الفحص المجهري ثنائي الفوتون داخل الجسم للورم الأرومي الدبقي في نموذج الفئران

Summary

نقدم نهجا جديدا للفحص المجهري ثنائي الفوتون لتوصيل الورم لجسيمات أكسيد الحديد النانوية ذات العلامات الفلورية إلى الورم الأرومي الدبقي في نموذج الفأر.

Abstract

يقتصر توصيل علاجات السرطان التي يتم إعطاؤها عن طريق الوريد إلى أورام المخ على الحاجز الدموي الدماغي. إن طريقة لتصوير تراكم وتوزيع الجزيئات الكبيرة بشكل مباشر في أورام المخ في الجسم الحي من شأنها أن تعزز بشكل كبير قدرتنا على فهم وتحسين توصيل الأدوية في النماذج قبل السريرية. يصف هذا البروتوكول طريقة للتتبع في الوقت الحقيقي في الجسم الحي للجسيمات النانوية الفلورية التي يتم إعطاؤها عن طريق الوريد باستخدام المجهر داخل الفوتون ثنائي الفوتون (2P-IVM) في نموذج فأر من الورم الأرومي الدبقي (GBM).

يحتوي البروتوكول على وصف متعدد الخطوات للإجراء ، بما في ذلك التخدير وتسكين التجارب ، وإنشاء نافذة الجمجمة ، وزرع خلايا GBM ، ووضع قضيب الرأس ، وإجراء دراسات 2P-IVM ، والرعاية بعد الجراحة لدراسات المتابعة طويلة الأجل. نعرض جلسات تصوير 2P-IVM التمثيلية وتحليل الصور ، ونفحص مزايا وعيوب هذه التقنية ، ونناقش التطبيقات المحتملة.

يمكن تعديل هذه الطريقة وتكييفها بسهولة لأسئلة بحثية مختلفة في مجال تصوير الدماغ قبل السريري في الجسم الحي .

Introduction

الفحص المجهري ثنائي الفوتون داخل الجسم (2P-IVM) هو تقنية تصوير مضان تسمح بتصور الأنسجة الحية¹.

تم تطوير 2P-IVM لأول مرة في تسعينيات القرن العشرين ، وقد استخدم في تحليل في الجسم الحي لشبكية العين² ، والكلى³ ، والأمعاء الدقيقة⁴ ، والقوقعة⁵ ، والقلب⁶ ، والقصبة الهوائية^{7 ،} والدماغ في مختلف النماذج قبل السريرية ^8,9. في مجال علم الأعصاب ، اكتسب 2P-IVM أهمية كتقنية للتصوير في الوقت الفعلي للدماغ السليم في المستيقظة¹⁰ ، بالإضافة إلى دراسة أمراض الجهاز العصبي مثل مرض الزهايمر¹¹ وباركنسون¹² والورم الأرومي الدبقي (GBM) ^{13،14،15،16.}

يقدم 2P-IVM حلا أنيقا لدراسة البيئة المكروية للورم أثناء تطوير GBM. بينما ركزت بعض الدراسات السابقة على النماذج في المختبر¹⁷ وخارج الجسم ^{الحي 18} ، نفذ البعض الآخر نماذج orthotopic¹⁹ و xenotropic²⁰ في الجسم الحي لفحص GBM. أجرى مادن وآخرون تصويرا أصليا لخط خلايا الورم الدبقي للفئران CNS-1 في نموذج^{فأر 13}. باستخدام نموذج الفئران GL261-DsRed التقويمي ، أجرى Ricard et al. إعطاء الفلوروفور عن طريق الوريد لتعزيز الأوعية الدموية في منطقة الورم في 2P-IVM¹⁴.

هنا ، نطبق 2P-IVM لتتبع توصيل الورم لجسيمات أكسيد الحديد النانوية الموسومة بالفلورسنت (NP) في نموذج ماوس تقويم العظام من GBM. باستخدام نافذة الجمجمة ، تسمح لنا هذه الطريقة بدراسة التوزيع الزماني المكاني في الوقت الفعلي ل NPs في الدماغ بالتفصيل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

يتوافق الإجراء الحيواني الموصوف في هذا البروتوكول مع متطلبات الفريق الإداري لرعاية المختبر (APLAC).

1. ثقافة الخلية

1. إعداد غطاء محرك السيارة
   1. اغسل يديك وارتد قفازات ومعطف مختبر. قم بتشغيل خزانة السلامة البيولوجية واضبط مستوى الوشاح على ارتفاع الفتح المناسب. دع غطاء المحرك يطهر لمدة 3-5 دقائق. رش منطقة غطاء المحرك بنسبة 70٪ من الإيثانول وامسحها بالمناديل الورقية.
   2. رش جميع الكواشف مع الإيثانول 70 ٪ وامسح مع المناديل الورقية. انقل الكواشف إلى الغطاء. لا تضع أي عناصر على الشواية. في حالة حدوث انسكاب في الغطاء ، قم بتغطيته بمناديل ، ورشه بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وامسحه مرة أخرى.
   3. بعد التجربة ، أغلق أغطية كل عنصر بعناية ، وامسح جميع المواد ، وأزل أي عناصر من الغطاء ، وانقلها إلى موقعها الأصلي. رش 70 ٪ من الإيثانول في غطاء المحرك وامسحه. أغلق الوشاح وأوقف تشغيل خزانة السلامة البيولوجية.
2. إعداد وسط النمو
   1. أضف 50 مل من مصل البقر الجنيني 100٪ (FBS) إلى 500 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM). أضف 5 مل من محلول مضاد حيوي مضاد حيوي (100x).
   2. مرر جميع الكواشف من خلال زجاجة ترشيح معقمة سعة 500 مل (مرشح 0.22 ميكرومتر).
3. ذوبان الخلايا المحفوظة بالتبريد
   1. في غطاء التدفق الصفحي ، أضف 20 مل من وسط النمو إلى دورق T75. قم بتسمية القارورة باسم الخلايا والتاريخ ورقم المقطع على الدورق. في هذه الدراسة ، تم استخدام خلايا الورم الدبقي C6 الملتصقة.
   2. قم بإذابة الخلايا بسرعة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. لا دوامة الخلايا. ذوبان الجليد واستخدام الخلايا على الفور.
   3. انقل الخلايا المذابة إلى قارورة T75 باستخدام طرف ماصة سعة 1 مل. احرص على عدم إدخال أي فقاعات أثناء عملية النقل ، وتجنب أي بقايا متوسطة في عنق القارورة. هذا يمكن أن يزيد من خطر التلوث المحتمل.
4. تغيير الوسيط
   1. قم بتغيير الوسط في اليوم التالي للذوبان لإزالة أي تربسين متبقي أو ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) (الخطوة 1.6). بعد ذلك ، قم بتغيير الوسيط مرتين على الأقل في الأسبوع أو أكثر ، اعتمادا على مستوى التقاء الخلية. يجب تغيير الوسط بعد يوم واحد من المرور للتخلص من التربسين.
   2. لتغيير الوسط ، قم بتشغيل جهاز الشفط ، وقم بتوصيل ماصة زجاج الشفط ، واستنشق كل الوسائط.
   3. أضف 20 مل من وسط النمو (الخطوة 1.2).
5. تمرير الخلايا
   1. قم بتحميل غطاء المحرك بالعناصر اللازمة أثناء التجربة.
   2. استخدم ماصة زجاجية للشفط وقم بشفط جميع الوسائط ، مع التأكد من أن الماصة الزجاجية على الجانب غير الخلوي من القارورة. في هذه الخطوة ، ضع قارورة T75 عموديا.
   3. أضف ~ 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات بدرجة حرارة الغرفة (RT) (خال من PBS و Ca⁺⁺ و Mg ⁺⁺⁾ أو محلول ملح هانكس المتوازن (HBSS و Ca ⁺⁺ و Mg ⁺⁺ مجانا) على الجانب غير الخلوي. اغسل الخلايا لفترة وجيزة باستخدام برنامج تلفزيوني عن طريق وضع قارورة T75 أفقيا بحيث يكون جانب الخلية متجها لأسفل.
   4. ضع القارورة عموديا على الفور واستنشق PBS / HBSS. كرر هذا الغسيل والشفط 3 مرات.
   5. أضف 2 مل من التربسين (المؤتلف أو المشتق من) على جانب الخلية (قارورة T75 أفقية ، جانب الخلية متجها لأسفل). احتضان في حاضنة زراعة الأنسجة القياسية (37 درجة مئوية، 5٪ CO₂) لمدة 4 دقائق. سحنها مرة واحدة بعد 2 دقيقة باستخدام ماصة 5 مل.
   6. بعد 4 دقائق من الحضانة الكلية ، انقل المحلول إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. أضف 8 مل من محلول النمو إلى الأنبوب المخروطي (2 مل من الخلايا التربسينية + 8 مل من الوسط = 10 مل في المجموع).
   7. استخدم أنبوبا مخروطيا فارغا آخر سعة 15 مل مع مرشح وانقل الخلايا عبر ماصة سعة 25 مل لتحقيق خلايا فردية.
   8. انقل 1/10 (1 مل) من المحلول (خلية + وسائط + Tryp-LE) إلى دورق T75 مع 20 مل من الوسائط. بدلا من ذلك، عد الخلايا (الخطوة 1.7). قم بتغيير الوسائط في اليوم التالي للحصول على حل وسائط غير التربسين.
6. تجميد الوسط والخلايا
   1. قم بإذابة الثلج بنسبة 100٪ FBS في ثلاجة على حرارة 4 درجات مئوية. لا تستخدم حمام مائي أو حرارة لأن ذلك قد يتلف البروتينات الموجودة في FBS.
   2. لتحضير 50 مل من وسائط التجميد ، امزج 45 مل من DMEM و 5 مل من FBS و 5 مل من DMSO. قسمة إلى حاويات 1-2 مل لمنع ذوبان الجليد المتقطع وتلف البروتين. تخزينها في الفريزر -20 درجة أو -80 درجة مئوية.
   3. بالنسبة إلى ال 9 مل المتبقية من المحلول (الخطوة 1.5) ، أضف 1 مل من الوسط للوصول إلى 10 مل إجمالا. جهاز طرد مركزي عند 300 × جرام لمدة 4 دقائق.
   4. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليقها في 1 مل من وسط التجميد (انظر أعلاه). ضع الخلايا في وعاء تجميد في الفريزر -80 درجة مئوية. انقل الخلايا إلى السائل N₂ للتخزين طويل الأجل بعد 1 أو 2 أيام.
7. عد الخلايا
   1. بالنسبة إلى ال 9 مل المتبقية (الخطوة 1.5) ، أضف 1 مل من الوسائط للوصول إلى إجمالي 10 مل. جهاز طرد مركزي عند 300 × جرام لمدة 4 دقائق.
   2. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليقها في 4 مل من HBSS. أعد تعليق 10 ميكرولتر من الخلايا في 80 ميكرولتر من HBSS + 10 ميكرولتر من 0.4٪ تريبان بلو ، عامل التخفيف = 10.
   3. خذ 17 ميكرولتر من المحلول وعد أربعة مربعات 4 × 4 في مقياس الدم. متوسط التهم للمربعات الأربعة 4 × 4 واضربها في 10⁴× عامل تخفيف للحصول على خلايا / مل.

2. الجراحة

ملاحظة: يوصى بإجراء الجراحة من قبل باحثين ، حيث يكون شخص واحد مسؤولا عن تحضير الخلايا ، وخلط الأسمنت السني ، والمساعدة بشكل عام في الإجراء ، بينما يركز الشخص الثاني على البقاء معقما. إن وجود مناور ثان للمساعدة في الإجراء الجراحي يقلل بشكل كبير من احتمالية حدوث التلوث. اتباع أفضل الممارسات الجراحية من شأنه أن يقلل من فرص حدوث مضاعفات ما بعد الجراحة. يقدم الشكل 1 أ نظرة عامة على مكونات نافذة الجمجمة.

1. الاستعدادات العامة
   1. تأكد من أن الإجراء معتمد من قبل الإرشادات المؤسسية المحلية لرعاية قبل البدء.
      ملاحظة: استخدمت هذه الدراسة إناث فئران NSG البالغة من العمر 5 أشهر (NOD. Cg-Prkdcscid il2rgtm1Wjl/SzJ) (ن = 5).
   2. قبل الجراحة ، الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية والتأكد من توفر جميع الإمدادات اللازمة. طباعة سجلات التخدير والجراحة.
   3. تأكد من أنه عند الوصول ، يكون لدى ما لا يقل عن 1 أسبوع من التأقلم مع غرفة تربية لتقليل الضائقة الإضافية بعد الجراحة.
   4. في يوم الجراحة ، تأكد من أن جميع الأجهزة (المجهر ، وسادة التدفئة ، المعقم ، الحفر ، الفراغ ، إلخ) جاهزة للاستخدام. تأكد من أن آلة التخدير تحتوي على ما يكفي من الأيزوفلوران وإعادة تعبئتها إذا لزم الأمر. بالنسبة للمستخدمين الجدد ، يمكن أن يستغرق إجراء نافذة الجمجمة ما يصل إلى 2 ساعة لكل ؛ لذلك ، وجود ما يكفي من الأيزوفلوران أمر بالغ الأهمية.
   5. ضع النوافذ الزجاجية وقضبان الرأس في الكحول وقم بإعداد وعاء به محلول ملحي. سيضمن ذلك سير عمل سلس دون أي انتهاكات كبيرة في العقم والحفاظ على الوقت تحت التخدير لكل أقصر ما يمكن.
   6. افتح جميع المواد الجراحية على سطح معقم في محطة العمل. على سبيل المثال ، يمكن استخدام الجزء الداخلي من عبوة شاش معقمة لهذا الغرض. استخدم تقنية النصائح فقط. عند عدم استخدام الأدوات الجراحية ، ضع النصائح على سطح معقم ، مثل داخل عبوة الشاش المعقم.
   7. عند إجراء عمليات جراحية متعددة ، ضع جميع الأدوات الجراحية في جهاز التعقيم بين العمليات الجراحية لتطهيرها. عند إجراء العمليات الجراحية على أكثر من 5 ، استخدم مجموعة جديدة من أدوات التعقيم. قم بتبديل طرف الحفر عندما يصبح حادا لآخر جديد لتجنب صدمة الأنسجة.
2. التخدير والاستعدادات للجراحة
   ملاحظة: إعداد التخدير مطابق للجراحة ، وكذلك للتصوير.
   1. تخدير الفأر باستخدام الأيزوفلوران (3٪ -5٪ للتحريض) في غرفة التخدير. بعد التأكد من عمق التخدير الكافي عن طريق اختبار منعكس سحب الدواسة (قرصة وسادة القدم على كلتا القدمين الخلفيتين) ، انقل إلى محطة عمل التحضير. الحفاظ على التخدير على مخروط الأنف (1٪ -2٪). هنا ، ضع مرهم العين لمنع تلف القرنية. السيطرة بانتظام على فقدان ردود الفعل أثناء الجراحة عن طريق التحقق من منعكس مخلب.
   2. إذا كان هناك حاجة إلى أي تحديد للحيوان ، فاستخدم أداة لكمة الأذن أو مقص لتمييز الأذنين أو استخدم علامة لتمييز الذيل.
   3. إزالة الفراء الذي يغطي الجمجمة بين الأذنين والعينين مع كريم مزيل الشعر. اترك الكريم طالما هو موضح (30-60 ثانية) من قبل الشركة المصنعة لتجنب تهيج الجلد. تأكد من أن الكريم يتلامس مع جذور الشعر عن طريق تطبيقه عكس اتجاه نمو الشعر. تجنب أن يتلامس كريم مزيل الشعر مع العينين. إزالة أي كريم وبقايا الشعر عن طريق تنظيف المنطقة بالمحلول الملحي. بدلا من ذلك ، استخدم كليبرز .
   4. لتجنب أي ألم أو عدوى أو تورم أثناء وبعد الجراحة ، يتم تطبيق العقاقير غير الستيرويدية المضادة للالتهابات (NSAIDs) والمواد الأفيونية والعوامل المضادة للالتهابات والمضادات الحيوية. يجب تطبيق كاربروفين (5-20 ملغ/ كغ، تحت الجلد [SQ])، البوبرينورفين - إطلاق مستمر (1 ملغ/ كغ بالقدم المربع)، سيفازولين (20 ملغ/كغ ب SQ)، والديكساميثازون (0.2 ملغ/كغ ب SQ) قبل الجراحة. يتم تطبيق حوالي 0.3 مل من محلول ملحي 0.9٪ لتجنب الجفاف.
   5. بعد ذلك ، فرك المنطقة عن طريق مسح بوفيدون اليود وكحول الأيزوبروبيل بالتناوب ثلاث مرات في حركات دائرية من منتصف الجمجمة إلى المحيط.
3. إجراء حج القحف
   1. نقل إلى طاولة الجراحة ووضعه في راقد بطني على وسادة التدفئة (~ 37 °C) لضمان ظروف متساوية الحرارة أثناء العملية. انخفاض حرارة الجسم في القوارض يقلل بشكل كبير من معدلات البقاء على قيد الحياة ويطيل مرحلة الانتعاش بعد الجراحة.
   2. ضع الرأس في إطار التجسيم عن طريق وضع قضبان الأذن وقضبان القاطعة. بالنسبة لقضبان الأذن ، ابحث عن القوس الوجني وأدخل القضبان خلف الأقواس. ابدأ بتأمين الشريط المقابل باليد المهيمنة (على سبيل المثال ، قم بتأمين الشريط الأيسر بيدك اليمنى إذا كنت تستخدم يدك اليمنى) ثم قم بتأمين الجانب الآخر. اضبط مواضع الأذن والقضبان القاطعة عن طريق تدوير البراغي إذا لزم الأمر.
   3. أعد وضع مرهم العين إذا لزم الأمر ، واستخدم قطعة من ورق الألمنيوم لتغطية العينين. سيمنع ذلك أي ضرر ناتج عن ضوء المجهر الساطع وضوء الأشعة فوق البنفسجية المستخدم لعلاج غراء cyanoacrylate لاحقا (الخطوة 2.5).
   4. قبل شق ، تحقق مرة أخرى من منعكس قرصة إصبع القدم. إذا لزم الأمر ، اضبط التخدير وفقا لذلك. قم بتوصيل بجهاز مراقبة التخدير عن طريق وضع المستشعر على مخلب الخلفي. سيساعد قياس معدل ضربات القلب وتركيز الأكسجين في الدم على تقليل الوفيات وتحسين التعافي بعد الجراحة. بالإضافة إلى ذلك ، احصل على معدل التنفس عن طريق فحص حركة الصدر بصريا.
   5. تغطية جسم مع ستارة لتجنب انخفاض حرارة الجسم والتلوث. قم بإجراء مسحة أخيرة من البوفيدون واليود قبل بدء الجراحة.
   6. ارتد قفازات ومعطف مختبر نظيف.
      ملاحظة: يتم تشجيع استخدام القفازات المعقمة بسبب غزو الإجراء ولتقليل خطر الإصابة بأي عدوى والتهاب بعد الجراحة مما يؤدي إلى المراضة وفقدان جودة الصورة في 2P-IVM (القسم 5).
   7. ارفع الجلد على الجمجمة وقم بعمل شق عن طريق إمساك المقص بين العين اليمنى والأذن وقطعه باتجاه الجانب الأيسر من الجمجمة بعد علامات الشق. قم بإزالة رفرف الجلد المستدير الناتج.
      ملاحظة: اعتمادا على المنطقة ذات الاهتمام في الدماغ وحجم النافذة ، يمكن أن يختلف موقع الشق وقطره. يجب أن يكون حجم الشق أكبر من قطر الرأس لاستيعاب مساحة للتركيب (الخطوة 2.5). إذا لزم الأمر ، يمكن تشريح الجلد المحيط بالشق بلطف لخلق مساحة أكبر.
   8. قم بإزالة السمحاق عن طريق خدش سطح الجمجمة برفق بشفرة مشرط أو microcurrette. توخي الحذر عند إزالة السمحاق حول الغرز القحفية لأن تلك المناطق هشة وأكثر عرضة للنزيف. استخدم محلول ملحي وفراغ للحفاظ على نظافة منطقة الجراحة من الحطام. خدش السمحاق لضمان التصاق أفضل بغراء cyanoacrylate والأسمنت السني (الخطوة 2.5)
   9. تحديد منطقة الدماغ لإجراء حقن الخلية. لهذا ، استخدم أطلس الإحداثيات التجسيمية لدماغ الفأر. وفقا لإحداثيات الدماغ ، حدد موضع نافذة الجمجمة باستخدام لكمة خزعة بنفس قطر النافذة أو قلم جراحي أو قلم رصاص معقم.
   10. امسك المثقاب في اليد المهيمنة وأي أداة أخرى (حقنة ، ملقط) في اليد غير المهيمنة. تجنب الحفر لفترات طويلة في نفس المكان. يجب استخدام المثقاب في رشقات نارية لتجنب ارتفاع درجة الحرارة. خلال هذه الاستراحات ، ضع محلول ملحي بارد على الكالفلاريوم للحفاظ على نظافة المنظر الجراحي ولمنع ارتفاع درجة الحرارة. استخدم التغذية المرتدة الحسية من طرف الحفر لاكتشاف متى تم ثقب الجمجمة بالكامل.
   11. استخدم محلول ملحي بارد ، مع فراغ ، لتنظيف سطح الجمجمة. لا تستخدم الشاش أو قضيب طرف القطن بعد فتح الكالفايريوم لأن بقايا خيوط القطن قد تؤدي إلى رد فعل جسم غريب عند إغلاق نافذة الدماغ.
   12. أثناء الحفر ، تأكد من أن المسار والقطر بنفس حجم الغطاء الزجاجي. قم بذلك عن طريق وضع الغطاء الزجاجي أعلى الجمجمة والتأكد من أن الغطاء الزجاجي سوف يتناسب تماما مع نافذة الجمجمة.
   13. بمجرد أن يصبح من الممكن الضغط على رفرف الجمجمة بالضغط عليه برفق ، استخدم الملقط لإزالة الشظية بعناية من المجال الجراحي (الشكل 1 ب ، يسار). إذا لم يكن من الممكن بعد الضغط على الجمجمة ، فاستمر في الحفر في مناطق نافذة الجمجمة التي لا تزال متصلة ببقية الجمجمة وأعد التقييم.
   14. في حالة حدوث نزيف بسيط ، استخدم إسفنجة مرقئ مع ضغط خفيف أو بدلا من ذلك ، محلول ملحي بارد مثلج ، للمساعدة في تقليل فقد الدم.
4. زرع الخلايا
   1. قم بإعداد وعد الخلايا المراد زرعها كما هو موضح في (الخطوة 1.7). تأكد من أن رقم الخلية هو 200000 خلية / ميكرولتر.
      ملاحظة: يوصى بتعليق الخلايا في مصفوفة غشائية تتصلب عند RT. سيؤدي ذلك إلى تحسين معدل نجاح الخلايا المزروعة في حمة الدماغ.
   2. نقل الخلايا في وعاء مع الثلج إلى غرفة الجراحة. استخدم حقنة ميكرولتر محكمة الغلق. قبل الشفط ، احتفظ بالمحقنة على الجليد لتجنب الاختلافات في درجات الحرارة.
   3. بعد شفط 1 ميكرولتر ، ضع المحقنة داخل إطار التجسيم.
      ملاحظة: يمكن استخدام جهاز إحداثيات تجسيمي آلي يوضح المواضع في المحاور X و Y و Z لتوفير الوقت. من الممكن أيضا حساب المواضع يدويا بناء على lambda. لا ينصح بحقن أكثر من 1.5 ميكرولتر. سيضمن ذلك عدم ملء المنطقة المحقونة بشكل مفرط ، مما يتسبب في زرع غير ناجح ، أو نمو خارج حمة الدماغ ، أو النقائل.
   4. إجراء عملية زرع في منطقة V2MM (القشرة البصرية 2 ، الجزء المتوسط الإنسي) من الدماغ ، والتي تتوافق تقريبا مع الإنسي إلى الجانبي (M-L): -1.2 إلى -1.6 مم ، والظهرية إلى البطنية (D-V): -2.6 إلى -3.5 مم إحداثيات.
      1. بالنسبة للتصوير ثنائي الفوتون (الخطوة 4.6) ، قم بزرع الخلايا في مناطق الدماغ السطحية بحيث يمكن تصور كتلة الورم من خلال نافذة الجمجمة لاحقا. حقن 0.5 ميكرولتر (100000 خلية) في الأمام إلى الخلف (A-P): عمق 0.8 مم. حرك الإبرة ببطء ، بطريقة تدريجية ، عند دخول الدماغ وانتظر لمدة 30 ثانية بعد الحقن (الشكل 1 ب ، العمود الأوسط).
      2. استخدم نفس النهج عند سحب الإبرة والخروج من أنسجة المخ. تجنب الحقن بالقرب من البطينين لأن السائل الدماغي النخاعي قد يشجع النقائل في الجهاز العصبي المركزي والمحيطي.
5. إغلاق نافذة الجمجمة
   1. حرك قضيب الرأس والغطاء الزجاجي من الكحول إلى محلول ملحي. استخدم طرف فراغ أو ملقط للتنقل بين هذه المكونات إلى موقع الجراحة.
   2. ضع الغطاء الزجاجي داخل نافذة الجمجمة وضع كمية صغيرة من غراء cyanoacrylate بين الجمجمة وغطاء الغطاء الزجاجي. يقلل غراء cyanoacrylate المنشط بالأشعة فوق البنفسجية من وقت المعالجة ويتجنب الإزاحة العرضية. في حالة انسكاب أي غراء على الغطاء الزجاجي ، قم بإزالته باستخدام قضيب بطرف قطني أو عن طريق خدشه برفق بالجانب الحاد من المشرط قبل أن يشفى تماما.
      تنبيه: الأشعة فوق البنفسجية ضارة بالعينين والجلد. تجنب ملامسة العين والجلد أثناء علاج الغراء.
   3. بعد تأمين الغطاء الزجاجي في نافذة الجمجمة ، ضع شريط الرأس. امزج الأسمنت السني المكون من عنصرين ، وضع قضيب الرأس ، وضع الأسمنت على المنطقة المحيطة ، مع ضمان التلامس بين الجمجمة وقضيب الرأس. قم بتنظيف أي أسمنت زائد عن الحاجة بعناية باستخدام طرف حقنة أو مشرط أو طرف حفر.
      ملاحظة: يتجمد الأسمنت السني بسرعة كبيرة ، لذلك ينصح بتطبيقه في الوقت المناسب.
   4. بعد إغلاق نافذة الجمجمة ، حدد ما إذا كانت أي مناطق جمجمة بين الأسمنت السني والجلد لا تزال مكشوفة. إذا كان الأمر كذلك ، ضع الغراء الجراحي لتغطية الجمجمة عن طريق إغلاق الجلد. بدلا من ذلك ، قم بإجراء خياطة واحدة بمادة خياطة قابلة للامتصاص.

3. الشفاء بعد الجراحة ونمو الورم

1. الانتعاش
   1. راقب على وسادة ساخنة في قفص التعافي حتى يستعيد وعيه الكامل. إيواء بشكل منفصل بعد الجراحة لتقليل خطر الإصابة.
   2. إدارة نظام غذائي للتعافي، مثل المواد الهلامية المائية المتاحة تجاريا مع الشوارد أو السكريات. بدلا من ذلك ، قم بتوفير طعام مختبر قياسي مبلل لضمان سهولة التغذية وتجنب الجفاف ونقص السكر في الدم.
2. رصد
   1. عند الشفاء ، راقب يوميا بحثا عن علامات الألم أو الضيق أو العدوى. إذا لزم الأمر ، قم بتطبيق المسكنات أو الأدوية المضادة للالتهابات أو المضادات الحيوية. إذا وصل إلى نقطة نهاية الدراسة ، فقم بالقتل الرحيم بشكل إنساني. بعد جلسة التصوير النهائية ، القتل الرحيم للفأر عن طريق الاختناق بثاني أكسيد الكربون ، يليه خلع عنق الرحم.
      ملاحظة: تشمل أمثلة معايير القتل الرحيم المبكر على سبيل المثال لا الحصر فقدان الوزن بشكل كبير (>20٪) أو الاضطرابات العصبية أو ضيق التنفس أو النزيف المفرط أثناء الجراحة أو السلوك النمطي الواضح. افحص نافذة الجمجمة وقم بتنظيفه بالمحلول الملحي أو الكحول عند الضرورة.
   2. لتتبع نمو الورم وتخطيط النقاط الزمنية للتصوير، قم بإجراء تصوير التلألؤ الحيوي لكامل الجسم (BLI). لهذا الغرض، حقن 150 ملغ/كغ د-لوسيفيرين داخل الصفاق وتصوير بعد 5-15 دقيقة.

4. تخليق الجسيمات النانوية

1. تحضير الجسيمات
   1. أضف 11.17 مل من فيروموكسيتول (6 مليمول من الحديد في المجموع) إلى محلول يحتوي على 50 مل من 5 M NaOH و 20 مل من الماء منزوع الأيونات (ماء DI) و 20 مل من epichlorohydrin. مراقبة فصل الطور في هذه المرحلة. احتضان الخليط في RT تحت هز لطيف لمدة 24 ساعة.
   2. بعد 24 ساعة ، يصبح الحل موحدا. قم بإزالة epichlorohydrin الزائد باستخدام أنابيب غسيل الكلى (قطع 12000-14000 دا) ضد الماء لمدة 3 أيام.
   3. بعد غسيل الكلى ، انقل المحلول المتبقي في الأنبوب إلى زجاجة زجاجية (الحجم الكلي ~ 110 مل). أضف 30 مل من هيدروكسيد الأمونيا ، وحرك الخليط على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 18-20 ساعة.
   4. بعد التقليب ، كرر غسيل الكلى ضد الماء لمدة 3 أيام. انقل المحلول المتبقي في أنبوب غسيل الكلى إلى زجاجة زجاجية جديدة بحجم إجمالي ~ 110 مل.
2. اقتران الفلوريسئين إيزوثيوسيانات (FITC)
   1. أخرج 27.5 مل من الجسيمات الوظيفية بالأمين لاقتران FITC. ركز الجسيمات باستخدام مرشح طرد مركزي فائق 10 كيلو دالتون واغسلها بمحلول درجة الحموضة 9 (Na₂CO₃ / NaHCO₃) عند 5752 × جم عند 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
   2. أضف 4 مل من المحلول إلى المرشح وجهاز الطرد المركزي الفائق الأنبوب عند 5752 × جم عند 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. تخلص من المرشح وأعد ملء الفلتر بمخزن مؤقت لجولة ثانية من الغسيل بنفس البروتوكول.
   3. تجاهل المرشح وجمع الحل في المرشح باستخدام ماصة. تقدير التركيز المولي للجسيم بتركيز كتلة فيروموكسيتول ، بافتراض أن قطر كل جسيم هو 5 نانومتر.
   4. قم بإذابة FITC في ثنائي ميثيل سلفوكسيد اللامائي (DMSO) عند 10 مجم / مل. أضف ببطء 1.4 مل من FITC المذاب DMSO إلى الجسيمات المركزة التي تعمل بالأمين. النسبة المولية ل FITC: الجسيمات هي 20: 1. بعد ذلك ، احتضان الحل عند 4 درجات مئوية لمدة 8 ساعات في الظلام.
   5. إخماد رد الفعل عن طريق إضافة NH₃ الزائدة. H₂O (التركيز النهائي ل NH₃. H₂O هو 50 mM) ، ثم اترك المحلول يبقى عند 4 درجات مئوية في الظلام لمدة ساعتين. اغسل FITC الزائد باستخدام المخزن المؤقت Na₂CO₃ / NaHCO₃ (pH 9) من خلال مرشح 10 كيلو دالتون عند 5752 × جم عند 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. يتم ضبط الأس الهيدروجيني النهائي للمحلول إلى 7.4 باستخدام محلول مائي حمض الهيدروكلوريك.

5. 2P-IVM

ملاحظة: بالنسبة لجلسات 2P-IVM ، تم استخدام مجهر Prairie Ultima IV مع مرحلة مخصصة (الشكل 2 وملف الترميز التكميلي 1) الذي يسمح بضبط موضع نافذة الجمجمة أفقيا وعموديا. واستخدمت برمجيات فيجي للتجهيز اللاحق وتحليل الصور. بهذه الطريقة ، يمكن ضبط شعاع الليزر لضرب الزجاج بزاوية 90 درجة ، مما يقلل من القطع الأثرية ويحسن جودة التصوير.

1. جلسة تصوير
   1. قم بتشغيل ليزر Ti-Sapphire . قم بتشغيل مفتاح النظام الرئيسي وبرنامج Prairie View.
   2. تخدير ، كما هو موضح أعلاه (الخطوة 2.2). إجراء جلسات التصوير لمدة تصل إلى 2 ساعة لكل. حافظ على وقت التصوير إلى الحد الأدنى لتقليل خطر مضاعفات التخدير والمراضة أو الوفيات المرتبطة بها.
   3. شل حركة الماوس تحت المجهر ثنائي الفوتون باستخدام مرحلة مخصصة (الشكل 1 ب ، العمود الأيمن). ضع في وضعية الانبطاح على وسادة ساخنة مصممة لجراحة القوارض وقم بتثبيته برفق باستخدام شريط لاصق مع الانتباه إلى عدم تضييق الصدر. ضع قطرة ماء على نافذة الجمجمة واضبط التركيز.
   4. الحصول على معدل ضربات القلب وأكسجة الدم لمراقبة المعلمات الحيوية للحيوانات. ضع المستشعر على المخلب الخلفي واحتفظ بجهاز المراقبة خارج غرفة التصوير ثنائية الفوتون.
   5. بمجرد أن يكون على مرحلة المجهر ، اضبط موضع الرأس. باستخدام المناظير وإضاءة الفلورسنت واسعة المجال ، اضبط مرشح البروتين الفلوري الأحمر (RFP) وابحث عن مجال الرؤية التصويري المطلوب (الشكل 1B ، العمود الأيمن).
   6. بمجرد تحديد اتجاه العينة ومجال الرؤية ، قم بتبديل المجهر من وضع المجال العريض إلى وضع الفحص المجهري للضوء (LSM).
   7. تأكد من قفل ليزر Ti-Sapphire في وضع 920 نانومتر ، وأن جميع المصاريع مفتوحة. اجعل الفولتية لكاشفات أنبوب المضاعف الضوئي GaAsP (PMT) تصل إلى 500-600 فولت. استخدم اثنين من PMTs مع مجموعات مرشح مع تمريرات النطاق عند 595/50 (RFP) و 525/50.
   8. اضغط على Live Image وقم بتعديل خلية pockel ببطء لزيادة طاقة الليزر في العينة حتى تصبح الصورة مرئية.
   9. بمجرد تحقيق صورة واضحة ، استخدم البرنامج والمرحلة الآلية لتعيين الجزء العلوي والسفلي من مكدس الصور داخل منطقة العينة المطلوبة. احذر من حجم الخطوة وتذكر أن المحور Z يضبط عمق العدسة.
   10. مع زيادة العمق ، ستصبح الصور أكثر قتامة. قم بزيادة كسب pockels/PMT ببطء للحفاظ على سطوع الصورة. احرص على عدم استخدام الكثير من الطاقة لأنها يمكن أن تؤدي إلى السمية الضوئية وتلف الأنسجة.
   11. قم بتعيين مسار حفظ وابدأ سلسلة Z. سيتم اجتيازه تلقائيا إلى مواضع البداية والنهاية باستخدام إعدادات pockel / PMT المحددة. بمجرد اكتمال المكدس ، استخدم التشغيل لإلقاء نظرة على المكدس لمعرفة الجودة. بمجرد اكتمال الحصول على الصور الضرورية ، قم بإيقاف تشغيل ليزر Ti-Sapphire .
   12. انقل إلى قفص الاسترداد ، كما هو موضح أعلاه (الخطوة 3.1).
   13. اخرج من عرض Prairie وتأكد من حفظ / نقل جميع البيانات. قم بإيقاف تشغيل الكمبيوتر وإيقاف تشغيل جميع الأجهزة.
2. مرحلة ما بعد المعالجة مع فيجي
   ملاحظة: فيجي هو برنامج مفتوح المصدر يركز على تحليل الصور البيولوجية²¹.
   1. قم بتنزيل FIJI فيما يتعلق بنظام التشغيل. قم بفك ضغط محتويات المجلد وتشغيل ملف .exe.
   2. اسحب ملف .env الذي تم تجميعه من التصوير ثنائي الفوتون إلى مربع الحوار. قسم القنوات إلى مربعات صور مختلفة. سيؤدي ذلك إلى إنشاء صورتين مختلفتين بقنوات مختلفة ، واحدة تحتوي على إشارة الخلية والأخرى إشارة الجسيمات.
   3. انسخ إحدى الصور وانقر فوق ملف > الحافظة الداخلية > الجديدة لإنشاء صورة أخرى. أعد تسمية إحدى الصور باسم المصدر والأخرى باسم نسخ.
   4. استخدم صورة النسخ وانقر على > العملية تحسين التباين في مربع الحوار. انقر فوق تطبيع وموافق ثم معالجة > Smooth. تستخدم هذه الصورة لإنشاء قناع وليس للتحليل. انقر فوق Image > ضبط عتبة > في مربع الحوار. استخدم المقياس المنزلق والطريقة المناسبة للاستخراج ، ثم انقر فوق تطبيق.
   5. استخدم العملية > Binary > Erode لتآكل وحدات البكسل المفردة في الخلفية وانقر فوق المعالجة > Binary > Dilose لإضافة وحدات بكسل إلى الصورة.
   6. انقر فوق معالجة > حاسبة الصور في مربع الحوار ، وحدد الصورة المصدر كأول وحدد الصورة الثانية كنسخ. استخدم AND لإنشاء تقاطع كلتا الصورتين. كرر نفس الخطوة لصورة القناة الأخرى.
   7. لتحليل الإشارة خارج منطقة الأوعية الدموية ، افتح صورة منسوخة غير معدلة واحذف منطقة الأوعية الدموية للإشارة باستخدام أداة Freehand ROI.
   8. قم بتعيين المعلمات المطلوبة بالانتقال إلى تحليل > تعيين القياسات. تأكد من تحديد المساحة والكثافة المتكاملة ومتوسط القيمة الرمادية .
   9. الآن تحليل عن طريق تحليل > القياس. ستظهر نافذة بها القياسات. انسخ البيانات إلى جدول بيانات.
   10. الآن حدد مساحة صغيرة من الصورة لا تحتوي على مضان. ستكون هذه هي الخلفية.
   11. انقر فوق تحليل > قياس لتلك المنطقة. نسخ البيانات إلى جدول بيانات.
   12. احفظ الصورة الناتجة كملف > حفظ باسم > تحليل نوع الملف لأغراض إعادة القياس أو النشر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

هنا ، أجرينا جراحة نافذة الجمجمة وقمنا بنقش خلايا C6 في نموذج ماوس NSG من GBM (n = 5). سيضمن الختم المناسب بين جميع المكونات المشاركة في إنشاء النافذة (الشكل 1 أ) متانة النوافذ للتصوير طويل المدى ، بالإضافة إلى تقليل الإصابة بالأمراض. باستخدام المرحلة التي تم تكييفها ل في الجسم ا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

نقدم طريقة لتتبع NP في الوقت الفعلي في الجسم الحي باستخدام 2P-IVM من خلال نافذة الجمجمة لتقييم توصيل الورم لأكسيد الحديد NPs المسمى بالفلورسنت. تتطلب التقنية الجراحية لهذا الإجراء يدا ثابتة ومهارات جراحية تجريبية متقدمة. من المستحسن التدرب على استخدام الذبائح أو الأشباح قبل المضي قدما في...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride infusion solution	Baxter Corp	533-JB1301P
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Invitrogen	11965-092
1 mL syringes	BD	Luer-Lok syringe, REF309628
10% FBS	Thermo fisher	Cytiva SH30910.03HI
10% DMSO	Sigma-Aldrich	D8418-50ML
2-photon microscope	Prairie Technologies, Bruker	Prairie Ultima IV
Alcohol applicators, 70%	Medline Industries, LP	MDS093810
Alcohol, spray bottle	Decon Labs Inc	Decon SaniHol, 04-355-122
Aluminum foil	Reynold Brands	Reynold Wrap non-stick aluminum foil
Anesthesia machine	Patterson Scientific	SAS3
Anesthesia monitoring	Kent Scientific	MouseSTAT Jr. Rodent Pulsoxymeter
Antibiotic-Antimycotic (100x), liquid	Invitrogen	15240-096
Betadine applicators	Professional Disposables International, Inc	S41125
Biopsy punch, 5 mm	Miltex	Size 5
Buprenorphine sustained release	Zoo Pharm	Bup SR Lab, 1.0 mg/mL	A generic drug can be used instead.
C6 rat glioma cell line	ATCC (American Tissue Culture Collection)	CCL-107
Cannulas	BD	16 G, 1.1/2”, 30 G, 1”
Carprofen	Pfizer	Rimadyl, 50 mg/ml	A generic drug can be used instead.
Cefazoline	Sagent Pharmaceuticals	25021-101-10, 1 g/vial	A generic drug can be used instead.
Cell strainer, 40 µm	Fisher Scientific	87711
Cotton tip applicators, 6”	Dyad Medical Sourcing, LLC	HCS1005
Dental cement	Stoelting Co	51459	Dental cement kit, clear, 2 components
Dexamethasone	Bimeda	138RX, 2 mg/mL	A generic drug can be used instead.
DietGel	ClearH2O	Recovery, 72-06-502
Drape	Cardinal Health	Bio Shield Wrap
Drill	Saeyang Microtech	Escort Pro, B08350
Drill tips	Hager & Meissinger GmbH	REF310104001001005	Size 005, US 1/4
FIJI imaging analysis software	National Institute of Health	https://imagej.net/software/fiji/
Forceps	Fisher Scientific	13-812-41
Gauze	Fisher HealthCare	Sterile Cotton Gauze Pad, 4 x 4”, 22-415-469
Gelfoam	Ethicon Inc.	Surgifoam absorbable gelatin sponge, Ref. 1972
Germinator	Cellpoint Scientific	Germinator 500, No. 11688
Glass coverslips, 5 mm diameter	Fisher Scientific	Menzel Cover glass
Gloves, non-sterile	Fisher Scientific	Nitrile powder-free medical examination gloves
Gloves, sterile	Medline Industries, LP	MDS104070
Hair removal cream	Church & Dwight	Nair Hair remover lotion
Hamilton syringe	Hamilton Company Inc	Gastight #1701, 10 µL
HBSS without Ca, Mg	Fisher Scientific	PI88284
Head bar	Hongway	5 mm inner diameter O-rings
Heating pad	Stoelting Co.	Rodent warmer X2
Insulin syringes	Exel International Medical Products	29G x 1/2″
Iron oxide nanoparticles	Covis Pharma GmbH	Feraheme ferumoxytol injection, 510 mg/17 mL, 59338077501
Isoflurane	Dechra	26675-46-7
Mice	Jackson Laboratories	NSG, Strain 005557
Microscope (surgery)	Seiler Medical	Seiler IQ Q-100-220
Nanoparticles	Custom		Iron oxide nanoparticles (Ferumoxytol) labeled with fluorescein isothiocyanate
Ophtalmic ointment	Major pharmaceuticals	Lubrifresh P.M. nighttime ointment, 203964
Oxygen	Linde Gas & Equipment Inc.	High Pressure Steel K Style Cylinder, 249CF, 2000PSIG, CGA 540
Plastic cups	Georgia-Pacirif Consumer Products	Dixie Portion Cup, 2 oz., Plastic, Clear, PK2400
Polyethylene tubing	Braintree Scientific	50-195-5494
Scale	Ohaus Corp	CR2200
Scalpel	Integra Life Sciences Production Corp	Integra Miltex Stainless steel disposable scalpel
Scissors	Fisher Scientific	13-804-18
Sealant	Henkel Corp	Loctite 4014
Single use lab gown	High Tech Conversions	17-444-081
Stereotactic frame	Stoelting Co.	Stoelting New Standard TM
Sterile Vacuum Bottle Top Filtration Systems	Fisher Scientific	S2GPU05RE, MilliporeSigma NO.:S2GPU05RE
Styrofoam box	N/A	N/A
Surgical gloves	Cardinal Health	19-163-108
Surgical glue, 3M Vetbond tissues adhesive	3M Animal Care Prodcuts	1469SB
Tail vein cathether	Custom		Consists of two 30 G cannulas connected with sillicone tubing
TrypLE Express (1x), no phenol red	Invitrogen	12604-039
Ultraviolett torch	Spring sunshine technology	Consciot