Misurazione delle variazioni dinamiche del pH glisomiale nel Trypanosoma brucei vivente

Riepilogo

Descriviamo un metodo per studiare come il pH risponde ai segnali ambientali nei glicosomi della forma del flusso sanguigno dei tripanosomi africani. Questo approccio prevede l'utilizzo di un sensore di proteine ereditarie sensibile al pH in combinazione con la citometria a flusso per misurare la dinamica del pH, sia come saggio del corso temporale che in un formato di schermo ad alto rendimento.

Abstract

Il metabolismo del glucosio è fondamentale per il tripanosoma africano, Trypanosoma brucei, come processo metabolico essenziale e regolatore dello sviluppo del parassita. Poco si sa sulle risposte cellulari generate quando i livelli di glucosio ambientale cambiano. Sia nei parassiti del flusso sanguigno che in forma prociclica (stadio di insetto), i glicosomi ospitano la maggior parte della glicolisi. Questi organelli vengono rapidamente acidificati in risposta alla privazione di glucosio, che probabilmente si traduce nella regolazione allosterica degli enzimi glicolitici come l'esochinasi. Nel lavoro precedente, localizzare la sonda chimica utilizzata per effettuare misurazioni di pH era difficile, limitandone l'utilità in altre applicazioni.

Questo articolo descrive lo sviluppo e l'uso di parassiti che esprimono pHluorin2 glicosomialmente localizzato, un biosensore di pH proteico ereditabile. pHluorin2 è una variante raziometrica della pHluorin che mostra una diminuzione dell'eccitazione dipendente dal pH (acido) a 395 nm e contemporaneamente produce un aumento dell'eccitazione a 475 nm. I parassiti transgenici sono stati generati clonando il frame di lettura aperto di pHluorin2 nel vettore di espressione del tripanosoma pLEW100v5, consentendo l'espressione di proteine inducibili in entrambe le fasi del ciclo di vita. L'immunofluorescenza è stata utilizzata per confermare la localizzazione glicosale del biosensore pHluorin2, confrontando la localizzazione del biosensore con la proteina aldolasi glicosale residente. La risposta del sensore è stata calibrata a diversi livelli di pH incubando le cellule in una serie di tamponi che variavano in pH da 4 a 8, un approccio che abbiamo precedentemente utilizzato per calibrare un sensore di pH a base di fluoresceina. Abbiamo quindi misurato la fluorescenza di pHluorin2 a 405 nm e 488 nm utilizzando la citometria a flusso per determinare il pH glicosomiale. Abbiamo validato le prestazioni dei parassiti transgenici vivi che esprimono pHluorin2, monitorando il pH nel tempo in risposta alla deprivazione di glucosio, un noto fattore scatenante dell'acidificazione glicosale nei parassiti PF. Questo strumento ha una serie di potenziali applicazioni, tra cui il potenziale utilizzo nello screening dei farmaci ad alto rendimento. Oltre al pH glicosomiale, il sensore potrebbe essere adattato ad altri organelli o utilizzato in altri tripanosomatidi per comprendere la dinamica del pH nel contesto delle cellule vive.

Introduzione

I cinetoplastidi parassiti, come la maggior parte degli organismi viventi, si basano sul glucosio come componente fondamentale del metabolismo centrale del carbonio. Questo gruppo comprende organismi importanti dal punto di vista medico, come il tripanosoma africano, Trypanosoma brucei; il tripanosoma americano, T. cruzi; e parassiti del genere Leishmania. Il metabolismo del glucosio è fondamentale per la crescita del parassita nelle fasi del ciclo di vita dei patogeni. Ad esempio, quando viene privato del glucosio, la forma del flusso sanguigno (BSF) del tripanosoma africano muore rapidamente. In particolare, la glicolisi funge da unica fon....

Protocollo

L'utilizzo di t. brucei brucei 90-13 BSF tripanosomi, una linea di parassiti monomorfi, richiede considerazioni di sicurezza in quanto sono considerati organismi del gruppo di rischio 2 che dovrebbero essere maneggiati in strutture di livello di biosicurezza 2.

1. Coltura e trasfezione del tripanosoma

1. Coltura di T. brucei brucei 90-13 tripanosomi BSF in terreno HMI-9 integrati con il 10% di FBS inattivato al calore e il 10% di Nu-Serum a 37 °C in 5% di CO₂¹⁰.
   NOTA: Per mantenere la coltura sana, mantenere la densità cellulare tra 2 × 10⁴ e 5 × 10

Discussione

La percezione ambientale e i meccanismi di risposta nel tripanosoma africano sono poco compresi. È noto che i cambiamenti nella disponibilità di nutrienti innescano diverse risposte nel parassita, inclusa l'acidificazione dei glicosomi. Qui, abbiamo descritto un metodo per studiare la risposta del pH glicosomiale alle perturbazioni ambientali nelle cellule viventi utilizzando un sensore di proteine ereditabili, pHluorin2 e citometria a flusso.

Ci sono diversi passaggi critici nell'uso del se.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL Tissue Culture Flasks (Non-treated, sterile)	VWR	10861-572
75 cm2 Tissue Culture Flask (Non-Treated, sterile)	Corning	431464U
80 µL flat-bottom 384-well plate	BrandTech	781620
Amaxa Human T Cell Nucleofector  Kit	Lonza	VPA-1002
Attune NxT Flow Cytometer	invitrogen by Thermo Fisher Scientific	A24858	FlowJo software
BRANDplates 96-Well, flat bottom plate	Millipore Sigma	BR781662
Coloc 2 plugin of ImageJ			https://imagej.net/plugins/coloc-2
CytKick Max Auto Sampler	invitrogen by Thermo Fisher Scientific	A42973
CytoFLEX Flow Cytometer	Beckman-Coulter
Electron Microscopy Sciences 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade, 10 mL Ampoule	Fisher Scientific	50-980-487
GraphPad Prism			statistical software
Nigericin (sodium salt)	Cayman Chemical	11437
Nucleofector 2b	Lonza	Discontinued Product
OP2 Liquid Handler	opentrons	OP2
poly-L-lysine, 0.1% (w/v) in H2O	Sigma Life Science	CAS:25988-63-0	Pipetting robot for HTS assay
Thiazole Red (TO-PRO-3)	biotium	#40087	We machined a custom acrylic plate stand so this brand of plate could be detected and used on our CytKick Max Auto Sampler
valinomycin	Cayman Chemical	10009152	Pipetting robot for HTS assay
			For pH calibration
			For pH calibration