Canlı Trypanosoma brucei'de Dinamik Glikozomal pH Değişikliklerinin Ölçülmesi

Özet

PH'ın, Afrika tripanozomlarının kan dolaşımı formunun glikozomlarındaki çevresel ipuçlarına nasıl tepki verdiğini incelemek için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yaklaşım, pH dinamiklerini ölçmek için akış sitometrisi ile birlikte pH'a duyarlı kalıtsal bir protein sensörünü hem zaman seyri tahlili olarak hem de yüksek verimli bir ekran formatında içerir.

Özet

Glikoz metabolizması, Afrika tripanozomu, Trypanosoma brucei, temel bir metabolik süreç ve parazit gelişiminin düzenleyicisi olarak kritik öneme sahiptir. Çevresel glikoz seviyeleri değiştiğinde oluşan hücresel tepkiler hakkında çok az şey bilinmektedir. Hem kan dolaşımında hem de prosiklik formda (böcek evresi) parazitlerde, glikozomlar glikolizin çoğunu barındırır. Bu organeller, glikoz yoksunluğuna yanıt olarak hızla asitleştirilir, bu da muhtemelen hekzokinaz gibi glikolitik enzimlerin allosterik regülasyonuna neden olur. Önceki çalışmalarda, pH ölçümleri yapmak için kullanılan kimyasal probun lokalizasyonu zordu ve diğer uygulamalardaki kullanımını sınırlıyordu.

Bu makale, kalıtsal bir protein pH biyosensörü olan glikozomal olarak lokalize pHluorin2'yi eksprese eden parazitlerin gelişimini ve kullanımını açıklamaktadır. pHluorin2, 395 nm'de uyarmada pH'a (asit) bağlı bir azalma gösteren ve aynı anda 475 nm'de uyarmada bir artış sağlayan bir oransal pHluorin varyantıdır. Transgenik parazitler, pHluorin2 açık okuma çerçevesinin tripanozom ekspresyon vektörü pLEW100v5'e klonlanmasıyla üretildi ve her iki yaşam döngüsü aşamasında da indüklenebilir protein ekspresyonu sağlandı. pHluorin2 biyosensörünün glikozomal lokalizasyonunu doğrulamak için immünofloresan kullanıldı ve biyosensörün lokalizasyonunu glikozomal yerleşik protein aldolaz ile karşılaştırdı. Sensörün yanıt verme hızı, daha önce floresein bazlı bir pH sensörünü kalibre etmek için kullandığımız bir yaklaşım olan pH değeri 4 ile 8 arasında değişen bir dizi tamponda hücrelerin inkübe edilmesiyle farklı pH seviyelerinde kalibre edildi. Daha sonra glikozomal pH'ı belirlemek için akış sitometrisi kullanarak 405 nm ve 488 nm'de pHluorin2 floresansını ölçtük. PF parazitlerinde bilinen bir glikozomal asitleşme tetikleyicisi olan glikoz yoksunluğuna yanıt olarak zaman içinde pH'ı izleyerek canlı transgenik pHluorin2 eksprese eden parazitlerin performansını doğruladık. Bu araç, potansiyel olarak yüksek verimli ilaç taramasında kullanılmak da dahil olmak üzere bir dizi potansiyel uygulamaya sahiptir. Sensör, glikozomal pH'ın ötesinde, canlı hücre ortamındaki pH dinamiklerini anlamak için diğer organellere uyarlanabilir veya diğer tripanosomatidlerde kullanılabilir.

Giriş

Parazitik kinetoplastidler, çoğu canlı organizma gibi, merkezi karbon metabolizmasının temel bir bileşeni olarak glikoza güvenir. Bu grup, Afrika tripanozomu, Trypanosoma brucei gibi tıbbi açıdan önemli organizmaları içerir;Amerikan tripanozomu, T. cruzi; ve Leishmania cinsinin parazitleri. Glikoz metabolizması, patojenik yaşam döngüsü aşamalarında parazit büyümesi için kritik öneme sahiptir. Örneğin, glikozdan yoksun bırakıldığında, Afrika tripanozomunun kan dolaşımı formu (BSF) hızla ölür. Özellikle, glikoliz, enfeksiyonun bu aşamasında ATP'nin tek kaynağı olarak hizmet eder¹. Leishmania parazitleri de aynı şekilde....

Protokol

Monomorfik bir parazit hattı olan T. brucei brucei 90-13 BSF tripanozomlarının kullanılması, biyogüvenlik seviyesi 2 tesislerinde ele alınması gereken Risk Grubu 2 organizmaları olarak kabul edildiğinden güvenliğin dikkate alınmasını gerektirir.

1. Tripanozom kültürü ve transfeksiyonu

1. Kültür T. brucei brucei 90-13 BSF tripanozomları, HMI-9 ortamında% 10 ısıyla inaktive edilmiş FBS ve% 10 Nu-Serum ile% 5 CO₂¹⁰ içinde 37 ° C'de.
   NOT: Kültürü sağlıklı tutmak için hücre yoğunluğunu 2 × 10⁴ ve 5 × 10⁶ hücre/mL arasında tutun.
2. pHluor....

Tartışmalar

Afrika tripanozomundaki çevresel algı ve tepki mekanizmaları tam olarak anlaşılamamıştır. Besin mevcudiyetindeki değişikliklerin, glikozomların asitlenmesi de dahil olmak üzere parazitte çeşitli tepkileri tetiklediği bilinmektedir. Burada, kalıtsal bir protein sensörü, pHluorin2 ve akış sitometrisi kullanarak canlı hücrelerdeki çevresel bozulmalara glikozomal pH tepkisini incelemek için bir yöntem tanımladık.

Sensörün kullanımında birkaç kritik adım vardır. İ.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL Tissue Culture Flasks (Non-treated, sterile)	VWR	10861-572
75 cm2 Tissue Culture Flask (Non-Treated, sterile)	Corning	431464U
80 µL flat-bottom 384-well plate	BrandTech	781620
Amaxa Human T Cell Nucleofector  Kit	Lonza	VPA-1002
Attune NxT Flow Cytometer	invitrogen by Thermo Fisher Scientific	A24858	FlowJo software
BRANDplates 96-Well, flat bottom plate	Millipore Sigma	BR781662
Coloc 2 plugin of ImageJ			https://imagej.net/plugins/coloc-2
CytKick Max Auto Sampler	invitrogen by Thermo Fisher Scientific	A42973
CytoFLEX Flow Cytometer	Beckman-Coulter
Electron Microscopy Sciences 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade, 10 mL Ampoule	Fisher Scientific	50-980-487
GraphPad Prism			statistical software
Nigericin (sodium salt)	Cayman Chemical	11437
Nucleofector 2b	Lonza	Discontinued Product
OP2 Liquid Handler	opentrons	OP2
poly-L-lysine, 0.1% (w/v) in H2O	Sigma Life Science	CAS:25988-63-0	Pipetting robot for HTS assay
Thiazole Red (TO-PRO-3)	biotium	#40087	We machined a custom acrylic plate stand so this brand of plate could be detected and used on our CytKick Max Auto Sampler
valinomycin	Cayman Chemical	10009152	Pipetting robot for HTS assay
			For pH calibration
			For pH calibration