测量布氏活锥虫的动态糖体 pH 值变化

摘要

我们描述了一种研究pH值如何响应非洲锥虫血液形式糖体中环境线索的方法。该方法涉及将pH敏感的可遗传蛋白传感器与流式细胞术相结合，以测量pH动态，既可以作为时程测定，也可以作为高通量筛选形式。

摘要

葡萄糖代谢对非洲锥虫 布氏锥虫至关重要，它是寄生虫发育的重要代谢过程和调节剂。关于环境葡萄糖水平变化时产生的细胞反应知之甚少。在血流和前环形式（昆虫阶段）寄生虫中，糖体容纳了大部分糖酵解。这些细胞器在葡萄糖剥夺的作用下迅速酸化，这可能导致糖酵解酶（如己糖激酶）的变构调节。在以前的工作中，用于进行pH测量的化学探针的定位具有挑战性，限制了其在其他应用中的实用性。

本文描述了表达糖体定位pHluorin2（一种可遗传的蛋白质pH生物传感器）的寄生虫的开发和使用。pHluorin2 是一种比率 pHluorin 变体，在 395 nm 处显示 pH（酸）依赖性激发降低，同时在 475 nm 处产生激发增加。通过将 pHluorin2 开放阅读框克隆到锥虫表达载体 pLEW100v5 中来产生转基因寄生虫，从而在任一生命周期阶段实现诱导蛋白表达。免疫荧光用于确认 pHluorin2 生物传感器的糖体定位，将生物传感器的定位与糖体驻留蛋白醛缩酶进行比较。通过在一系列pH值范围为4至8的缓冲液中孵育细胞，在不同的pH值水平下校准传感器的响应性，我们以前曾使用这种方法来校准基于荧光素的pH传感器。然后，我们使用流式细胞术测量 405 nm 和 488 nm 处的 pHluorin2 荧光，以确定糖体 pH 值。我们验证了表达pHluorin2的活转基因寄生虫的性能，监测pH值随时间的变化以响应葡萄糖剥夺，这是PF寄生虫中糖体酸化的已知触发因素。该工具具有一系列潜在应用，包括可能用于高通量药物筛选。除了糖体pH值之外，该传感器还可以适用于其他细胞器或用于其他锥虫，以了解活细胞环境中的pH动态。

引言

与大多数生物体一样，寄生动质体依赖于葡萄糖作为中枢碳代谢的基本成分。该组包括具有重要医学意义的生物，例如非洲锥虫， 布氏锥虫; 美国锥虫， 克氏锥虫; 和 利什曼原虫 属的寄生虫。葡萄糖代谢对寄生虫在致病生命周期阶段的生长至关重要。例如，当被剥夺葡萄糖时，非洲锥虫的血流形式（BSF）会迅速死亡。值得注意的是，糖酵解是感染这一阶段^ATP 的唯一来源 1。利什曼原虫寄生虫同样依赖于人类宿主中的葡萄糖，宿主巨噬细胞中的无鞭毛体生命周期阶段依赖于这种碳源的生长²。

虽然这些寄生虫具有不同的生活方式，涉及不同的昆虫媒介，但它们在如何反应和消耗葡萄糖方面有许多共同点。例如，这些寄生虫将大多数糖酵解酶定位到称为糖体的修饰过氧化物酶体中。这种动质体特异性细胞器与哺乳动物过氧化物酶体有关，基于保守的生物合成机制和形态 3,4,5,6。

大多数糖酵解途径酶的区室化为糖体提供了寄生虫特异性的途径调节手段。使用化学 pH 探针，我们确定营养剥夺....

研究方案

使用 布氏布氏锥 虫 90-13 BSF 锥虫（一种单态寄生虫系）需要考虑安全性，因为它们被认为是风险组 2 生物，应在生物安全 2 级设施中处理。

1. 锥虫培养和转染

1. 在 37 °C 的 5% CO₂¹⁰ 中，在 HMI-9 培养基中培养布氏布氏锥虫 90-13 BSF 锥虫。
   注意：为了保持培养物健康，请将细胞密度保持在 2 × 10⁴ 和 5 × 10⁶ 个细胞/mL 之间。
2. 将 pHluorin2-PTS1 克隆到 pLEW100v5 中
   1. 商业合成 pHluorin2 开放阅读框，以产生具有编码双甘氨酸接头的 3' 延伸的基因，然后是三肽 AKL（PTS1 定位标签）。
   2. 通过限制性酶切将该构建体克隆到诱导型锥虫表达载体 pLEW100v5 中。使用 HindIII 和 BamHI¹¹ 双重消化含有 pHluorin2-PTS1 和 pLEW100v5 的克隆载体。执行纯化步骤，优选通过琼脂糖凝胶纯化，以去除限制性内切酶、不需要的克隆载体骨架和切除的荧光素酶含基因片段。
   3. 将携带 pHluorin2 的插入片段与 T4 DNA 连接酶

讨论

对非洲锥虫的环境感知和反应机制知之甚少。众所周知，营养可用性的变化会引发寄生虫的各种反应，包括糖体的酸化。在这里，我们描述了一种使用可遗传蛋白质传感器、pHluorin2 和流式细胞术研究活细胞中糖体 pH 值对环境扰动的反应的方法。

传感器的使用有几个关键步骤。首先，表达转基因的转染寄生虫的表征很重要，因为表达可能存在细胞间差异。一些转基因的表达水.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL Tissue Culture Flasks (Non-treated, sterile)	VWR	10861-572
75 cm2 Tissue Culture Flask (Non-Treated, sterile)	Corning	431464U
80 µL flat-bottom 384-well plate	BrandTech	781620
Amaxa Human T Cell Nucleofector  Kit	Lonza	VPA-1002
Attune NxT Flow Cytometer	invitrogen by Thermo Fisher Scientific	A24858	FlowJo software
BRANDplates 96-Well, flat bottom plate	Millipore Sigma	BR781662
Coloc 2 plugin of ImageJ			https://imagej.net/plugins/coloc-2
CytKick Max Auto Sampler	invitrogen by Thermo Fisher Scientific	A42973
CytoFLEX Flow Cytometer	Beckman-Coulter
Electron Microscopy Sciences 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade, 10 mL Ampoule	Fisher Scientific	50-980-487
GraphPad Prism			statistical software
Nigericin (sodium salt)	Cayman Chemical	11437
Nucleofector 2b	Lonza	Discontinued Product
OP2 Liquid Handler	opentrons	OP2
poly-L-lysine, 0.1% (w/v) in H2O	Sigma Life Science	CAS:25988-63-0	Pipetting robot for HTS assay
Thiazole Red (TO-PRO-3)	biotium	#40087	We machined a custom acrylic plate stand so this brand of plate could be detected and used on our CytKick Max Auto Sampler
valinomycin	Cayman Chemical	10009152	Pipetting robot for HTS assay
			For pH calibration
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