Microscopie intravitale à deux photons du glioblastome dans un modèle murin

Résumé

Nous présentons une nouvelle approche pour la microscopie à deux photons de l’administration tumorale de nanoparticules d’oxyde de fer marquées par fluorescence au glioblastome dans un modèle murin.

Résumé

L’administration de traitements anticancéreux administrés par voie intraveineuse aux tumeurs cérébrales est limitée par la barrière hémato-encéphalique. Une méthode permettant d’imager directement l’accumulation et la distribution des macromolécules dans les tumeurs cérébrales in vivo améliorerait considérablement notre capacité à comprendre et à optimiser l’administration de médicaments dans des modèles précliniques. Ce protocole décrit une méthode de suivi in vivo en temps réel de nanoparticules marquées par fluorescence administrées par voie intraveineuse avec microscopie intravitale à deux photons (2P-IVM) dans un modèle murin de glioblastome (GBM).

Le protocole contient une description en plusieurs étapes de la procédure, y compris l’anesthésie et l’analgésie des animaux de laboratoire, la création d’une fenêtre crânienne, l’implantation de cellules GBM, la mise en place d’une barre de tête, la réalisation d’études 2P-IVM et les soins post-chirurgicaux pour les études de suivi à long terme. Nous montrons des sessions d’imagerie 2P-IVM représentatives et des analyses d’images, examinons les avantages et les inconvénients de cette technologie et discutons des applications potentielles.

Cette méthode peut être facilement modifiée et adaptée à différentes questions de recherche dans le domaine de l’imagerie cérébrale préclinique in vivo .

Introduction

La microscopie intravitale à deux photons (2P-IVM) est une technique d’imagerie par fluorescence qui permet de visualiser les tissus vivants¹.

Développé pour la première fois dans les années 1990, le 2P-IVM a été utilisé pour l’analyse in vivo de la rétine², du rein³, de l’intestin grêle⁴, de la cochlée⁵, du cœur⁶, de la trachée^{7 et du} cerveau dans divers modèles précliniques ^8,9. Dans le domaine d....

Protocole

La procédure animale décrite dans ce protocole est conforme aux exigences du Groupe administratif sur les soins aux animaux de laboratoire (APLAC).

1. Culture cellulaire

1. Préparation de la hotte
   1. Lavez-vous les mains, portez des gants et une blouse de laboratoire. Allumez l’enceinte de sécurité biologique et réglez le niveau du châssis à une hauteur d’ouverture appropriée. Laissez la hotte purger pendant 3 à 5 minutes. Vaporisez la zone de la hotte avec de l’éthanol à 70 % et essuyez-la avec du papier de soie.
   2. Vaporisez tous les réactifs avec de l’éthanol à 70 % et essuyez avec du papier de soie. D....

Discussion

Nous présentons une méthode de suivi in vivo des NP en temps réel à l’aide de la 2P-IVM à travers une fenêtre crânienne pour évaluer l’administration tumorale de NP d’oxyde de fer marquées par fluorescence. La technique chirurgicale pour cette procédure nécessite une main ferme et des compétences chirurgicales expérimentales avancées. Il est conseillé de s’entraîner à utiliser des carcasses ou des fantômes avant de passer à l’expérience des animaux vivants. Comme alternative, Hoefer.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride infusion solution	Baxter Corp	533-JB1301P
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Invitrogen	11965-092
1 mL syringes	BD	Luer-Lok syringe, REF309628
10% FBS	Thermo fisher	Cytiva SH30910.03HI
10% DMSO	Sigma-Aldrich	D8418-50ML
2-photon microscope	Prairie Technologies, Bruker	Prairie Ultima IV
Alcohol applicators, 70%	Medline Industries, LP	MDS093810
Alcohol, spray bottle	Decon Labs Inc	Decon SaniHol, 04-355-122
Aluminum foil	Reynold Brands	Reynold Wrap non-stick aluminum foil
Anesthesia machine	Patterson Scientific	SAS3
Anesthesia monitoring	Kent Scientific	MouseSTAT Jr. Rodent Pulsoxymeter
Antibiotic-Antimycotic (100x), liquid	Invitrogen	15240-096
Betadine applicators	Professional Disposables International, Inc	S41125
Biopsy punch, 5 mm	Miltex	Size 5
Buprenorphine sustained release	Zoo Pharm	Bup SR Lab, 1.0 mg/mL	A generic drug can be used instead.
C6 rat glioma cell line	ATCC (American Tissue Culture Collection)	CCL-107
Cannulas	BD	16 G, 1.1/2”, 30 G, 1”
Carprofen	Pfizer	Rimadyl, 50 mg/ml	A generic drug can be used instead.
Cefazoline	Sagent Pharmaceuticals	25021-101-10, 1 g/vial	A generic drug can be used instead.
Cell strainer, 40 µm	Fisher Scientific	87711
Cotton tip applicators, 6”	Dyad Medical Sourcing, LLC	HCS1005
Dental cement	Stoelting Co	51459	Dental cement kit, clear, 2 components
Dexamethasone	Bimeda	138RX, 2 mg/mL	A generic drug can be used instead.
DietGel	ClearH2O	Recovery, 72-06-502
Drape	Cardinal Health	Bio Shield Wrap
Drill	Saeyang Microtech	Escort Pro, B08350
Drill tips	Hager & Meissinger GmbH	REF310104001001005	Size 005, US 1/4
FIJI imaging analysis software	National Institute of Health	https://imagej.net/software/fiji/
Forceps	Fisher Scientific	13-812-41
Gauze	Fisher HealthCare	Sterile Cotton Gauze Pad, 4 x 4”, 22-415-469
Gelfoam	Ethicon Inc.	Surgifoam absorbable gelatin sponge, Ref. 1972
Germinator	Cellpoint Scientific	Germinator 500, No. 11688
Glass coverslips, 5 mm diameter	Fisher Scientific	Menzel Cover glass
Gloves, non-sterile	Fisher Scientific	Nitrile powder-free medical examination gloves
Gloves, sterile	Medline Industries, LP	MDS104070
Hair removal cream	Church & Dwight	Nair Hair remover lotion
Hamilton syringe	Hamilton Company Inc	Gastight #1701, 10 µL
HBSS without Ca, Mg	Fisher Scientific	PI88284
Head bar	Hongway	5 mm inner diameter O-rings
Heating pad	Stoelting Co.	Rodent warmer X2
Insulin syringes	Exel International Medical Products	29G x 1/2″
Iron oxide nanoparticles	Covis Pharma GmbH	Feraheme ferumoxytol injection, 510 mg/17 mL, 59338077501
Isoflurane	Dechra	26675-46-7
Mice	Jackson Laboratories	NSG, Strain 005557
Microscope (surgery)	Seiler Medical	Seiler IQ Q-100-220
Nanoparticles	Custom		Iron oxide nanoparticles (Ferumoxytol) labeled with fluorescein isothiocyanate
Ophtalmic ointment	Major pharmaceuticals	Lubrifresh P.M. nighttime ointment, 203964
Oxygen	Linde Gas & Equipment Inc.	High Pressure Steel K Style Cylinder, 249CF, 2000PSIG, CGA 540
Plastic cups	Georgia-Pacirif Consumer Products	Dixie Portion Cup, 2 oz., Plastic, Clear, PK2400
Polyethylene tubing	Braintree Scientific	50-195-5494
Scale	Ohaus Corp	CR2200
Scalpel	Integra Life Sciences Production Corp	Integra Miltex Stainless steel disposable scalpel
Scissors	Fisher Scientific	13-804-18
Sealant	Henkel Corp	Loctite 4014
Single use lab gown	High Tech Conversions	17-444-081
Stereotactic frame	Stoelting Co.	Stoelting New Standard TM
Sterile Vacuum Bottle Top Filtration Systems	Fisher Scientific	S2GPU05RE, MilliporeSigma NO.:S2GPU05RE
Styrofoam box	N/A	N/A
Surgical gloves	Cardinal Health	19-163-108
Surgical glue, 3M Vetbond tissues adhesive	3M Animal Care Prodcuts	1469SB
Tail vein cathether	Custom		Consists of two 30 G cannulas connected with sillicone tubing
TrypLE Express (1x), no phenol red	Invitrogen	12604-039
Ultraviolett torch	Spring sunshine technology	Consciot