: בפרוטוקול זה, נעשה שימוש ב- GraphPad Prism (גרסה 9.5.1).
4. תוויות קלט עבור כל קבוצת נתונים. העתק והדבק את נקודות הזמן ואת הערכים המנורמלים המתאימים עבור כל קבוצת טיפול לטבלת פריזמה. גרף עבור הנתונים יופק באופן אוטומטי וניתן למצוא אותו תחת גרפים.

תוצאות

מטרתנו הייתה להדגים את ההיתכנות של שימוש בהדמיה מרובת תאים חיים כדי להעריך תגובה טיפולית של PDO. ניסויי הוכחת היתכנות בוצעו בשני מודלים נפרדים של PDO לסרטן רירית הרחם: ONC-10817 ו-ONC-10811 (ראו איור משלים 1 ואיור משלים 2 לנתוני ONC-10811). אפופטוזיס (צביעת נספח V) וציטוטוקסיות (ספיגה ירוקה ...

Discussion

תרביות PDO הופכות לפופולריות יותר ויותר במערכת מודל במבחנה בשל יכולתן לשקף תגובות והתנהגויות תאיות². התקדמות משמעותית נעשתה ביצירת PDO, בתרבות ובטכניקות הרחבה, אך שיטות לניתוח תגובות טיפוליות התמהמהו. ערכות כדאיות תלת-ממדיות הזמינות באופן מסחרי הן מבחני נקודות קצה ליטיים, מחמי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrfuge tube	Dot Scientific Inc	1008113
15 mL conical centrifuge tube	Sarstedt	62.554.100
554 NM LED Cube	Agilent	1225012
96-well plate	Corning Costar	3596	Prewarmed to 37 °C
96-well plate	Agilent	204626-100	Prewarmed to 37 °C
A83-01	Tocris	2939	Final concentration is 500 nM (component of organoid culture media)
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634-010	component of organoid culture media
B27 Supplement	Gibco	17504044	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
BioTek BioSpa 8 Automated Incubator	Agilent	BIOSPAG-SN	Tabletop incubator; BioSpa OnDemand scheduling software comunicates with Gen5 to transfer plates between the BioSpa and the Cytation 5 for imaging (this protocol uses version 1.01.10)
BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader	Agilent	CYT5PW-SN	Plate reader; Gen5 software is used for this device (this protocol uses version 3.12.08)
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract	R&D Systems	BME001-10
Daunorubicin HCl	Sigma-Aldrich	S3035	Reconstituted in DMSO
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2438
EDTA (0.5 M)	Thermo Fisher	AM9260G
Forskolin	Tocris	1099	Final concentration is 10 µM (component of organoid culture media)
Glutamax	Gibco	35050-061	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Human EGF, Animal-Free Recombinant Protein	Gibco	AF-100-15-1MG	Final concentration is 0.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Human FGF-10 Recombinant Protein	Gibco	100-26-1MG	Final concentration is 10 ng/mL (component of organoid culture media)
Human R-Spondin 1 Recombinant Protein	Gibco	120-38-5UG	Final concentration is 250 ng/mL (component of organoid culture media)
Hydrocortisone Stock Solution	StemCell Technologies	7926	Final concentration is 500 ng/mL (component of organoid culture media)
Imaging Filter Cube- GFP	Agilent	1225101
Imaging Filter Cube- TRITC	Agilent	1225125
Imaging LED GFP/CFP	Agilent	1225001
Incucyte Annexin V Red Dye	Sartorius	4641	Reconstituted in organoid culture media
Incucyte Cytotox Green Dye	Sartorius	4633	DMSO solution
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A7250	Final concentration is 1.25 mM (component of organoid culture media)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining Solution	Fisher-Scientific	13366169	Add 1:50 volume
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Noggin	R&D Systems	6057-NG	Final concentration is 100 ng/mL (component of organoid culture media)
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Final concentration is 10 units/mL (component of organoid culture media)
Phosphate Buffered Saline (1x)	Gibco	14190-144
Primocin	InvivoGen	ant-pm-05	Final concentration is 100 µg/mL (component of organoid culture media)
Recombinant Human Heregulinβ-1	Pepro Tech	100-03	Final concentration is 37.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Staurosporine solution from Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	S6942
TrypLE Express	Life Technologies	12604013
Y-27632, CAS 331752-47-7	Sigma-Aldrich	688000	Final concentration is 5 µM (component of organoid culture media)
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	Final concentration is 100 nM (component of organoid culture media)