Imagerie multiplexe de cellules vivantes pour les réponses médicamenteuses dans des modèles organoïdes de cancer dérivés de patients

Résumé

Les organoïdes tumoraux dérivés de patients sont un système modèle sophistiqué pour la recherche fondamentale et translationnelle. Cet article sur les méthodes détaille l’utilisation de l’imagerie fluorescente multiplexée de cellules vivantes pour l’évaluation cinétique simultanée de différents phénotypes d’organoïdes.

Résumé

Les modèles organoïdes dérivés de patients (PDO) du cancer sont un système de recherche multifonctionnel qui récapitule mieux les maladies humaines par rapport aux lignées cellulaires cancéreuses. Des modèles PDO peuvent être générés en cultivant des cellules tumorales de patients dans des extraits de membrane basale extracellulaire (BME) et en les plaquant sous forme de dômes tridimensionnels. Cependant, les réactifs disponibles dans le commerce qui ont été optimisés pour les tests phénotypiques dans les cultures monocouches ne sont souvent pas compatibles avec l’EMO. Dans cet article, nous décrivons une méthode pour mettre en plaque des modèles PDO et évaluer les effets des médicaments à l’aide d’un système automatisé d’imagerie de cellules vivantes. De plus, nous appliquons des colorants fluorescents compatibles avec les mesures cinétiques pour quantifier simultanément la santé cellulaire et l’apoptose. La capture d’image peut être personnalisée pour se produire à intervalles réguliers sur plusieurs jours. Les utilisateurs peuvent analyser les effets des médicaments dans des images individuelles du plan Z ou une projection Z d’images en série à partir de plusieurs plans focaux. Le masquage permet de calculer des paramètres d’intérêt spécifiques, tels que le nombre de PDO, la surface et l’intensité de fluorescence. Nous fournissons des données de preuve de concept démontrant l’effet des agents cytotoxiques sur la santé, l’apoptose et la viabilité des cellules. Cette plateforme d’imagerie cinétique automatisée peut être étendue à d’autres lectures phénotypiques pour comprendre divers effets thérapeutiques dans les modèles PDO du cancer.

Introduction

Les organoïdes tumoraux dérivés de patients (DO) apparaissent rapidement comme un système modèle robuste pour étudier le développement du cancer et les réponses thérapeutiques. Les PDO sont des systèmes de culture cellulaire tridimensionnels (3D) qui récapitulent le profil génomique complexe et l’architecture de la tumeur primaire ^1,2. Contrairement aux cultures bidimensionnelles (2D) traditionnelles de lignées cellulaires cancéreuses immortalisées, les AOP capturent et maintiennent l’hétérogénéité intratumorale ^3,4, ce qui en fait un outil précieux po....

Protocole

Les études utilisant des échantillons de tumeurs humaines ont été examinées et approuvées par le comité d’examen institutionnel (IRB) de l’Université de l’Iowa, protocole #201809807, et réalisées conformément aux normes éthiques énoncées dans la Déclaration d’Helsinki de 1964 et ses amendements ultérieurs. Le consentement éclairé a été obtenu de tous les sujets participant à l’étude. Les critères d’inclusion comprennent un diagnostic de cancer et la disponibilité d’échantillons tumoraux.

1. Placage d’AOP intactes dans une plaque à 96 puits

1. Préparez les réactifs.
   1. Préchauffer les plaques de 96 puits à 37 °C p....

Discussion

Les cultures PDO deviennent un système modèle in vitro de plus en plus populaire en raison de leur capacité à refléter les réponses et les comportements cellulaires². Des progrès significatifs ont été réalisés dans les techniques de génération, de culture et d’expansion des AOP, mais les méthodes d’analyse des réponses thérapeutiques ont pris du retard. Les kits de viabilité 3D disponibles dans le commerce sont des tests lytiques de fin d’évaluation, qui ne disposent pas de.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrfuge tube	Dot Scientific Inc	1008113
15 mL conical centrifuge tube	Sarstedt	62.554.100
554 NM LED Cube	Agilent	1225012
96-well plate	Corning Costar	3596	Prewarmed to 37 °C
96-well plate	Agilent	204626-100	Prewarmed to 37 °C
A83-01	Tocris	2939	Final concentration is 500 nM (component of organoid culture media)
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634-010	component of organoid culture media
B27 Supplement	Gibco	17504044	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
BioTek BioSpa 8 Automated Incubator	Agilent	BIOSPAG-SN	Tabletop incubator; BioSpa OnDemand scheduling software comunicates with Gen5 to transfer plates between the BioSpa and the Cytation 5 for imaging (this protocol uses version 1.01.10)
BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader	Agilent	CYT5PW-SN	Plate reader; Gen5 software is used for this device (this protocol uses version 3.12.08)
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract	R&D Systems	BME001-10
Daunorubicin HCl	Sigma-Aldrich	S3035	Reconstituted in DMSO
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2438
EDTA (0.5 M)	Thermo Fisher	AM9260G
Forskolin	Tocris	1099	Final concentration is 10 µM (component of organoid culture media)
Glutamax	Gibco	35050-061	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Human EGF, Animal-Free Recombinant Protein	Gibco	AF-100-15-1MG	Final concentration is 0.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Human FGF-10 Recombinant Protein	Gibco	100-26-1MG	Final concentration is 10 ng/mL (component of organoid culture media)
Human R-Spondin 1 Recombinant Protein	Gibco	120-38-5UG	Final concentration is 250 ng/mL (component of organoid culture media)
Hydrocortisone Stock Solution	StemCell Technologies	7926	Final concentration is 500 ng/mL (component of organoid culture media)
Imaging Filter Cube- GFP	Agilent	1225101
Imaging Filter Cube- TRITC	Agilent	1225125
Imaging LED GFP/CFP	Agilent	1225001
Incucyte Annexin V Red Dye	Sartorius	4641	Reconstituted in organoid culture media
Incucyte Cytotox Green Dye	Sartorius	4633	DMSO solution
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A7250	Final concentration is 1.25 mM (component of organoid culture media)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining Solution	Fisher-Scientific	13366169	Add 1:50 volume
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Noggin	R&D Systems	6057-NG	Final concentration is 100 ng/mL (component of organoid culture media)
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Final concentration is 10 units/mL (component of organoid culture media)
Phosphate Buffered Saline (1x)	Gibco	14190-144
Primocin	InvivoGen	ant-pm-05	Final concentration is 100 µg/mL (component of organoid culture media)
Recombinant Human Heregulinβ-1	Pepro Tech	100-03	Final concentration is 37.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Staurosporine solution from Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	S6942
TrypLE Express	Life Technologies	12604013
Y-27632, CAS 331752-47-7	Sigma-Aldrich	688000	Final concentration is 5 µM (component of organoid culture media)
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	Final concentration is 100 nM (component of organoid culture media)