Mesure des changements dynamiques du pH glycosomal chez Trypanosoma brucei vivant

Résumé

Nous décrivons une méthode pour étudier comment le pH répond aux signaux environnementaux dans les glycosomes de la forme sanguine des trypanosomes africains. Cette approche implique une sonde de protéine héréditaire sensible au pH en combinaison avec la cytométrie en flux pour mesurer la dynamique du pH, à la fois en tant que test temporel et dans un format de criblage à haut débit.

Résumé

Le métabolisme du glucose est essentiel pour le trypanosome africain, Trypanosoma brucei, en tant que processus métabolique essentiel et régulateur du développement du parasite. On sait peu de choses sur les réponses cellulaires générées lorsque les niveaux de glucose environnementaux changent. Dans les parasites de la circulation sanguine et de la forme procyclique (stade d’insecte), les glycosomes abritent la majeure partie de la glycolyse. Ces organites sont rapidement acidifiés en réponse à la privation de glucose, ce qui entraîne probablement la régulation allostérique des enzymes glycolytiques telles que l’hexokinase. Dans les travaux précédents, la localisation de la sonde chimique utilisée pour effectuer les mesures de pH était difficile, ce qui limitait son utilité dans d’autres applications.

Cet article décrit le développement et l’utilisation de parasites qui expriment pHluorin2 localisée glycosomiquement, un biocapteur de pH protéique héréditaire. pHluorin2 est une variante ratiométrique de la pHluorin qui présente une diminution de l’excitation dépendante du pH (acide) à 395 nm tout en produisant simultanément une augmentation de l’excitation à 475 nm. Les parasites transgéniques ont été générés en clonant le cadre de lecture ouvert de pHluorin2 dans le vecteur d’expression du trypanosome pLEW100v5, permettant l’expression inductible de protéines à l’une ou l’autre étape du cycle de vie. L’immunofluorescence a été utilisée pour confirmer la localisation glycosomale du biocapteur pHluorin2, en comparant la localisation du biocapteur à la protéine résidente glycosomale aldolase. La réactivité de la sonde a été calibrée à différents niveaux de pH en incubant des cellules dans une série de tampons dont le pH variait de 4 à 8, une approche que nous avons déjà utilisée pour étalonner une sonde de pH à base de fluorescéine. Nous avons ensuite mesuré la fluorescence de pHluorin2 à 405 nm et 488 nm en utilisant la cytométrie en flux pour déterminer le pH glycosomal. Nous avons validé les performances des parasites transgéniques vivants exprimant pHluorin2, en surveillant le pH dans le temps en réponse à la privation de glucose, un déclencheur connu de l’acidification glycosomale chez les parasites PF. Cet outil a une gamme d’applications potentielles, y compris potentiellement utilisé dans le criblage de médicaments à haut débit. Au-delà du pH glycosomal, la sonde pourrait être adaptée à d’autres organites ou utilisée dans d’autres trypanosomatidés pour comprendre la dynamique du pH dans le cadre de cellules vivantes.

Introduction

Les kinétoplastides parasites, comme la plupart des organismes vivants, dépendent du glucose comme composant fondamental du métabolisme central du carbone. Ce groupe comprend des organismes médicalement importants, tels que le trypanosome africain, Trypanosoma brucei ; le trypanosome américain, T. cruzi ; et les parasites du genre Leishmania. Le métabolisme du glucose est essentiel à la croissance du parasite dans les stades du cycle de vie pathogène. Par exemple, lorsqu’il est privé de glucose, la forme sanguine (BSF) du trypanosome africain meurt rapidement. Notamment, la glycolyse est la seule source d’ATP à ce stade de l’infection

Protocole

L’utilisation de trypanosomes 90-13 BSF de T. brucei brucei , une lignée parasitaire monomorphe, nécessite une prise en compte de l’innocuité, car ils sont considérés comme des organismes du groupe de risque 2 qui doivent être manipulés dans des installations de niveau de biosécurité 2.

1. Culture et transfection de trypanosomes

1. Culture de trypanosomes T . brucei brucei 90-13 BSF en milieu HMI-9 complété par 10 % de FBS inactivé par la chaleur et 10 % de Nu-Serum à 37 °C dans 5 % de CO₂¹⁰.
   REMARQUE : Pour garder la culture en bonne santé, maintenez la densité....

Discussion

La perception environnementale et les mécanismes de réponse du trypanosome africain sont mal compris. Les changements dans la disponibilité des nutriments sont connus pour déclencher diverses réponses chez le parasite, y compris l’acidification des glycosomes. Ici, nous avons décrit une méthode pour étudier la réponse du pH glycosomal aux perturbations environnementales dans les cellules vivantes à l’aide d’un capteur de protéines héréditaires, pHluorin2, et de la cytométrie en flux.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL Tissue Culture Flasks (Non-treated, sterile)	VWR	10861-572
75 cm2 Tissue Culture Flask (Non-Treated, sterile)	Corning	431464U
80 µL flat-bottom 384-well plate	BrandTech	781620
Amaxa Human T Cell Nucleofector  Kit	Lonza	VPA-1002
Attune NxT Flow Cytometer	invitrogen by Thermo Fisher Scientific	A24858	FlowJo software
BRANDplates 96-Well, flat bottom plate	Millipore Sigma	BR781662
Coloc 2 plugin of ImageJ			https://imagej.net/plugins/coloc-2
CytKick Max Auto Sampler	invitrogen by Thermo Fisher Scientific	A42973
CytoFLEX Flow Cytometer	Beckman-Coulter
Electron Microscopy Sciences 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade, 10 mL Ampoule	Fisher Scientific	50-980-487
GraphPad Prism			statistical software
Nigericin (sodium salt)	Cayman Chemical	11437
Nucleofector 2b	Lonza	Discontinued Product
OP2 Liquid Handler	opentrons	OP2
poly-L-lysine, 0.1% (w/v) in H2O	Sigma Life Science	CAS:25988-63-0	Pipetting robot for HTS assay
Thiazole Red (TO-PRO-3)	biotium	#40087	We machined a custom acrylic plate stand so this brand of plate could be detected and used on our CytKick Max Auto Sampler
valinomycin	Cayman Chemical	10009152	Pipetting robot for HTS assay
			For pH calibration
			For pH calibration