قياس التغيرات الديناميكية في درجة الحموضة الجليكوزومية في المثقبيات الحية بروسي

Summary

وصفنا طريقة لدراسة كيفية استجابة الأس الهيدروجيني للإشارات البيئية في جليكوسومات مجرى الدم من المثقبيات الأفريقية. يتضمن هذا النهج مستشعر بروتين وراثي حساس لدرجة الحموضة مع قياس التدفق الخلوي لقياس ديناميكيات الأس الهيدروجيني ، سواء كفحص زمني أو في شكل شاشة عالية الإنتاجية.

Abstract

استقلاب الجلوكوز أمر بالغ الأهمية للمثقبيات الأفريقية ، المثقبية البروسية ، كعملية أيضية أساسية ومنظم لتطور الطفيليات. لا يعرف سوى القليل عن الاستجابات الخلوية المتولدة عندما تتغير مستويات الجلوكوز البيئية. في كل من مجرى الدم والطفيليات ذات الشكل الحلقي (مرحلة الحشرات) ، تحتوي الجليكوسومات على معظم تحلل السكر. يتم تحمض هذه العضيات بسرعة استجابة للحرمان من الجلوكوز ، مما يؤدي على الأرجح إلى التنظيم الخيفي للإنزيمات المحللة للسكر مثل هيكسوكيناز. في العمل السابق ، كان توطين المسبار الكيميائي المستخدم لإجراء قياسات الأس الهيدروجيني أمرا صعبا ، مما حد من فائدته في التطبيقات الأخرى.

تصف هذه الورقة تطور واستخدام الطفيليات التي تعبر عن pHluorin2 الموضعي جليكوسومي ، وهو مستشعر حيوي للبروتين يمكن توريثه. pHluorin2 هو متغير pHluorin نسبي يعرض انخفاضا يعتمد على الأس الهيدروجيني (الحمض) في الإثارة عند 395 نانومتر بينما ينتج عنه في نفس الوقت زيادة في الإثارة عند 475 نانومتر. تم إنشاء الطفيليات المعدلة وراثيا عن طريق استنساخ إطار القراءة المفتوح pHluorin2 في ناقل تعبير المثقبيات pLEW100v5 ، مما يتيح التعبير البروتيني المستحث في أي من مرحلتي دورة الحياة. تم استخدام التألق المناعي لتأكيد توطين الجليكوزوم للمستشعر الحيوي pHluorin2 ، ومقارنة توطين المستشعر الحيوي بالبروتين المقيم الجليكوزومي الألدولاز. تمت معايرة استجابة المستشعر عند مستويات مختلفة من الأس الهيدروجيني عن طريق احتضان الخلايا في سلسلة من المخازن المؤقتة التي تراوحت في الأس الهيدروجيني من 4 إلى 8 ، وهو نهج استخدمناه سابقا لمعايرة مستشعر الأس الهيدروجيني القائم على الفلوريسين. ثم قمنا بقياس مضان pHluorin2 عند 405 نانومتر و 488 نانومتر باستخدام قياس التدفق الخلوي لتحديد الرقم الهيدروجيني للجليكوزوم. لقد تحققنا من أداء الطفيليات الحية المعدلة وراثيا التي تعبر عن pHluorin2 ، ومراقبة درجة الحموضة بمرور الوقت استجابة للحرمان من الجلوكوز ، وهو محفز معروف لتحمض الجليكوزومات في طفيليات PF. تحتوي هذه الأداة على مجموعة من التطبيقات المحتملة ، بما في ذلك إمكانية استخدامها في فحص الأدوية عالي الإنتاجية. بالإضافة إلى درجة الحموضة الجليكوزومية ، يمكن تكييف المستشعر مع عضيات أخرى أو استخدامه في المثقبيات الأخرى لفهم ديناميكيات الأس الهيدروجيني في إعداد الخلية الحية.

Introduction

تعتمد الأراستيدات الحركية الطفيلية ، مثل معظم الكائنات الحية ، على الجلوكوز كمكون أساسي في استقلاب الكربون المركزي. تشمل هذه المجموعة الكائنات الحية المهمة طبيا ، مثل المثقبيات الأفريقية ، المثقبية البروسي. المثقبيات الأمريكية ، T. cruzi ؛ والطفيليات من جنس الليشمانيا. استقلاب الجلوكوز أمر بالغ الأهمية لنمو الطفيليات في مراحل دورة الحياة المسببة للأمراض. على سبيل المثال ، عند الحرمان من الجلوكوز ، يموت شكل مجرى الدم (BSF) من المثقبيات الأفريقية بسرعة. والجدير بالذكر أن تحلل السكر يعمل كمصدر وحيد ل ATP خلال هذه المرحلة من العدوى¹. تعتمد طفيليات الليشمانيا أيضا على الجلوكوز في المضيف البشري ، مع مرحلة دورة حياة amastigo....

Protocol

يتطلب استخدام T. brucei brucei 90-13 BSF trypanosomes ، وهو خط طفيلي أحادي الشكل ، النظر في السلامة لأنها تعتبر كائنات من مجموعة المخاطر 2 التي يجب التعامل معها في مرافق السلامة الأحيائية من المستوى 2.

1. ثقافة المثقبيات ونقلها

1. ثقافة T. brucei brucei 90-13 BSF المثقبيات في وسط HMI-9 مكمل ب 10٪ FBS معطل حراريا و 10٪ Nu-Serum عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO₂¹⁰.
   ملاحظة: للحفاظ على صحة المزرعة ، حافظ على كثافة الخلايا بين 2 × 10⁴ و 5 × 10⁶ خلايا / مل.
2. استنساخ pHluorin2-PTS1 إلى pLEW100v5
   1. توليف إطار القراءة المفتوح pHluorin2 تجاري....

النتائج

توطين pHLuorin2-PTS1 إلى الجليكوسومات في BSF T. brucei
لتقييم التوطين تحت الخلوي لل pHluorin2-PTS1 ، تعرضت الطفيليات لمقايسات التألق المناعي. إشارة من جين التحوير المتزامن مع الأمصال المضادة التي أثيرت ضد بروتين مقيم في الجليكوزوم ، ألدولاز (TbAldolase) (الشكل 2 أ). كان متوسط معامل ?.......

Discussion

إن آليات الإدراك والاستجابة البيئية في المثقبيات الأفريقية غير مفهومة بشكل جيد. من المعروف أن التغييرات في توافر المغذيات تؤدي إلى استجابات متنوعة في الطفيلي ، بما في ذلك تحمض الجليكوزومات. لقد وصفنا هنا طريقة لدراسة استجابة الأس الهيدروجيني الجليكوزومي للاضطرابات البيئية في الخلايا ال.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL Tissue Culture Flasks (Non-treated, sterile)	VWR	10861-572
75 cm2 Tissue Culture Flask (Non-Treated, sterile)	Corning	431464U
80 µL flat-bottom 384-well plate	BrandTech	781620
Amaxa Human T Cell Nucleofector  Kit	Lonza	VPA-1002
Attune NxT Flow Cytometer	invitrogen by Thermo Fisher Scientific	A24858	FlowJo software
BRANDplates 96-Well, flat bottom plate	Millipore Sigma	BR781662
Coloc 2 plugin of ImageJ			https://imagej.net/plugins/coloc-2
CytKick Max Auto Sampler	invitrogen by Thermo Fisher Scientific	A42973
CytoFLEX Flow Cytometer	Beckman-Coulter
Electron Microscopy Sciences 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade, 10 mL Ampoule	Fisher Scientific	50-980-487
GraphPad Prism			statistical software
Nigericin (sodium salt)	Cayman Chemical	11437
Nucleofector 2b	Lonza	Discontinued Product
OP2 Liquid Handler	opentrons	OP2
poly-L-lysine, 0.1% (w/v) in H2O	Sigma Life Science	CAS:25988-63-0	Pipetting robot for HTS assay
Thiazole Red (TO-PRO-3)	biotium	#40087	We machined a custom acrylic plate stand so this brand of plate could be detected and used on our CytKick Max Auto Sampler
valinomycin	Cayman Chemical	10009152	Pipetting robot for HTS assay
			For pH calibration
			For pH calibration