Мультиплексная визуализация живых клеток для реакции на лекарственные препараты в органоидных моделях рака, полученных от пациентов

Резюме

Органоиды опухолей, полученные от пациентов, представляют собой сложную модельную систему для фундаментальных и трансляционных исследований. В данной методе подробно описано использование мультиплексной флуоресцентной визуализации живых клеток для одновременной кинетической оценки различных органоидных фенотипов.

Аннотация

Органоидные модели рака, полученные от пациента (PDO), представляют собой многофункциональную исследовательскую систему, которая лучше повторяет заболевание человека по сравнению с линиями раковых клеток. Модели PDO могут быть созданы путем культивирования опухолевых клеток пациента в экстрактах внеклеточной базальной мембраны (BME) и покрытия их в виде трехмерных куполов. Однако коммерчески доступные реагенты, оптимизированные для фенотипического анализа в монослойных культурах, часто несовместимы с БМЭ. В этой статье мы опишем метод планшетирования моделей PDO и оценки эффектов лекарств с помощью автоматизированной системы визуализации живых клеток. Кроме того, мы применяем флуоресцентные красители, совместимые с кинетическими измерениями, для количественной оценки здоровья клеток и апоптоза одновременно. Захват изображений можно настроить так, чтобы он происходил через регулярные промежутки времени в течение нескольких дней. Пользователи могут анализировать действие лекарств на отдельных изображениях в Z-плоскости или Z-проекции последовательных изображений из нескольких фокальных плоскостей. С помощью маскировки вычисляются конкретные интересующие параметры, такие как число PDO, площадь и интенсивность флуоресценции. Мы предоставляем экспериментальные данные, демонстрирующие влияние цитотоксических агентов на здоровье, апоптоз и жизнеспособность клеток. Эта автоматизированная платформа кинетической визуализации может быть расширена для других фенотипических считываний для понимания различных терапевтических эффектов в моделях рака PDO.

Введение

Органоиды опухолей, полученные от пациентов (PDO), быстро становятся надежной модельной системой для изучения развития рака и терапевтических реакций. PDO представляют собой трехмерные (3D) системы культивирования клеток, которые повторяют сложный геномный профиль и архитектуру первичной опухоли ^1,2. В отличие от традиционных двумерных (2D) культур иммортализированных раковых клеточных линий, PDO захватывают и поддерживают внутриопухолевую гетерогенность ^3,4, что делает их ценным инструментом как для механистических, так и для трансляционных исследований. Несмотря на то, что PDO становятся все более популярными модельными системами, коммерчески доступные реагенты и методы анализа клеточных эффектов, совместимые с культурами PDO, ограничены.

Отсутствие надежных методов анализа тонких изменений в ответе на лечение затрудняет клиническую трансляцию. Золотой стандарт реагента для здоровья клеток в 3D-культурах, CellTiter-Glo 3D, использует уровень АТФ в качестве детерминанты жизнеспособности клеток ^5,6. Несмотря на то, что этот реагент полезен для анализа конечных точек, есть несколько предостережений, в первую очередь невозможность использования образцов для других целей после завершения анализа.

Визуализация живых клеток — это сложная форма кинетической микроскопии, которая в сочетании с флуоресцентными реагентами способна количественно оценить различные показатели здоровья клеток в моделях PDO, включая апоптоз^{7, 8, 9} и цитотоксичность¹⁰. Действительно, визуализация живых клеток является неотъемлемой частью высокопроизводительного скрининга соединений на ^{2D-платформах 11,12}. Такие системы, как Incucyte, сделали технологию доступной и, следовательно, доступной для исследовательских групп в различных условиях. Тем не менее, применение этих систем для анализа 3D-культур все еще находится в зачаточном состоянии.

В данной работе мы описываем метод оценки лекарственного ответа в моделях рака PDO с использованием мультиплексной визуализации живых клеток (рис. 1). С помощью анализа изображений яркого поля можно кинетически отслеживать изменения размера и морфологии PDO. Кроме того, клеточные процессы могут быть одновременно количественно определены с течением времени с помощью флуоресцентных реагентов, таких как красный краситель Annexin V для апоптоза и зеленый краситель Cytotox для цитотоксичности. Представленные методы оптимизированы для системы визуализации живых клеток Cytation 5, но этот протокол может быть адаптирован для различных платформ визуализации живых клеток.

протокол

Исследования с использованием образцов опухолей человека были рассмотрены и одобрены Институциональным наблюдательным советом Университета Айовы (IRB), протокол #201809807, и проведены в соответствии с этическими стандартами, изложенными в Хельсинкской декларации 1964 года и более поздних поправках к ней. Информированное согласие было получено от всех испытуемых, участвовавших в исследовании. Критерии включения включают диагноз рака и наличие образцов опухоли.

1. Нанесение неповрежденных PDO в 96-луночный планшет

1. Подготовьте реактивы.
   1. Разогрейте 96-луночные планшеты до 37 °C в течение ночи и разморозьте BME в течение ночи при 4 °C.
   2. Подготовьте полную органоидную питательную среду, оптимизированную для культивирования интересующего типа рака. Конкретные питательные среды, используемые для экспериментов, показанных в настоящем документе, приведены в Дополнительной таблице 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, потребуется модифицировать компоненты среды для различных типов опухолей. Например, органоидная питательная среда дополнена эстрадиолом 100 нМ при гинекологических опухолях¹³. Приготовленная среда стабильна при 4 °C в течение 1 месяца. Для длительного хранения наполните среду в пробирки объемом 50 мл и храните при температуре -20 °C.
2. Готовят две отдельные аликвоты органоидных питательных сред при температуре 4 °C и 37 °C. Например, если 60 лунок покрываются в 96-луночном планшете, используйте 6 мл теплой органоидной питательной среды и 150 мкл ледяной органоидной питательной среды.
3. Подготовьте буфер для промывки органоидов: добавьте 1x PBS с 10 мМ HEPES, 1 Glutamax, 5 мМ ЭДТА и 10 мкМ Y-27632. Хранить при температуре 4 °C
4. Собирайте PDO, культивируемые в 24-луночном планшете. Выполняйте все действия на льду или при температуре 4 °C, если не указано иное.
   1. Отсасывайте среду из каждой скважины с помощью системы вакуумных линий.
   2. Добавьте 500 мкл ледяного буфера для промывки органоидов и осторожно пипеткой 2-3 раза с помощью пипеттора на 1000 мкл. Инкубируйте пластину на льду в течение 10 минут.
   3. Перелейте содержимое каждой лунки в коническую пробирку объемом 50 мл. Чтобы убедиться, что все PDO находятся во взвешенном состоянии, промойте каждую лунку дополнительным 300 мкл буфера для промывки органоидов и перелейте в коническую пробирку объемом 50 мл. Центрифуга в течение 5 мин при 350 x g при 4 °C
   4. Отсасывайте надосадочную жидкость из гранулы BME/органоида с помощью системы вакуумной линии, оставляя ~ 5 мл в пробирке. Добавьте 20 мл буфера для промывки органоидов и аккуратно ресуспендируйте гранулу с помощью серологической пипетки объемом 10 мл. Инкубировать на льду 10 мин.
   5. Центрифуга в течение 5 мин при 350 x g при 4 °C. Отсасывайте надосадочную жидкость с помощью системы вакуумной линии, стараясь не нарушить гранулу PDO.
5. Нанесение PDO на 96-луночную пластину: Выполняйте все действия на льду, если не указано иное.
   1. Ресуспендируйте гранулу PDO в соответствующем количестве ледяной среды для культивирования органоидов, чтобы создать суспензию PDO. Перенесите суспензию PDO в ледяную пробирку для микроцентрифуги объемом 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы рассчитать количество органоидных питательных сред, определите количество лунок, которые должны быть покрыты в 96-луночном планшете, принимая во внимание, что PDO покрываются куполом объемом 5 мкл в соотношении 1:1 органоидных питательных сред и BME. Например, при покрытии одной 96-луночной планшетной пластины и использовании только внутренних 60 лунок общее количество необходимой суспензии PDO составит 300 мкл: 150 мкл органоидной питательной среды и 150 мкл BME. Для моделей, демонстрирующих оптимальный рост при различных процентах BME, соотношение BME: среда может быть изменено на этом этапе, хотя важно стандартизировать соотношение для всех анализов для каждой конкретной модели. Чтобы учесть ошибку пипетирования, добавьте 10% объема к каждому компоненту.
   2. Подсчитайте количество PDO.
      1. Перенесите 2,5 мкл суспензии PDO в ледяную пробирку для микроцентрифуги объемом 1,5 мл и смешайте с 2,5 мкл BME. Перенесите смесь 5 мкл на чистое стеклянное предметное стекло микроскопа. Не закрывайте затвор. Смесь застынет в купол.
      2. Визуализируйте с помощью яркопольного микроскопа с 4-кратным увеличением. Подсчитайте количество PDO в смеси 5 мкл; Цель состоит в том, чтобы иметь примерно 25-50 PDO на купол объемом 5 мкл.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Если желаемая плотность в испытуемой смеси не достигнута, отрегулируйте окончательный объем суспензии PDO либо путем добавления дополнительных питательных сред для органоидов, либо путем центрифугирования суспензии PDO и ресуспендирования гранулы PDO в меньшем объеме ледяной среды для культивирования органоидов. Независимо от того, как модифицируется суспензия PDO на этом этапе, окончательное соотношение BME:суспензия PDO на шаге 1.5.3. должно быть 1:1.
   3. Используя дозатор объемом 200 мкл с широкими наконечниками, тщательно перемешайте суспензию PDO с равным количеством BME для достижения соотношения органоидных питательных сред к BME 1:1. Избегайте пузырей, которые нарушат целостность куполов.
   4. С помощью пипеттора на 20 мкл засейте 5 мкл куполов в центр каждой лунки предварительно нагретой 96-луночной пластины, засеивая только внутренние 60 лунок. Чтобы обеспечить равномерное распределение PDO, периодически пропитывайте содержимое пробирки объемом 1,5 мл с помощью пипетки на 200 мкл с широкопроходными наконечниками.
   5. После того, как все лунки засеяны, накройте тарелку крышкой и аккуратно переверните. Инкубируйте перевернутую пластину при температуре 37 °C в течение 20 минут в инкубаторе для культуры тканей, чтобы купола затвердели.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инвертирование планшета гарантирует, что купол BME/органоидной питательной среды сохранит 3D-структуру, чтобы обеспечить достаточное пространство для формирования PDO.
   6. Переверните тарелку так, чтобы она стояла с крышкой вверх, и инкубируйте в течение 5 минут при 37 °C.

2. Обработка и добавление флуоресцентных красителей для мультиплексирования

1. Пока купола BME затвердевают в 96-луночных планшетах, приготовьте разведения флуоресцентных реагентов для визуализации живых клеток. Конкретные параметры мультиплексирования красного красителя Annexin V и зеленого красителя Cytotox приведены в настоящем документе.
2. Приготовление флуоресцентных реагентов (День -1): Рассчитайте соответствующий объем органоидных питательных сред на основе количества лунок, подлежащих обработке, предполагая, что каждая лунка будет обработана 100 мкл питательной среды, дозированной красителем. Развести краситель в предварительно подогретых питательных средах органоидов до нужной концентрации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Общее количество необходимых носителей зависит от эксперимента. Добавьте 10% к конечному объему, чтобы учесть ошибку пипетирования. Например, для обработки внутренних 60 лунок 96-луночного планшета приготовьте 6,6 мл среды, дозированной красителем (Таблица 1).
3. Обработайте каждую лунку 100 мкл 2-кратной дозированной питательной среды органоидов. Добавьте 200 мкл стерильного 1x PBS во внешние пустые лунки планшета. Выдерживают при температуре 37 °C в течение ночи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: PBS в периферийных лунках уменьшает испарение среды из внутренних скважин.
4. Добавление лекарственных средств/средств для лечения (день 0): Готовят препараты в предварительно подогретых питательных средах органоидов в 2-кратной концентрации в объеме 100 мкл на лунку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: ДМСО может быть токсичен для клеток в высоких концентрациях. Концентрация 0,1% ДМСО не превышена в экспериментах, проведенных в этом исследовании. Помимо лекарственных препаратов, некоторые флуоресцентные реагенты распространяются в виде раствора ДМСО. При работе с такими реагентами важно учитывать общую концентрацию ДМСО.
5. Добавьте 100 мкл 2-кратной дозированной красителя среды в каждую лунку; Избегайте образования пузырей.

3. Настройка параметров визуализации

1. Поместите пластину в Цитацию 5. Открытый Программное обеспечение 5-го поколения. Нажмите «Новая задача» > «Ручной режим тепловизора». Выберите «Захватить сейчас» и введите следующие параметры: Объектив (выберите желаемое увеличение); Фильтр (выберите микропластину); Формат микропланшета (выберите количество лунок); и Тип сосуда (выберите тип пластины). Щелкните Использовать крышку и Использовать более медленную скорость оператора. Нажмите кнопку ОК.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тип сосуда: Будьте как можно более точны при выборе информации о пластине, поскольку программное обеспечение откалибровано на определенное расстояние от объектива до нижней части пластины для каждого типа пластины и толщины пластика.
   Более низкая скорость несущей: установите этот флажок, чтобы избежать разрушения куполов при загрузке/разгрузке плит.
2. Создайте Z-Stack, который будет отображать всю купол BME.
   1. Выберите интересующую скважину для просмотра (левая панель, под гистограммой).
   2. Выберите канал «Яркое поле» (левая панель, сверху). Нажмите «Автоэкспонирование» и при необходимости отрегулируйте параметры.
   3. Установите нижнюю и верхнюю часть Z-Stack: Разверните вкладку Imaging Mode (левая панель, посередине). Установите флажок Z-Stack . С помощью стрелок регулировки курса (левая панель, посередине) нажимайте на коррекцию вниз до тех пор, пока все PDO не войдут в фокус, а затем не выйдут из фокуса и не станут нечеткими. Установите его в качестве нижней части Z-стека. Повторите то же самое в противоположном направлении, используя стрелки регулировки курса, чтобы установить верхнюю часть Z-Stack.
   4. Чтобы убедиться в том, что настройки Z-Stack подходят для других интересующих скважин, выберите другую скважину (левая панель, под гистограммой) и визуализируйте верхнюю и нижнюю части Z-Stack.
   5. Чтобы вручную ввести положения фокуса, нажмите на три точки рядом с точной настройкой (левая панель, сверху). Откроется окно; введите верхнее значение Z-Stack (находится на левой панели, по центру, в разделе Imaging Mode). Повторите то же самое для нижнего значения Z-Stack. При необходимости отрегулируйте, чтобы захватить желаемый диапазон Z, повторив шаг 3.2.3. Если необходимо выполнить регулировку, выберите другую скважину для проверки настроек.
3. Установите настройки экспозиции для флуоресцентных каналов. Настройки описаны для двух флуоресцентных каналов (GFP и TRITC). Конкретное количество флуоресцентных каналов будет зависеть от эксперимента и от того, какие флуоресцентные кубы установлены в системе визуализации живых клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если ожидается, что интенсивность сигнала будет значительно выше в конце эксперимента, пользователям следует рассмотреть возможность проведения тестовых экспериментов, чтобы определить оптимальные настройки экспозиции в конце эксперимента, которые затем могут быть применены при настройке начальных параметров.
   1. Разверните вкладку Imaging Mode (левая панель, посередине) и откройте Edit Imaging Step. Появится всплывающее окно.
   2. В разделе «Каналы» нажмите на кружок с нужным количеством каналов. Назначьте один канал для яркого поля и дополнительные каналы для каждого флуоресцентного канала. В этом примере Канал 1 = Яркое поле; Канал 2 = GFP; Канал 3 = TRITC. С помощью выпадающего меню «Цвет» выберите соответствующую настройку для каждого канала. Закройте окно редактирования, нажав кнопку ОК.
   3. Настройте каждый флуоресцентный канал.
      1. Переключите канал на GFP (левая панель, сверху).
      2. Нажмите «Автоэкспонирование» (левая панель, вверху). Разверните вкладку «Экспозиция » (левая панель, средняя) и отрегулируйте настройки экспозиции, чтобы свести к минимуму фоновый сигнал.
      3. Скопируйте настройки экспозиции на вкладку «Режим изображения », выполнив шаги 3.3.3.3-3.3.3.6.
      4. Нажмите на значок Копировать рядом с полем Редактировать шаг изображения . Нажмите кнопку Edit Imaging Step, после чего откроется другое окно.
      5. Под каналом GFP щелкните значок буфера обмена в строке «Экспозиция », чтобы добавить в канал настройки «Освещенность», «Время интеграции» и «Усиление камеры ».
      6. Повторите шаги 3.3.3.4-3.3.3.5 для канала TRITC. Нажмите кнопку ОК , чтобы закрыть окно.
4. Настройте предварительную обработку изображений и шаги Z-проекции, чтобы автоматизировать предварительную обработку изображений.
   1. Нажмите на значок камеры (левая панель, нижний угол). Откроется новое окно.
   2. В разделе Add Processing Step (левая панель, внизу) нажмите Image Preprocessing (Предварительная обработка изображений). Откроется новое окно.
   3. На вкладке «Яркое поле » снимите флажок «Применить предварительную обработку изображения».
   4. Убедитесь, что для каждой вкладки «Флуоресцентный канал» выбран параметр «Применить предварительную обработку изображения ». Снимите флажок Использовать те же параметры, что и канал 1 и нажмите кнопку ОК. Окно закроется.
   5. В разделе Add Processing Step (Добавить шаг обработки) нажмите Z Projection (Проекция Z). Откроется новое окно. При необходимости отрегулируйте диапазон срезов (например, чтобы сузить диапазон Z). Закройте окно, нажав кнопку ОК.
5. Создание протокола.
   1. Нажмите кнопку Набор изображений на панели инструментов. В раскрывающемся меню нажмите Создать эксперимент из этого набора изображений. Окно визуализации закроется, и откроется окно процедуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры, выбранные в ручном режиме тепловизора , будут автоматически загружены в новое окно, в результате чего можно будет создать экспериментальный протокол.
   2. Установите температуру и градиент: нажмите «Установить температуру» под заголовком «Действия» (слева). Откроется новое окно. Выберите «Инкубатор включен» и вручную введите желаемую температуру в разделе «Температура». Затем в разделе Градиент вручную введите 1. Закройте окно, нажав кнопку ОК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Создание градиента 1 °C предотвратит образование конденсата на крышке пластины.
   3. Обозначьте колодцы на изображении.
      1. Дважды щёлкните по шагу изображения в разделе Описание. Нажмите «Полная пластина » (правый угол, сверху). Откроется окно "Компоновка пластины ".
      2. Выделите интересующие вас скважины с помощью курсора. Нажмите кнопку ОК. При необходимости установите флажки «Объединение автофокусировки » и «Объединение захвата ». Нажмите кнопку ОК , чтобы закрыть окно.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Биннинг потребует регулировки экспозиции, как описано в шаге 3.3.3.2 выше. Конкретные сценарии, в которых может использоваться эта функция, см. в разделе «Обсуждение».
   4. Установите интервалы для кинетической визуализации.
      1. Нажмите « Параметры » под заголовком «Другое » (слева). Установите флажок Прерывистая кинетическая процедура .
      2. В поле Расчетное общее время введите время выполнения эксперимента (например, 5 дней). В разделе "Расчетный интервал" введите интервал для получения изображения пластины (например, каждые 6 часов).
      3. Нажимайте кнопку Пауза после каждого запуска, чтобы дать время для переноса планшета в инкубатор. Закройте окно, нажав кнопку ОК.
   5. Обновление шагов по сокращению объема данных.
      1. Нажмите кнопку ОК, чтобы закрыть окно процедуры. Откроется вкладка для обновления шагов по сокращению данных. Выберите Да. Дважды щёлкните по Предварительной обработке изображений. Просмотрите различные каналы, чтобы проверить настройки, и нажмите кнопку ОК.
      2. Дважды щёлкните по Z-проекции. Щелкните по различным каналам, чтобы проверить настройки. Нажмите кнопку ОК. Затем снова нажмите кнопку «ОК », чтобы закрыть окно «Сокращение данных».
   6. Отформатируйте макет пластины.
      1. Откройте мастер компоновки пластин и обозначьте типы колодцев, выполнив шаги 3.6.2-3.6.3.
      2. Щелкните по значку "Компоновка пластин " на панели инструментов (в левом углу, вверху), чтобы открыть Мастер компоновки пластин.
      3. Установите флажки рядом с типами скважин, используемых в эксперименте. В разделе «Контроль анализа» введите количество различных типов элементов управления с помощью стрелок. Нажмите кнопку Далее , чтобы открыть окно Контроль пробы #1 .
      4. Задайте пробирные контрольные условия скважины, выполнив шаги 3.6.5-3.6.8.
      5. В окне Контроль анализа #1 введите метку управления в поле Идентификатор компоновки пластины . При желании введите ФИО в соседнее поле. Выберите количество репликаций для соответствующего условия управления с помощью стрелок.
      6. Если в элементе управления используется несколько концентраций или серия разбавлений, щелкните Определить разведения/концентрации и используйте раскрывающееся меню, чтобы выбрать Тип. Введите значения для каждой концентрации/разведения в таблицу.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Функцию auto можно использовать, если концентрация изменяется с постоянным приращением.
      7. Выберите вкладку «Цвет » на панели инструментов. Выберите желаемый цвет текста и цвет фона для управления в выпадающем меню. Нажмите кнопку Далее.
      8. При необходимости повторите процедуру с дополнительными элементами управления.
      9. Устанавливают условия отбора проб в скважине по 3.6.10-3.6.12.
      10. На странице Настройка образца введите префикс идентификатора образца (например, SPL). Выберите количество репликаций с помощью стрелок. При использовании образцов с различными концентрациями для обработки выберите Концентрации или Разведения в ниспадающем меню Тип . Введите разведения/концентрации в таблицу и введите единицы измерения в поле Единицы измерения .
      11. Выберите Поля идентификации на панели инструментов. Введите желаемые названия категорий (например, идентификатор образца, лекарственного препарата) в таблицу.
      12. Выберите вкладку Цвет на панели инструментов. Выберите другой цвет для каждой группы обработки/образца. Нажмите кнопку Finish (Готово). Откроется страница "Компоновка пластины".
          ПРИМЕЧАНИЕ: Числа слева коррелируют с различными номерами выборок.
      13. Присвойте идентификаторы образцов, выполнив шаги 3.6.14-3.6.16.
      14. Выбирать SPL1 на левой панели. Используйте курсор для выбора колодцев.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Инструменты автоматического выбора можно настроить в поле последовательного назначения. Количество реплик и ориентация макета могут быть предварительно назначены.
      15. Повторите то же самое с другими образцами, чтобы завершить компоновку пластины. Когда все будет готово, нажмите кнопку ОК.
      16. На панели инструментов Файл выберите Идентификаторы образцов. Заполните столбцы «Идентификатор образца » соответствующей информацией для каждого образца (например, тип препарата). Нажмите кнопку ОК.
   7. Сохраните протокол.
      1. На панели инструментов нажмите «Файл » > «Сохранить протокол как». Выберите папку для сохранения файла. Введите имя файла. Нажмите кнопку Сохранить , чтобы закрыть окно.
      2. Нажмите «Файл» > «Выход» на панели инструментов. Откроется вкладка для сохранения изменений в ручном режиме тепловизора. Выберите Нет.
      3. Откроется вкладка для сохранения изменений в эксперименте 1. Выберите Нет. Откроется вкладка для обновления определения протокола. Выберите Обновить. Закройте программное обеспечение.
6. Импортируйте протокол в BioSpa OnDemand и завершите настройку эксперимента.
   1. Откройте программное обеспечение BioSpa OnDemand (программное обеспечение для планирования).
   2. Выберите доступный слот в программном обеспечении.
   3. Извлеките пластину из системы визуализации живых клеток. Нажмите кнопку Открыть ящик , чтобы получить доступ к соответствующему слоту в программном обеспечении для планирования и вставить пластину. Нажмите кнопку Закрыть ящик.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть выполнен в любой момент после создания протокола на шаге 3.5.7 выше. Тем не менее, пластина должна находиться в Цитации 5, чтобы выполнить прогон времени на следующем шаге 3.6.4.3.
   4. Импортируйте протокол.
      1. На вкладке «Информация о процедуре» выберите «Пользователь» в раскрывающемся меню. Рядом со слотом протокола нажмите кнопку Выбрать > Добавить новую запись.
      2. Рядом со слотом протокола нажмите кнопку Выбрать. После этого откроется новое окно для перехода к нужному протоколу в файловой архитектуре. Нажмите кнопку Открыть , чтобы импортировать протокол в программное обеспечение для планирования.
      3. Введите время, необходимое для получения изображения пластины. Нажмите кнопку ОК , чтобы закрыть окно Список протоколов Gen5 .
         ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг особенно важен при одновременном выполнении нескольких экспериментов. Чтобы определить время, необходимое для создания образа, нажмите кнопку Выполнить временный прогон сейчас. Нажмите кнопку ОК.
   5. Установите интервалы визуализации и запланируйте эксперимент.
      1. В поле Интервал введите интервал визуализации, указанный в шаге 3.5.4.
      2. В разделе «Параметры времени начала» выберите «Когда доступно». В разделе « Длительность» выберите «Фиксированная » или «Непрерывная».
         ПРИМЕЧАНИЕ: Можно назначить конкретное время запуска вместо запуска протокола в следующее доступное время. При выборе параметра «Фиксированная длительность » будет задана конкретная конечная точка для эксперимента, а пользователю потребуется указать экспериментальный период времени. Непрерывная длительность позволяет проводить эксперимент без конечной точки и может быть завершен только в том случае, если пользователь остановит эксперимент.
      3. Щелкните Запланировать плиту/сосуд. Откроется последовательность проверки пластин. Откроется вкладка с предлагаемым временем первого чтения. Нажмите кнопку Да, чтобы принять это расписание.

4. Анализ изображений в программном обеспечении Gen5 (рис. 2)

1. Откройте модуль Анализ изображений.
   1. Откройте Gen5. В диспетчере задач выберите Эксперименты > Открыть. Выберите эксперимент, чтобы открыть файл. Нажмите кнопку "Пластина > вид" на панели инструментов.
   2. Измените ниспадающее меню Данные на Проекция Z. Дважды щёлкните по интересующей вас колодце. Выберите Анализ, > я хочу настроить новый шаг сокращения данных анализа изображений. Нажмите кнопку ОК.
2. Клеточный анализ
   1. Основная маска
      1. В разделе «Настройки анализа» выберите «Тип: Канал клеточного анализа и обнаружения: ZProj[Tsf[Яркое поле]] (левая панель, в центре).
      2. Щелкните Опции. Откроется страница Основная маска и количество. В поле Пороговое значение установите флажок Авто и нажмите кнопку Применить. Щелкните поле «Выделить объекты» (правая панель, внизу), чтобы отобразить объекты в пределах заданного порогового значения. При необходимости отрегулируйте, чтобы включить интересующие вас объекты.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Пороговые настройки основаны на интенсивности пикселей. Например, если пороговое значение равно 5000, в анализ будут включены пиксели с интенсивностью более 5000.
      3. В разделе "Выбор объекта" укажите минимальный и максимальный размер объекта (мкм). При необходимости отрегулируйте, чтобы исключить клеточный мусор/отдельные клетки.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Размер PDO может значительно отличаться в зависимости от модели и типа. Используйте измерительный инструмент в программном обеспечении Gen5 для определения минимальных и максимальных пороговых значений размера PDO для каждой модели. Пользователи могут выбрать меньший минимальный порог размера PDO по сравнению со значением, предоставленным измерительным инструментом, чтобы предотвратить исключение фрагментов PDO в более поздние моменты времени после медикаментозного лечения.
      4. Чтобы ограничить анализ определенной областью скважины, снимите флажок Анализировать все изображение и нажмите кнопку Подключить. В окне Image Plug используйте ниспадающее меню, чтобы выбрать Plug shape. При необходимости отрегулируйте параметры размера и положения в соответствии с интересующей областью.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Важно максимально увеличить количество PDO в разъеме, а также исключить области, свободные от PDO, чтобы свести к минимуму фон. Назначьте размер подключаемого модуля, который будет последовательно захватывать большинство интересующих объектов в репликациях. Генерация заглушки, которая также исключает края купола, важна, поскольку она исключает любые объекты, которые могут казаться искаженными из-за преломления света из-за крайней кривизны купола по краям. Параметр «Включить первичные объекты ребер » также можно снять, чтобы захватывать только целые PDO в пределах вилки.
   2. Анализ субпопуляций. Пример обозначения субпопуляции приведен на рисунке 3.
      1. Щелкните Вычисляемые метрики (Calculated Metrics) на панели инструментов Клеточный анализ (Cellular Analysis). Нажмите кнопку Выбрать или создать интересующие метрики уровня объекта (правый угол, внизу). В разделе «Доступные метрики объектов» выберите интересующие вас метрики (например, цикличность) и нажмите кнопку «Вставить». Нажмите кнопку ОК.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Морфология и плотность каждой модели PDO определяют наилучшие метрики, представляющие интерес для различения субпопуляции.
      2. Щёлкните на Анализ субпопуляций (Subpopulation Analysis ) на панели инструментов Клеточный анализ (Cellular Analysis ). Нажмите кнопку Добавить , чтобы создать новую подпопуляцию. Откроется всплывающее окно.
      3. При необходимости введите имя для субпопуляции. В разделе Метрики объекта выберите интересующую метрику и нажмите кнопку Добавить условие. В окне "Редактировать условие " введите параметры для выбранной метрики объекта. При необходимости повторите эти действия с дополнительными метриками.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры могут быть настроены вручную или установлены с помощью инструмента Finder. Например, чтобы исключить мусор, пользователи могут добавить Площадь в качестве метрики объекта и выбрать объекты меньше 800. Цикличность в качестве объектной метрики обычно используется, и все объекты с округлостью больше 0,2–0,5 включаются в зависимости от модели.
      4. В таблице в нижней части окна отметьте нужные результаты для отображения. Нажмите кнопку ОК > Применить.
      5. Чтобы просмотреть объекты в пределах подпопуляции, используйте ниспадающее меню Сведения об объекте (правая панель, по центру), чтобы выбрать подпопуляцию. Объекты, попадающие под параметры, будут подсвечены на изображении.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы изменить цвета подсветки основной маски и подпопуляции, нажмите кнопку Настройки (правая панель, внизу).
      6. Чтобы настроить параметры субпопуляции, снова откройте окно Анализ подпопуляций (Subpopulation Analysis ) на панели инструментов Клеточный анализ (Cellular Analysis ). Выберите подпопуляцию и нажмите кнопку Редактировать. Нажмите кнопку Добавить шаг.
         ПРИМЕЧАНИЕ: При этом один и тот же анализ будет применен ко всем скважинам в рамках эксперимента во все моменты времени. В выпадающем меню на странице Матрица можно выбрать разные метрики для индивидуального просмотра.

5. Экспорт данных из Gen5 в Excel

1. Чтобы настроить файл данных для экспорта, выберите значок Report/Export Builders на панели инструментов. Во всплывающем окне нажмите кнопку Новый экспорт в Excel.
2. На странице «Свойства» всплывающего окна выберите «Область > пластину» и «Содержимое > Пользовательский». Нажмите на опцию «Содержимое» на панели инструментов. Нажмите «Редактировать шаблон», после чего откроется программа Excel.
3. В электронной таблице выберите Надстройки > Таблица > скважинные данные. Наведите курсор на различные выборки, чтобы увидеть параметры экспорта. Выберите интересующую метрику (например, Object Mean[ZProj[Tsf[TRITC]]]).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Компоновку пластин можно добавить в шаблон анализа электронных таблиц, выбрав Надстройки > Сводка протокола > Компоновка.
4. Откроется окно редактирования . В поле Скважины обозначьте скважины для экспорта либо по идентификатору скважины, либо по Скважине #. Нажмите кнопку ОК. Шаблон будет загружен в файл электронной таблицы. Закрыть электронную таблицу. Шаблон автоматически сохраняется.
5. Нажмите кнопку «ОК » в окне « Новый экспорт в Excel » и закройте окно «Построители отчетов/экспорта ».
6. Щелкните значок «Экспорт » на панели инструментов 5-го поколения. Поставьте галочку напротив нужного файла экспорта. Нажмите кнопку ОК. Поколение 5 автоматически заполнит шаблон электронной таблицы и откроет файл в Excel.

6. Анализ внешних данных

1. Откройте файл экспорта (.xlsx) в Excel.
2. Для каждой скважины разделите каждое отдельное значение на значение точки времени 0:00 для этой скважины. Это установит точку времени 0 равной 1, и каждое значение после этого будет относительным к первоначальному показанию.
3. Откройте новый файл в программе для анализа данных. Выберите вариант компоновки XY .
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе использовался GraphPad Prism (версия 9.5.1).
4. Входные метки для каждой группы данных. Скопируйте и вставьте временные точки и соответствующие нормализованные значения для каждой группы обработки в таблицу Prism. График для данных будет сгенерирован автоматически, и его можно найти в разделе Графики.

Результаты

Наша цель состояла в том, чтобы продемонстрировать возможность использования мультиплексной визуализации живых клеток для оценки терапевтического ответа PDO. Экспериментальные эксперименты были проведены на двух отдельных моделях рака эндометрия: ONC-10817 и ONC-10811 (см. Дополнительный...

Обсуждение

Культуры PDO становятся все более популярными модельными системами in vitro из-за их способности отражать клеточные реакции и поведение². Были достигнуты значительные успехи в генерации, культуре и методах расширения PDO, однако методы анализа терапевтических ответов отстают. К...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrfuge tube	Dot Scientific Inc	1008113
15 mL conical centrifuge tube	Sarstedt	62.554.100
554 NM LED Cube	Agilent	1225012
96-well plate	Corning Costar	3596	Prewarmed to 37 °C
96-well plate	Agilent	204626-100	Prewarmed to 37 °C
A83-01	Tocris	2939	Final concentration is 500 nM (component of organoid culture media)
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634-010	component of organoid culture media
B27 Supplement	Gibco	17504044	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
BioTek BioSpa 8 Automated Incubator	Agilent	BIOSPAG-SN	Tabletop incubator; BioSpa OnDemand scheduling software comunicates with Gen5 to transfer plates between the BioSpa and the Cytation 5 for imaging (this protocol uses version 1.01.10)
BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader	Agilent	CYT5PW-SN	Plate reader; Gen5 software is used for this device (this protocol uses version 3.12.08)
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract	R&D Systems	BME001-10
Daunorubicin HCl	Sigma-Aldrich	S3035	Reconstituted in DMSO
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2438
EDTA (0.5 M)	Thermo Fisher	AM9260G
Forskolin	Tocris	1099	Final concentration is 10 µM (component of organoid culture media)
Glutamax	Gibco	35050-061	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Human EGF, Animal-Free Recombinant Protein	Gibco	AF-100-15-1MG	Final concentration is 0.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Human FGF-10 Recombinant Protein	Gibco	100-26-1MG	Final concentration is 10 ng/mL (component of organoid culture media)
Human R-Spondin 1 Recombinant Protein	Gibco	120-38-5UG	Final concentration is 250 ng/mL (component of organoid culture media)
Hydrocortisone Stock Solution	StemCell Technologies	7926	Final concentration is 500 ng/mL (component of organoid culture media)
Imaging Filter Cube- GFP	Agilent	1225101
Imaging Filter Cube- TRITC	Agilent	1225125
Imaging LED GFP/CFP	Agilent	1225001
Incucyte Annexin V Red Dye	Sartorius	4641	Reconstituted in organoid culture media
Incucyte Cytotox Green Dye	Sartorius	4633	DMSO solution
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A7250	Final concentration is 1.25 mM (component of organoid culture media)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining Solution	Fisher-Scientific	13366169	Add 1:50 volume
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Noggin	R&D Systems	6057-NG	Final concentration is 100 ng/mL (component of organoid culture media)
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Final concentration is 10 units/mL (component of organoid culture media)
Phosphate Buffered Saline (1x)	Gibco	14190-144
Primocin	InvivoGen	ant-pm-05	Final concentration is 100 µg/mL (component of organoid culture media)
Recombinant Human Heregulinβ-1	Pepro Tech	100-03	Final concentration is 37.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Staurosporine solution from Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	S6942
TrypLE Express	Life Technologies	12604013
Y-27632, CAS 331752-47-7	Sigma-Aldrich	688000	Final concentration is 5 µM (component of organoid culture media)
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	Final concentration is 100 nM (component of organoid culture media)