Messung dynamischer glykosomaler pH-Änderungen bei lebenden Trypanosoma brucei

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode, um zu untersuchen, wie der pH-Wert auf Umweltreize in den Glykosomen der Blutkreislaufform afrikanischer Trypanosomen reagiert. Dieser Ansatz beinhaltet einen pH-sensitiven Sensor für vererbbare Proteine in Kombination mit Durchflusszytometrie zur Messung der pH-Dynamik, sowohl als Zeitverlaufsassay als auch in einem Hochdurchsatz-Screen-Format.

Zusammenfassung

Der Glukosestoffwechsel ist für das afrikanische Trypanosom, Trypanosoma brucei, als essentieller Stoffwechselprozess und Regulator der Parasitenentwicklung von entscheidender Bedeutung. Über die zellulären Reaktionen, die entstehen, wenn sich der Glukosespiegel in der Umwelt ändert, ist wenig bekannt. Sowohl in Parasiten im Blutkreislauf als auch in prozyklischer Form (Insektenstadium) beherbergen Glykosomen den größten Teil der Glykolyse. Diese Organellen werden als Reaktion auf Glukoseentzug schnell angesäuert, was wahrscheinlich zu einer allosterischen Regulation von glykolytischen Enzymen wie Hexokinase führt. In früheren Arbeiten war die Lokalisierung der chemischen Sonde, die zur Durchführung von pH-Messungen verwendet wird, eine Herausforderung, was ihren Nutzen in anderen Anwendungen einschränkte.

Diese Arbeit beschreibt die Entwicklung und Verwendung von Parasiten, die glykosomal lokalisiertes pHluorin2, einen vererbbaren Protein-pH-Biosensor, exprimieren. pHluorin2 ist eine ratiometrische pHluorin-Variante, die eine pH-abhängige (säureabhängige) Abnahme der Anregung bei 395 nm zeigt, während sie gleichzeitig eine Zunahme der Anregung bei 475 nm ergibt. Transgene Parasiten wurden durch Klonierung des offenen pHluorin2-Leserahmens in den Trypanosomen-Expressionsvektor pLEW100v5 erzeugt, was eine induzierbare Proteinexpression in beiden Lebenszyklusstadien ermöglicht. Immunfluoreszenz wurde verwendet, um die glykosomale Lokalisation des pHluorin2-Biosensors zu bestätigen, indem die Lokalisation des Biosensors mit der glykosomalen residenten Proteinaldolase verglichen wurde. Die Reaktionsfähigkeit des Sensors wurde bei unterschiedlichen pH-Werten kalibriert, indem Zellen in einer Reihe von Puffern mit einem pH-Wert von 4 bis 8 inkubiert wurden, ein Ansatz, den wir zuvor zur Kalibrierung eines pH-Sensors auf Fluoresceinbasis verwendet haben. Anschließend maßen wir die pHluorin2-Fluoreszenz bei 405 nm und 488 nm mittels Durchflusszytometrie zur Bestimmung des glykosomalen pH-Werts. Wir validierten die Leistung der lebenden transgenen pHluorin2-exprimierenden Parasiten und überwachten den pH-Wert im Laufe der Zeit als Reaktion auf Glukoseentzug, einen bekannten Auslöser der glykosomalen Ansäuerung bei PF-Parasiten. Dieses Tool hat eine Reihe potenzieller Anwendungen, einschließlich des potenziellen Einsatzes im Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening. Über den glykosomalen pH-Wert hinaus könnte der Sensor an andere Organellen angepasst oder in anderen Trypanosomatiden verwendet werden, um die pH-Dynamik in der lebenden Zellumgebung zu verstehen.

Einleitung

Parasitäre Kinetoplastiden sind wie die meisten lebenden Organismen auf Glukose als grundlegenden Bestandteil des zentralen Kohlenstoffstoffwechsels angewiesen. Zu dieser Gruppe gehören medizinisch wichtige Organismen wie das afrikanische Trypanosom Trypanosoma brucei; das amerikanische Trypanosom, T. cruzi; und Parasiten der Gattung Leishmania. Der Glukosestoffwechsel ist entscheidend für das Wachstum von Parasiten in den pathogenen Lebenszyklusstadien. Wenn beispielsweise Glukose entzogen wird, stirbt die Blutbahnform (BSF) des afrikanischen Trypanosoms schnell ab. Insbesondere dient die Glykolyse als einzige ATP-Quelle in diesem Stadium d....

Protokoll

Die Verwendung von T. brucei brucei 90-13 BSF-Trypanosomen, einer monomorphen Parasitenlinie, erfordert eine Berücksichtigung der Sicherheit, da sie als Organismen der Risikogruppe 2 gelten, die in Einrichtungen der Biosicherheitsstufe 2 gehandhabt werden sollten.

1. Trypanosomenkultur und Transfektion

1. Kultur T. brucei brucei 90-13 BSF-Trypanosomen in HMI-9-Medium, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS und 10 % Nu-Serum bei 37 °C in 5 % CO₂¹⁰.
   HINWEIS: Um die Kultur gesund zu halten, halten Sie die Zelldichte zwischen 2 × 10⁴ und 5 × 10⁶

Diskussion

Die Umweltwahrnehmung und die Reaktionsmechanismen im afrikanischen Trypanosom sind kaum verstanden. Es ist bekannt, dass Veränderungen der Nährstoffverfügbarkeit verschiedene Reaktionen im Parasiten auslösen, einschließlich der Ansäuerung von Glykosomen. Hier haben wir eine Methode zur Untersuchung der glykosomalen pH-Reaktion auf Umweltstörungen in lebenden Zellen unter Verwendung eines vererbbaren Proteinsensors, pHluorin2, und Durchflusszytometrie beschrieben.

Bei der Verwendung des.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL Tissue Culture Flasks (Non-treated, sterile)	VWR	10861-572
75 cm2 Tissue Culture Flask (Non-Treated, sterile)	Corning	431464U
80 µL flat-bottom 384-well plate	BrandTech	781620
Amaxa Human T Cell Nucleofector  Kit	Lonza	VPA-1002
Attune NxT Flow Cytometer	invitrogen by Thermo Fisher Scientific	A24858	FlowJo software
BRANDplates 96-Well, flat bottom plate	Millipore Sigma	BR781662
Coloc 2 plugin of ImageJ			https://imagej.net/plugins/coloc-2
CytKick Max Auto Sampler	invitrogen by Thermo Fisher Scientific	A42973
CytoFLEX Flow Cytometer	Beckman-Coulter
Electron Microscopy Sciences 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade, 10 mL Ampoule	Fisher Scientific	50-980-487
GraphPad Prism			statistical software
Nigericin (sodium salt)	Cayman Chemical	11437
Nucleofector 2b	Lonza	Discontinued Product
OP2 Liquid Handler	opentrons	OP2
poly-L-lysine, 0.1% (w/v) in H2O	Sigma Life Science	CAS:25988-63-0	Pipetting robot for HTS assay
Thiazole Red (TO-PRO-3)	biotium	#40087	We machined a custom acrylic plate stand so this brand of plate could be detected and used on our CytKick Max Auto Sampler
valinomycin	Cayman Chemical	10009152	Pipetting robot for HTS assay
			For pH calibration
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