Medindo as alterações dinâmicas do pH glicossomal em Trypanosoma brucei vivo

Resumo

Descrevemos um método para estudar como o pH responde a pistas ambientais nos glicossomas da forma sanguínea de tripanossomas africanos. Essa abordagem envolve um sensor de proteína hereditária sensível ao pH em combinação com citometria de fluxo para medir a dinâmica do pH, tanto como um ensaio de curso de tempo quanto em um formato de tela de alto rendimento.

Resumo

O metabolismo da glicose é crítico para o tripanossoma africano, Trypanosoma brucei, como um processo metabólico essencial e regulador do desenvolvimento do parasita. Pouco se sabe sobre as respostas celulares geradas quando os níveis de glicose ambiental se alteram. Tanto na corrente sanguínea quanto na forma pró-cíclica (estágio de inseto) parasitas, os glicossomas abrigam a maior parte da glicólise. Essas organelas são rapidamente acidificadas em resposta à privação de glicose, o que provavelmente resulta na regulação alostérica de enzimas glicolíticas como a hexoquinase. Em trabalhos anteriores, localizar a sonda química usada para fazer medições de pH foi um desafio, limitando sua utilidade em outras aplicações.

Este trabalho descreve o desenvolvimento e o uso de parasitas que expressam pHluorina glicossomicamente localizada2, um biossensor de pH de proteína hereditária. A pHluorina2 é uma variante ratiométrica da pHluorina que apresenta uma diminuição da excitação dependente do pH (ácido) a 395 nm, ao mesmo tempo que produz um aumento da excitação a 475 nm. Parasitas transgênicos foram gerados pela clonagem do quadro de leitura aberta pHluorin2 no vetor de expressão de tripanossomas pLEW100v5, permitindo a expressão de proteínas induzíveis em ambos os estágios do ciclo de vida. A imunofluorescência foi utilizada para confirmar a localização glicossomal do biossensor pHluorin2, comparando a localização do biossensor com a aldolase da proteína residente no glicossomo. A responsividade do sensor foi calibrada em diferentes níveis de pH incubando as células em uma série de tampões que variaram em pH de 4 a 8, uma abordagem que usamos anteriormente para calibrar um sensor de pH baseado em fluoresceína. Em seguida, medimos a fluorescência da pHluorina2 a 405 nm e 488 nm usando citometria de fluxo para determinar o pH glicossomal. Validamos o desempenho dos parasitas transgênicos vivos que expressam pHluorina2, monitorando o pH ao longo do tempo em resposta à privação de glicose, um conhecido gatilho da acidificação glicossomal em parasitas PF. Esta ferramenta tem uma gama de aplicações potenciais, incluindo potencialmente ser usada na triagem de drogas de alto rendimento. Além do pH glicossomal, o sensor pode ser adaptado a outras organelas ou usado em outros tripanosomatídeos para entender a dinâmica do pH no ambiente de células vivas.

Introdução

Os cinetoplastídeos parasitas, como a maioria dos organismos vivos, dependem da glicose como um componente fundamental do metabolismo central do carbono. Este grupo inclui organismos medicamente importantes, como o tripanossoma africano, Trypanosoma brucei; o tripanossoma americano, T. cruzi; e parasitas do gênero Leishmania. O metabolismo da glicose é crítico para o crescimento do parasita nos estágios do ciclo de vida patogênico. Por exemplo, quando privado de glicose, a forma sanguínea (BSF) do tripanossoma africano morre rapidamente. Notadamente, a glicólise serve como única fonte de ATP durante esse estágio da infecção^....

Protocolo

O uso de tripanossomas de T. brucei brucei 90-13 BSF, uma linhagem de parasitas monomórficos, requer consideração de segurança, pois são considerados organismos do Grupo de Risco 2 que devem ser manuseados em instalações de nível de biossegurança 2.

1. Cultura e transfecção de tripanossomas

1. Cultura de tripanossomas de T. brucei brucei 90-13 BSF em meio HMI-9 suplementado com 10% de SFB inativado pelo calor e 10% de Nu-soro a 37 °C em 5% de CO^{2 10}.
   NOTA: Para manter a cultura saudável, mantenha a densidade celular entre 2 × 10⁴ e 5 × 10⁶ ....

Discussão

A percepção ambiental e os mecanismos de resposta no tripanossoma africano são pouco compreendidos. Sabe-se que alterações na disponibilidade de nutrientes desencadeiam diversas respostas no parasita, incluindo acidificação de glicossomas. Aqui, descrevemos um método para estudar a resposta do pH glicossomal a perturbações ambientais em células vivas usando um sensor de proteína hereditária, pHluorin2, e citometria de fluxo.

Existem várias etapas críticas no uso do sensor. Prime.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL Tissue Culture Flasks (Non-treated, sterile)	VWR	10861-572
75 cm2 Tissue Culture Flask (Non-Treated, sterile)	Corning	431464U
80 µL flat-bottom 384-well plate	BrandTech	781620
Amaxa Human T Cell Nucleofector  Kit	Lonza	VPA-1002
Attune NxT Flow Cytometer	invitrogen by Thermo Fisher Scientific	A24858	FlowJo software
BRANDplates 96-Well, flat bottom plate	Millipore Sigma	BR781662
Coloc 2 plugin of ImageJ			https://imagej.net/plugins/coloc-2
CytKick Max Auto Sampler	invitrogen by Thermo Fisher Scientific	A42973
CytoFLEX Flow Cytometer	Beckman-Coulter
Electron Microscopy Sciences 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade, 10 mL Ampoule	Fisher Scientific	50-980-487
GraphPad Prism			statistical software
Nigericin (sodium salt)	Cayman Chemical	11437
Nucleofector 2b	Lonza	Discontinued Product
OP2 Liquid Handler	opentrons	OP2
poly-L-lysine, 0.1% (w/v) in H2O	Sigma Life Science	CAS:25988-63-0	Pipetting robot for HTS assay
Thiazole Red (TO-PRO-3)	biotium	#40087	We machined a custom acrylic plate stand so this brand of plate could be detected and used on our CytKick Max Auto Sampler
valinomycin	Cayman Chemical	10009152	Pipetting robot for HTS assay
			For pH calibration
			For pH calibration