A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم نهجا جديدا للفحص المجهري ثنائي الفوتون لتوصيل الورم لجسيمات أكسيد الحديد النانوية ذات العلامات الفلورية إلى الورم الأرومي الدبقي في نموذج الفأر.

Abstract

يقتصر توصيل علاجات السرطان التي يتم إعطاؤها عن طريق الوريد إلى أورام المخ على الحاجز الدموي الدماغي. إن طريقة لتصوير تراكم وتوزيع الجزيئات الكبيرة بشكل مباشر في أورام المخ في الجسم الحي من شأنها أن تعزز بشكل كبير قدرتنا على فهم وتحسين توصيل الأدوية في النماذج قبل السريرية. يصف هذا البروتوكول طريقة للتتبع في الوقت الحقيقي في الجسم الحي للجسيمات النانوية الفلورية التي يتم إعطاؤها عن طريق الوريد باستخدام المجهر داخل الفوتون ثنائي الفوتون (2P-IVM) في نموذج فأر من الورم الأرومي الدبقي (GBM).

يحتوي البروتوكول على وصف متعدد الخطوات للإجراء ، بما في ذلك التخدير وتسكين التجارب ، وإنشاء نافذة الجمجمة ، وزرع خلايا GBM ، ووضع قضيب الرأس ، وإجراء دراسات 2P-IVM ، والرعاية بعد الجراحة لدراسات المتابعة طويلة الأجل. نعرض جلسات تصوير 2P-IVM التمثيلية وتحليل الصور ، ونفحص مزايا وعيوب هذه التقنية ، ونناقش التطبيقات المحتملة.

يمكن تعديل هذه الطريقة وتكييفها بسهولة لأسئلة بحثية مختلفة في مجال تصوير الدماغ قبل السريري في الجسم الحي .

Introduction

الفحص المجهري ثنائي الفوتون داخل الجسم (2P-IVM) هو تقنية تصوير مضان تسمح بتصور الأنسجة الحية1.

تم تطوير 2P-IVM لأول مرة في تسعينيات القرن العشرين ، وقد استخدم في تحليل في الجسم الحي لشبكية العين2 ، والكلى3 ، والأمعاء الدقيقة4 ، والقوقعة5 ، والقلب6 ، والقصبة الهوائية7 ، والدماغ في مختلف النماذج قبل السريرية 8,9. في مجال علم الأعصاب ، اكتسب 2P-IVM أهمية كتقنية للتصوير في الوقت الفعلي للدماغ السليم في....

Protocol

يتوافق الإجراء الحيواني الموصوف في هذا البروتوكول مع متطلبات الفريق الإداري لرعاية المختبر (APLAC).

1. ثقافة الخلية

  1. إعداد غطاء محرك السيارة
    1. اغسل يديك وارتد قفازات ومعطف مختبر. قم بتشغيل خزانة السلامة البيولوجية واضبط مستوى الوشاح على ارتفاع الفتح المناسب. دع غطاء المحرك يطهر لمدة 3-5 دقائق. رش منطقة غطاء المحرك بنسبة 70٪ من الإيثانول وامسحها بالمناديل الورقية.
    2. رش جميع الكواشف مع الإيثانول 70 ٪ وامسح مع المناديل الورقية. انقل الكواشف إلى الغطاء. لا تضع أي عناصر على الشواية. في حالة حدوث انسكاب في الغطاء ، قم بتغطيته بمناديل ، ورشه بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وامسحه مرة أخرى.
    3. بعد التجربة ، ....

النتائج

هنا ، أجرينا جراحة نافذة الجمجمة وقمنا بنقش خلايا C6 في نموذج ماوس NSG من GBM (n = 5). سيضمن الختم المناسب بين جميع المكونات المشاركة في إنشاء النافذة (الشكل 1 أ) متانة النوافذ للتصوير طويل المدى ، بالإضافة إلى تقليل الإصابة بالأمراض. باستخدام المرحلة التي تم تكييفها ل في الجسم ا?.......

Discussion

نقدم طريقة لتتبع NP في الوقت الفعلي في الجسم الحي باستخدام 2P-IVM من خلال نافذة الجمجمة لتقييم توصيل الورم لأكسيد الحديد NPs المسمى بالفلورسنت. تتطلب التقنية الجراحية لهذا الإجراء يدا ثابتة ومهارات جراحية تجريبية متقدمة. من المستحسن التدرب على استخدام الذبائح أو الأشباح قبل المضي قدما في.......

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نود أن نشكر خدمة الفحص المجهري لعلم الأعصاب في ستانفورد وو تساي ، ومركز ستانفورد للابتكارات في التصوير في الجسم الحي (SCi3) - مركز تصوير الصغيرة ، ومنحة الأجهزة المشتركة NIH S10 (S10RR026917-01 ، PI Michael Moseley ، دكتوراه) ، ومرفق ستانفورد للتصوير قبل السريري في Porter Drive لتوفير المعدات والبنية التحتية لهذا المشروع. تم دعم هذا العمل بمنحة من المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية ، رقم المنحة R01HD103638. نود أن نشكر مجموعة شنيتزر ، جامعة ستانفورد. مختبر Zuo ، جامعة سانتا كروز ؛ ومختبر التصوير العصبي الوعائي ، مركز بوسطن الضوئي ، جامعة بوسطن ، لإجراء مناقشات تعليمية حول التصوير ثنائي الفوتون ونماذج نوافذ الجمجمة.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.9% sodium chloride infusion solutionBaxter Corp533-JB1301P

Dulbecco's Modified Eagle Medium
Invitrogen11965-092
1 mL syringesBDLuer-Lok syringe, REF309628
10% FBSThermo fisherCytiva SH30910.03HI
10% DMSOSigma-AldrichD8418-50ML
2-photon microscopePrairie Technologies, BrukerPrairie Ultima IV
Alcohol applicators, 70%Medline Industries, LPMDS093810
Alcohol, spray bottleDecon Labs IncDecon SaniHol, 04-355-122
Aluminum foilReynold BrandsReynold Wrap non-stick aluminum foil
Anesthesia machinePatterson ScientificSAS3
Anesthesia monitoring Kent Scientific MouseSTAT Jr. Rodent Pulsoxymeter
Antibiotic-Antimycotic (100x), liquidInvitrogen15240-096
Betadine applicatorsProfessional Disposables International, IncS41125
Biopsy punch, 5 mm MiltexSize 5
Buprenorphine sustained releaseZoo PharmBup SR Lab, 1.0 mg/mLA generic drug can be used instead. 
C6 rat glioma cell lineATCC (American Tissue Culture Collection)CCL-107
CannulasBD16 G, 1.1/2”, 30 G, 1”
CarprofenPfizer Rimadyl, 50 mg/mlA generic drug can be used instead. 
CefazolineSagent Pharmaceuticals25021-101-10, 1 g/vialA generic drug can be used instead. 
Cell strainer, 40 µmFisher Scientific87711
Cotton tip applicators, 6” Dyad Medical Sourcing, LLCHCS1005
Dental cementStoelting Co51459Dental cement kit, clear, 2 components
DexamethasoneBimeda138RX, 2 mg/mLA generic drug can be used instead. 
DietGelClearH2ORecovery, 72-06-502
Drape Cardinal HealthBio Shield Wrap
DrillSaeyang MicrotechEscort Pro, B08350
Drill tips Hager & Meissinger GmbHREF310104001001005Size 005, US 1/4
FIJI imaging analysis softwareNational Institute of Healthhttps://imagej.net/software/fiji/
ForcepsFisher Scientific13-812-41
GauzeFisher HealthCareSterile Cotton Gauze Pad, 4 x 4”, 22-415-469
Gelfoam Ethicon Inc. Surgifoam absorbable gelatin sponge, Ref. 1972
Germinator Cellpoint Scientific Germinator 500, No. 11688
Glass coverslips, 5 mm diameterFisher ScientificMenzel Cover glass 
Gloves, non-sterileFisher ScientificNitrile powder-free medical examination gloves
Gloves, sterileMedline Industries, LPMDS104070
Hair removal creamChurch & DwightNair Hair remover lotion 
Hamilton syringeHamilton Company IncGastight #1701, 10 µL
HBSS without Ca, MgFisher ScientificPI88284
Head barHongway5 mm inner diameter O-rings
Heating padStoelting Co. Rodent warmer X2
Insulin syringesExel International Medical Products 29G x 1/2″
Iron oxide nanoparticlesCovis Pharma GmbHFeraheme ferumoxytol injection, 510 mg/17 mL, 59338077501
IsofluraneDechra26675-46-7
MiceJackson LaboratoriesNSG, Strain 005557
Microscope (surgery)Seiler MedicalSeiler IQ Q-100-220
NanoparticlesCustomIron oxide nanoparticles (Ferumoxytol) labeled with fluorescein isothiocyanate
Ophtalmic ointmentMajor pharmaceuticalsLubrifresh P.M. nighttime ointment, 203964
OxygenLinde Gas & Equipment Inc. High Pressure Steel K Style Cylinder, 249CF, 2000PSIG, CGA 540
Plastic cupsGeorgia-Pacirif Consumer ProductsDixie Portion Cup, 2 oz., Plastic, Clear, PK2400
Polyethylene tubingBraintree Scientific50-195-5494
ScaleOhaus CorpCR2200
ScalpelIntegra Life Sciences Production CorpIntegra Miltex Stainless steel disposable scalpel
ScissorsFisher Scientific13-804-18
SealantHenkel CorpLoctite 4014
Single use lab gownHigh Tech Conversions17-444-081
Stereotactic frameStoelting Co. Stoelting New Standard TM
Sterile Vacuum Bottle Top Filtration SystemsFisher ScientificS2GPU05RE, MilliporeSigma NO.:S2GPU05RE
Styrofoam boxN/AN/A
Surgical glovesCardinal Health19-163-108
Surgical glue, 3M Vetbond tissues adhesive3M Animal Care Prodcuts1469SB
Tail vein cathetherCustomConsists of two 30 G cannulas connected with sillicone tubing 
TrypLE Express (1x), no phenol redInvitrogen12604-039
Ultraviolett torchSpring sunshine technologyConsciot

References

  1. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  2. Wang, Z., McCracken, S., Williams, P. R. Transpupillary two-photon in vivo imaging of the mouse retina.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 205

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved