살아있는 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei)의 동적 당염색체 pH 변화 측정

요약

우리는 아프리카 트리파노솜의 혈류 형태의 글리코솜에서 pH가 환경 신호에 어떻게 반응하는지 연구하는 방법을 설명합니다. 이 접근법에는 pH 민감성 유전성 단백질 센서와 유세포 분석이 결합되어 시간 경과 분석 및 고처리량 스크리닝 형식으로 pH 역학을 측정하는 것이 포함됩니다.

초록

포도당 대사는 아프리카 트리파노솜인 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei)에 중요한 역할을 하며, 이는 기생충 발달의 필수 대사 과정이자 조절자입니다. 환경 포도당 수치가 변할 때 생성되는 세포 반응에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 혈류와 순환 형태(곤충 단계) 기생충 모두에서 글리코솜은 해당과정의 대부분을 수용합니다. 이러한 세포 기관은 포도당 결핍에 대한 반응으로 빠르게 산성화되며, 이는 헥소키나아제(hexokinase)와 같은 해당효소(glycolytic enzyme)의 알로스테릭 조절(allosteric regulation)을 초래할 수 있습니다. 이전 연구에서는 pH 측정에 사용되는 화학 프로브의 위치를 파악하는 것이 어려웠기 때문에 다른 Application에서의 유용성이 제한되었습니다.

이 논문은 유전성 단백질 pH 바이오센서인 글리코솜 국소화 pHluorin2를 발현하는 기생충의 개발 및 사용에 대해 설명합니다. pHluorin2는 395nm에서 pH(산)에 따른 여기(excitation) 감소를 나타내는 동시에 475nm에서 여기(excitation)를 증가시키는 비율계량 pHluorin 변형체입니다. 형질전환 기생충은 pHluorin2 open reading frame을 트리파노솜 발현 벡터 pLEW100v5로 클로닝하여 생성되었으며, 두 수명 주기 단계에서 유도 가능한 단백질 발현을 가능하게 했습니다. 면역형광을 사용하여 pHluorin2 바이오센서의 글리코솜 국소화를 확인하고, 바이오센서의 국소화를 글리코솜 상주 단백질 알돌라아제와 비교하였다. 센서 응답성은 pH 4에서 8 사이의 일련의 완충액에서 세포를 배양하여 다양한 pH 수준에서 보정되었으며, 이는 이전에 플루오레세인 기반 pH 센서를 보정하는 데 사용한 접근 방식입니다. 그런 다음 글리코솜 pH를 측정하기 위해 유세포 분석을 사용하여 405nm 및 488nm에서 pHluorin2 형광을 측정했습니다. 우리는 PF 기생충에서 글리코솜 산성화의 알려진 원인인 포도당 결핍에 대한 반응으로 시간 경과에 따른 pH를 모니터링하여 살아있는 형질전환 pHluorin2 발현 기생충의 성능을 검증했습니다. 이 도구는 고처리량 약물 스크리닝에 잠재적으로 사용되는 것을 포함하여 다양한 잠재적 응용 분야를 가지고 있습니다. 글리코솜 pH 외에도 센서를 다른 소기관에 적용하거나 다른 트리파노소마티드에 사용하여 살아있는 세포 환경에서 pH 역학을 이해할 수 있습니다.

서문

대부분의 살아있는 유기체와 마찬가지로 기생 키네토플라스티드는 중앙 탄소 대사의 기본 구성 요소로 포도당에 의존합니다. 이 그룹에는 아프리카 트리파노솜, Trypanosoma brucei와 같은 의학적으로 중요한 유기체가 포함됩니다.미국 트리파노솜, T. cruzi; 그리고 Leishmania 속의 기생충. 포도당 대사는 병원성 수명 주기 단계에서 기생충 성장에 매우 중요합니다. 예를 들어, 포도당이 결핍되면 아프리카 트리파노솜의 혈류 형태(BSF)가 빠르게 죽습니다. 특히, 해당과정(glycolysis)은 이 감염 단계에서 ATP의 유일한 공급원 역할을 한다¹. 리슈마니아 기생충도 마찬가지로 인간 숙주의 포도당에 의존하며, 숙주 대식세포에 상주하는 아마스티고테 수명 주기 단계는 성장을 위해 이 탄소원에 의존한다².

이 기생충은 다양한 곤충 매개체와 관련된 독특한 생활 방식을 가지고 있지만 포도당에 반응하고 섭취하는 방식에서 많은 공통점을 공유합니다. 예를 들어, 이러한 기생충은 대부분의 해당작용 효소를 글리코솜이라고 하는 변형된 과산화소체로 국소화합니다. 이 키네토플라스티드 특이적 세포소기관은 보존된 생합성 ....

프로토콜

단형 기생충 계통인 T. brucei brucei 90-13 BSF 트리파노솜을 사용하는 것은 생물안전 레벨 2 시설에서 취급해야 하는 위험 그룹 2 유기체로 간주되므로 안전성을 고려해야 합니다.

1. 트리파노솜 배양 및 형질주입

1. HMI-9 배지의 배양 T. brucei brucei 90-13 BSF 트리파노솜은 37°C에서 5%_CO2¹⁰에서 10% 열-비활성화 FBS 및 10% Nu-혈청으로 보충되었습니다.
   참고: 배양을 건강하게 유지하려면 세포 밀도를 2 × 10⁴ 와 5 × 10⁶ cells/mL 사이로 유지하십시오.
2. pHluorin2-PTS1을 pLEW100v5로 클로닝
   1. pHluorin2 개방형 판독 프레임을 상업적으로 합성하여 2개의 글리신 링커를 인코딩하는 3' 확장을 가진 유전자와 PTS1 국소화 태그인 트리펩타이드 AKL을 생성합니다.
   2. 이 작제물을 제한 분해에 의해 유도성 트리파노솜 발현 벡터 pLEW100v5로 클로닝합니다. HindIII 및 BamHI¹¹

토론

아프리카 트리파노솜의 환경 인식과 반응 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 영양소 가용성의 변화는 글리코솜의 산성화를 포함하여 기생충의 다양한 반응을 유발하는 것으로 알려져 있습니다. 여기에서는 유전성 단백질 센서, pHluorin2 및 유세포 분석을 사용하여 살아있는 세포의 환경 섭동에 대한 글리코솜 pH 반응을 연구하는 방법을 설명했습니다.

센서 사용에는 몇 가?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL Tissue Culture Flasks (Non-treated, sterile)	VWR	10861-572
75 cm2 Tissue Culture Flask (Non-Treated, sterile)	Corning	431464U
80 µL flat-bottom 384-well plate	BrandTech	781620
Amaxa Human T Cell Nucleofector  Kit	Lonza	VPA-1002
Attune NxT Flow Cytometer	invitrogen by Thermo Fisher Scientific	A24858	FlowJo software
BRANDplates 96-Well, flat bottom plate	Millipore Sigma	BR781662
Coloc 2 plugin of ImageJ			https://imagej.net/plugins/coloc-2
CytKick Max Auto Sampler	invitrogen by Thermo Fisher Scientific	A42973
CytoFLEX Flow Cytometer	Beckman-Coulter
Electron Microscopy Sciences 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade, 10 mL Ampoule	Fisher Scientific	50-980-487
GraphPad Prism			statistical software
Nigericin (sodium salt)	Cayman Chemical	11437
Nucleofector 2b	Lonza	Discontinued Product
OP2 Liquid Handler	opentrons	OP2
poly-L-lysine, 0.1% (w/v) in H2O	Sigma Life Science	CAS:25988-63-0	Pipetting robot for HTS assay
Thiazole Red (TO-PRO-3)	biotium	#40087	We machined a custom acrylic plate stand so this brand of plate could be detected and used on our CytKick Max Auto Sampler
valinomycin	Cayman Chemical	10009152	Pipetting robot for HTS assay
			For pH calibration
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