Microscopia intravitale a due fotoni del glioblastoma in un modello murino

Riepilogo

Presentiamo un nuovo approccio per la microscopia a due fotoni della somministrazione tumorale di nanoparticelle di ossido di ferro marcate con fluorescenza al glioblastoma in un modello murino.

Abstract

La somministrazione di terapie antitumorali somministrate per via endovenosa ai tumori cerebrali è limitata dalla barriera emato-encefalica. Un metodo per visualizzare direttamente l'accumulo e la distribuzione di macromolecole nei tumori cerebrali in vivo migliorerebbe notevolmente la nostra capacità di comprendere e ottimizzare la somministrazione di farmaci nei modelli preclinici. Questo protocollo descrive un metodo per il monitoraggio in vivo in tempo reale di nanoparticelle marcate con fluorescenza somministrate per via endovenosa con microscopia intravitale a due fotoni (2P-IVM) in un modello murino di glioblastoma (GBM).

Il protocollo contiene una descrizione in più fasi della procedura, tra cui l'anestesia e l'analgesia degli animali da esperimento, la creazione di una finestra cranica, l'impianto di cellule GBM, il posizionamento di una barra per la testa, la conduzione di studi 2P-IVM e l'assistenza post-chirurgica per studi di follow-up a lungo termine. Mostriamo sessioni rappresentative di imaging 2P-IVM e analisi delle immagini, esaminiamo i vantaggi e gli svantaggi di questa tecnologia e discutiamo le potenziali applicazioni.

Questo metodo può essere facilmente modificato e adattato per diverse domande di ricerca nel campo dell'imaging cerebrale preclinico in vivo .

Introduzione

La microscopia intravitale a due fotoni (2P-IVM) è una tecnica di imaging a fluorescenza che consente la visualizzazione di tessuti viventi¹.

Sviluppato per la prima volta negli anni '90, 2P-IVM è stato utilizzato per l'analisi in vivo della retina², del rene³, dell'intestino tenue⁴, della coclea⁵, del cuore⁶, della trachea^{7 e del} cervello in vari modelli preclinici ^8,9. Nel campo delle neuroscienze, la 2P-IVM ha acquisito importanza come tecnica per l'imaging in tempo reale del cervello sano in animali svegli¹⁰, nonché per lo studio di malattie del sistema nervoso come l'Alzheimer¹¹, il Parkinson¹² e il glioblastoma (GBM)13,14,15,16^.

2P-IVM offre una soluzione elegante per lo studio del microambiente tumorale durante lo sviluppo del GBM. Mentre alcuni studi precedenti si sono concentrati su modelli in vitro¹⁷ ed ex vivo ¹⁸, altri hanno implementato modelli ortotopici¹⁹ e xenotropi²⁰ in vivo per l'esame del GBM. Madden et al. hanno eseguito l'imaging nativo della linea cellulare di glioma di ratto CNS-1 in un modello murino¹³. Utilizzando un modello murino ortotopico GL261-DsRed, Ricard et al. hanno eseguito una somministrazione endovenosa di un fluoroforo per migliorare i vasi sanguigni nella regione tumorale in 2P-IVM¹⁴.

Qui, applichiamo 2P-IVM per monitorare la consegna tumorale di nanoparticelle di ossido di ferro (NP) marcate con fluorescenza in un modello murino ortotopico di GBM. Utilizzando una finestra cranica, questo metodo ci permette di studiare in dettaglio la distribuzione spazio-temporale in tempo reale delle NP nel cervello.

Protocollo

La procedura per gli animali descritta nel presente protocollo è conforme ai requisiti del gruppo di esperti scientifici sulla cura degli animali da laboratorio (APLAC).

1. Colture cellulari

1. Preparazione della cappa
   1. Lavarsi le mani, indossare guanti e camice da laboratorio. Accendere l'armadio di sicurezza biologica e impostare la livella dell'anta a un'altezza di apertura adeguata. Lasciare spurgare la cappa per 3-5 minuti. Spruzzare l'area del cappuccio con etanolo al 70% e pulirla con carta velina.
   2. Spruzzare tutti i reagenti con etanolo al 70% e pulire con carta velina. Spostare i reagenti nel cappuccio. Non mettere alcun oggetto sulla griglia. Se si verifica una fuoriuscita nella cappa, coprirla con salviette, spruzzarla con etanolo al 70% e strofinare di nuovo.
   3. Dopo l'esperimento, chiudi con cura i coperchi di ogni articolo, pulisci tutti i materiali, rimuovi tutti gli oggetti dal cofano e trasferiscili nella loro posizione originale. Spruzzare etanolo al 70% nel cofano e pulirlo. Chiudere l'anta e spegnere l'armadio di sicurezza biologica.
2. Preparazione di un terreno di coltura
   1. Aggiungere 50 ml di siero bovino fetale al 100% (FBS) a 500 ml di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). Aggiungere 5 mL della soluzione antibiotico-antimicotica (100x).
   2. Passare tutti i reagenti attraverso un flacone filtrante sterile da 500 mL (filtro da 0,22 μm).
3. Scongelamento delle cellule crioconservate
   1. In una cappa a flusso laminare, aggiungere 20 mL del terreno di coltura a un matraccio T75. Etichettare il pallone con il nome delle celle, la data e il numero di passaggio sul pallone. In questo studio sono state utilizzate cellule di glioma C6 aderenti.
   2. Scongelare rapidamente le celle a bagnomaria a 37 °C. Non vorticare le celle. Scongelare e utilizzare immediatamente le celle.
   3. Trasferire le cellule scongelate nel matraccio T75 utilizzando un puntale per pipetta da 1 mL. Fare attenzione a non introdurre bolle durante il processo di trasferimento ed evitare residui di terreno nel collo del pallone. Ciò potrebbe aumentare il rischio di possibile contaminazione.
4. Cambiare il mezzo
   1. Cambiare il terreno il giorno successivo allo scongelamento per rimuovere eventuali residui di tripsina o dimetilsolfossido (DMSO) (passaggio 1.6). Successivamente, cambiare il terreno almeno due volte a settimana o più, a seconda del livello di confluenza cellulare. Il terreno deve essere cambiato un giorno dopo il passaggio per eliminare la tripsina.
   2. Per cambiare il fluido, accendere l'apparecchio di aspirazione, collegare la pipetta di vetro di aspirazione e aspirare tutto il fluido.
   3. Aggiungere 20 mL del terreno di coltura (passaggio 1.2).
5. Far passare le cellule
   1. Caricare la cappa con gli oggetti necessari nel corso dell'esperimento.
   2. Utilizzare una pipetta di vetro per aspirazione e aspirare tutti i fluidi, assicurandosi che la pipetta di vetro si trovi sul lato non cellulare del pallone. Per questo passaggio, posizionare il pallone T75 verticalmente.
   3. Aggiungere ~10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato a temperatura ambiente (RT) (priva di PBS, Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺ ) o della soluzione salina bilanciata di Hanks (priva di HBSS, Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺ ) sul lato non cellulare. Lavare brevemente le celle con PBS posizionando il pallone T75 orizzontalmente con il lato della cella rivolto verso il basso.
   4. Posizionare immediatamente il pallone in verticale e aspirare il PBS/HBSS. Ripetere il lavaggio e l'aspirazione 3 volte.
   5. Aggiungere 2 mL di tripsina (ricombinante o di origine animale) sul lato cellulare (matraccio T75 orizzontale, lato cellulare rivolto verso il basso). Incubare in un incubatore per colture tissutali standard (37 °C, 5% CO₂ ) per 4 min. Triturare una volta dopo 2 minuti utilizzando una pipetta da 5 ml.
   6. Dopo 4 minuti di incubazione totale, trasferire la soluzione in una provetta conica da 15 ml. Aggiungere 8 mL della soluzione di crescita alla provetta conica (2 mL di cellule tripsinizzate + 8 mL di terreno = 10 mL in totale).
   7. Utilizzare un'altra provetta conica vuota da 15 mL con un filtro e trasferire le cellule tramite una pipetta da 25 mL per ottenere singole cellule.
   8. Trasferire 1/10 (1 mL) della soluzione (cellula + terreno + Tryp-LE) in un matraccio T75 con 20 mL di terreno. In alternativa, contare le celle (passaggio 1.7). Cambiare il terreno il giorno successivo per avere una soluzione di terreno senza tripsina.
6. Congelamento del terreno e delle cellule
   1. Scongelare FBS al 100% in frigorifero a 4 °C. Non utilizzare un bagno d'acqua o calore poiché ciò potrebbe danneggiare le proteine in FBS.
   2. Per preparare 50 mL di terreno di congelamento, mescolare 45 mL di DMEM, 5 mL di FBS e 5 mL di DMSO. Aliquotarlo in contenitori da 1-2 mL per evitare lo scongelamento intermittente e danni alle proteine. Conservarli in congelatore a -20° o -80 °C.
   3. Per i restanti 9 mL di soluzione (passaggio 1.5), aggiungere 1 mL di terreno per raggiungere 10 mL in totale. Centrifugare a 300 x g per 4 min.
   4. Rimuovere il surnatante e risospendere in 1 mL di terreno di congelamento (vedere sopra). Mettere le cellule in un contenitore per congelamento in congelatore a -80 °C. Spostare le celle nel liquido N₂ per la conservazione a lungo termine dopo 1 o 2 giorni.
7. Contare le cellule
   1. Per i restanti 9 mL (passaggio 1.5), aggiungere 1 mL di terreno per raggiungere i 10 mL in totale. Centrifugare a 300 x g per 4 min.
   2. Rimuovere il surnatante e risospendere in 4 mL di HBSS. Risospendere 10 μL di cellule in 80 μL di HBSS + 10 μL di Trypan Blue allo 0,4%, fattore di diluizione = 10.
   3. Prelevare 17 μL di soluzione e contare quattro quadrati 4 x 4 in un emocitometro. La media conta per i quattro quadrati 4 x 4 e moltiplica per 10⁴volte il fattore di diluizione per ottenere cellule/mL.

2. Chirurgia

NOTA: Si consiglia di eseguire l'intervento chirurgico da due ricercatori, in cui una persona è responsabile della preparazione delle cellule, della miscelazione del cemento dentale e in generale dell'assistenza alla procedura, mentre la seconda persona si concentra sul rimanere sterile. Avere un secondo manipolatore per assistere la procedura chirurgica riduce considerevolmente la probabilità che si verifichi una contaminazione. Seguire le migliori pratiche chirurgiche ridurrebbe le possibilità di complicanze post-operatorie. La Figura 1A fornisce una panoramica dei componenti della finestra cranica.

1. Preparativi generali
   1. Prima di iniziare, verificare che la procedura sia approvata dalle linee guida istituzionali locali per il benessere degli animali.
      NOTA: Questo studio ha utilizzato topi NSG femmine di 5 mesi (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) (n = 5).
   2. Prima dell'intervento chirurgico, sterilizzare in autoclave tutti gli strumenti chirurgici e assicurarsi che siano disponibili tutte le forniture necessarie. Stampare le cartelle cliniche di anestesia e chirurgia.
   3. Assicurarsi che all'arrivo, gli animali abbiano almeno 1 settimana di acclimatazione nella stanza di allevamento per ridurre ulteriori disagi post-operatori.
   4. Il giorno dell'intervento, assicurarsi che tutti i dispositivi (microscopio, termoforo, sterilizzatore, trapano, aspirapolvere, ecc.) siano pronti per l'uso. Verificare che la macchina per anestesia contenga una quantità sufficiente di isoflurano e rabboccare se necessario. Per i nuovi utenti, la procedura della finestra cranica può richiedere fino a 2 ore per animale; Pertanto, avere abbastanza isoflurano è fondamentale.
   5. Immergere le finestre di vetro e le barre di testa nell'alcool e preparare un contenitore con soluzione fisiologica. Ciò garantirà un flusso di lavoro regolare senza gravi violazioni della sterilità e manterrà il tempo sotto anestesia per ogni animale il più breve possibile.
   6. Aprire tutti i materiali chirurgici su una superficie sterile sulla stazione di lavoro. Ad esempio, l'interno di una confezione di garza sterile può essere utilizzato per questo scopo. Usa la tecnica delle sole punte. Quando non si utilizzano strumenti chirurgici, posizionare le punte su una superficie sterile, come l'interno della confezione della garza sterile.
   7. Quando si eseguono più interventi chirurgici, posizionare tutti gli strumenti chirurgici nello sterilizzatore tra un intervento chirurgico e l'altro per disinfettarli. Quando si eseguono interventi chirurgici su più di 5 animali, utilizzare un nuovo set di strumenti sterilizzati in autoclave. Sostituisci la punta del trapano quando diventa smussata con una nuova per evitare traumi ai tessuti.
2. Anestesia e preparativi per l'intervento chirurgico
   NOTA: La configurazione dell'anestesia è identica per l'intervento chirurgico e per l'imaging.
   1. Anestetizzare il topo utilizzando l'isoflurano (3%-5% per induzione) in una camera anestetica. Dopo aver assicurato un'adeguata profondità di anestesia testando il riflesso di ritiro del pedale (pizzicamento del cuscinetto del piede su entrambe le zampe posteriori), trasferire l'animale in una stazione di lavoro di preparazione. Mantenere l'anestesia su un cono nasale (1%-2%). Qui, applica un unguento per gli occhi per prevenire danni alla cornea. Controllare regolarmente la perdita di riflessi durante l'intervento chirurgico controllando il riflesso della zampa.
   2. Se è necessaria l'identificazione dell'animale, utilizzare uno strumento per punzonare le orecchie o delle forbici per contrassegnare le orecchie o utilizzare un pennarello per contrassegnare la coda.
   3. Rimuovere il pelo che copre il cranio tra le orecchie e gli occhi con una crema depilatoria. Lasciare la crema per tutto il tempo indicato (30-60 s) dal produttore per evitare irritazioni cutanee. Assicurati che la crema entri in contatto con le radici dei capelli applicandola contro la direzione di crescita dei capelli. Evitare che la crema depilatoria entri in contatto con gli occhi. Rimuovere eventuali residui di crema e capelli pulendo l'area con soluzione fisiologica. In alternativa, usa le tosatrici.
   4. Per evitare dolore, infezione o gonfiore intra e post-operatorio, somministrare farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS), oppioidi, agenti antinfiammatori e antibiotici. Somministrare carprofene (5-20 mg/kg, [SQ] sottocutaneo), buprenorfina a rilascio prolungato (1 mg/kg SQ), cefazolina (20 mg/kg SQ) e desametasone (0,2 mg/kg SQ) prima dell'intervento chirurgico. Somministrare circa 0,3 ml di soluzione salina SQ allo 0,9% per evitare la disidratazione.
   5. Successivamente, strofinare l'area tamponando alternativamente lo iodio povidone e l'alcol isopropilico tre volte con movimenti circolari dal centro del cranio alla periferia.
3. Procedura di craniotomia
   1. Trasferire l'animale sul tavolo operatorio e posizionarlo in decubito ventrale su un termoforo (~37 °C) per garantire condizioni isotermiche durante la procedura. L'ipotermia nei roditori riduce significativamente i tassi di sopravvivenza e prolunga la fase di recupero post-operatorio.
   2. Posizionare la testa nella cornice stereotassica posizionando le barre auricolari e le barre incisive. Per le barre auricolari, trova l'arcata zigomatica e inserisci le barre dietro le arcate. Inizia fissando la barra controlaterale con la mano dominante (ad esempio, fissa la barra sinistra con la mano destra se sei destrorso) e poi fissa il lato opposto. Regolare le posizioni delle barre auricolari e incisive ruotando le viti se necessario.
   3. Riapplicare l'unguento per gli occhi se necessario e utilizzare un foglio di alluminio per coprire gli occhi. In questo modo si evitano danni causati dalla luce brillante del microscopio e dalla luce UV utilizzata per polimerizzare la colla cianoacrilica in un secondo momento (passaggio 2.5).
   4. Prima dell'incisione, controllare nuovamente il riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi; Se necessario, regolare l'anestesia di conseguenza. Collegare l'animale al dispositivo di monitoraggio dell'anestesia posizionando il sensore sulla zampa posteriore. Misurare la frequenza cardiaca e la concentrazione di ossigeno nel sangue aiuterebbe a ridurre la mortalità e migliorare il recupero post-operatorio. Inoltre, acquisisci la frequenza respiratoria ispezionando visivamente il movimento del torace.
   5. Coprire il corpo dell'animale con un telo per evitare ipotermia e contaminazione. Eseguire un ultimo tampone di iodio povidone prima di iniziare l'intervento.
   6. Indossa guanti e un camice pulito.
      NOTA: L'uso di guanti sterili è incoraggiato a causa dell'invasività della procedura e per ridurre il rischio di infezioni e infiammazioni post-operatorie con conseguente morbilità e perdita della qualità dell'immagine nella 2P-IVM (sezione 5).
   7. Solleva la pelle del cranio e crea un'incisione tenendo le forbici tra l'occhio destro e l'orecchio e tagliando verso il lato sinistro del cranio seguendo i segni dell'incisione. Rimuovere il lembo di pelle rotondo risultante.
      NOTA: A seconda della regione di interesse nel cervello e delle dimensioni della finestra, il sito e il diametro dell'incisione possono variare. La dimensione dell'incisione deve essere maggiore del diametro della testa per consentire il montaggio (passaggio 2.5). Se necessario, la pelle che circonda l'incisione può essere sezionata delicatamente per creare più spazio.
   8. Rimuovere il periostio grattando delicatamente la superficie del cranio con una lama di bisturi o una microcurretta. Prestare attenzione quando si rimuove il periostio intorno alle suture craniche poiché queste aree sono fragili e più soggette a sanguinamento. Utilizzare soluzione fisiologica e un aspirapolvere per mantenere l'area chirurgica pulita dai detriti. Grattare il periostio per garantire una migliore aderenza alla colla cianoacrilica e al cemento dentale (passaggio 2.5)
   9. Identificare la regione del cervello per eseguire l'iniezione cellulare. Per questo, usa un atlante delle coordinate stereotassiche del cervello del topo. Secondo le coordinate cerebrali, segna la posizione della finestra cranica utilizzando un punzone da biopsia dello stesso diametro della finestra, una penna chirurgica o una matita sterilizzata in autoclave.
   10. Tenere il trapano nella mano dominante e qualsiasi altro strumento (siringa, pinze) nella mano non dominante. Evitare di forare a lungo nello stesso punto. Il trapano deve essere utilizzato a raffica per evitare il surriscaldamento. Durante queste pause, applicare soluzione fisiologica fredda sul calvario per mantenere pulita la vista chirurgica e per evitare il surriscaldamento. Usa il feedback sensoriale della punta del trapano per rilevare quando il cranio è stato perforato completamente.
   11. Utilizzare soluzione fisiologica fredda, in combinazione con un aspirapolvere, per pulire la superficie del cranio. Non utilizzare garze o un applicatore con punta di cotone dopo aver aperto il calvario poiché i resti di fili di cotone possono portare a una reazione da corpo estraneo dopo aver sigillato la finestra cerebrale.
   12. Durante la foratura, assicurarsi che la traiettoria e il diametro siano della stessa dimensione di quelli del vetrino. A tale scopo, posizionare il vetrino coprioggetti sulla parte superiore del cranio e verificare che il vetrino coprioggetti si adatti esattamente all'interno della finestra cranica.
   13. Una volta che è possibile premere delicatamente il lembo del cranio su di esso, utilizzare una pinza per rimuovere con cautela il frammento dal campo operatorio (Figura 1B, a sinistra). Se non è ancora possibile deprimere il cranio, continuare a perforare le aree della finestra cranica che sono ancora collegate al resto del cranio e rivalutare.
   14. Se si verifica un sanguinamento minore, utilizzare una spugna emostatica combinata con una leggera pressione o, in alternativa, soluzione salina ghiacciata, per ridurre la perdita di sangue.
4. Impianto cellulare
   1. Preparare e contare le cellule da impiantare come descritto al punto 1.7. Assicurarsi che il numero di celle sia 200.000 cellule/μL.
      NOTA: Si consiglia di sospendere le cellule in una matrice di membrana che si solidifica a RT. Ciò migliorerà il tasso di successo delle cellule impiantate nel parenchima cerebrale.
   2. Trasferire le cellule in un contenitore con ghiaccio nella sala chirurgica. Utilizzare una siringa da microlitro a tenuta di gas. Prima dell'aspirazione, tenere la siringa sul ghiaccio per evitare differenze di temperatura.
   3. Dopo aver aspirato 1 μL, posizionare la siringa all'interno del telaio stereotassico.
      NOTA: Per risparmiare tempo è possibile utilizzare un dispositivo di coordinate stereotassiche automatizzato che mostra le posizioni negli assi X, Y e Z. E' anche possibile calcolare manualmente le posizioni in base alla lambda. Si sconsiglia l'iniezione di più di 1,5 μL. Ciò garantirà che l'area iniettata non si riempia eccessivamente, causando un impianto non riuscito, crescita al di fuori del parenchima cerebrale o metastasi.
   4. Eseguire l'impianto nella regione V2MM (corteccia visiva 2, parte mediomediale) del cervello, che corrisponde approssimativamente alle coordinate da mediale a laterale (M-L): da -1,2 a -1,6 mm, e da dorsale a ventrale (D-V): da -2,6 a -3,5 mm.
      1. Per l'imaging a due fotoni (passaggio 4.6), impiantare le cellule nelle aree cerebrali superficiali in modo che la massa tumorale possa essere visualizzata attraverso la finestra cranica in un secondo momento. Iniettare 0,5 μL (100.000 cellule) anteriormente e posteriormente (A-P): 0,8 mm di profondità. Muovi l'ago lentamente, in modo graduale, quando entra nel cervello e attenda 30 s dopo l'iniezione (Figura 1B, colonna centrale).
      2. Utilizzare lo stesso approccio quando si ritrae l'ago e si esce dal tessuto cerebrale. Evitare l'iniezione vicino ai ventricoli poiché il liquido cerebrospinale potrebbe favorire le metastasi nel sistema nervoso centrale e periferico.
5. Chiusura della finestra cranica
   1. Spostare la barra della testa e il vetrino coprioggetti dall'alcol a una soluzione salina. Utilizzare una punta a vuoto o una pinza per guidare questi componenti verso il sito chirurgico.
   2. Posizionare il vetrino coprioggetti all'interno della finestra cranica e posizionare una piccola quantità di colla cianoacrilica tra il teschio e il vetrino. La colla cianoacrilica attivata dai raggi UV riduce il tempo di polimerizzazione ed evita lo spostamento accidentale. Se la colla si rovescia sul vetrino, rimuoverla con un applicatore con punta di cotone o grattandola delicatamente con il lato smussato di un bisturi prima che si indurisca completamente.
      ATTENZIONE: La luce UV è dannosa per gli occhi e la pelle. Evitare il contatto con gli occhi e la pelle durante l'indurimento della colla.
   3. Dopo aver fissato il vetrino coprioggetti nella finestra cranica, applicare la barra per la testa. Miscelare il cemento dentale bicomponente, posizionare la barra per la testa e applicare il cemento sull'area circostante, garantendo il contatto tra il cranio e la barra per la testa. Pulisci accuratamente il cemento superfluo con la punta di una siringa, un bisturi o la punta di un trapano.
      NOTA: Il cemento dentale si solidifica molto rapidamente, quindi si consiglia di applicarlo in modo tempestivo.
   4. Dopo aver sigillato la finestra cranica, identificare se le aree del cranio tra il cemento dentale e la pelle sono ancora esposte. In tal caso, applicare la colla chirurgica per coprire il cranio chiudendo la pelle. In alternativa, eseguire una singola sutura con un materiale di sutura riassorbibile.

3. Recupero post-chirurgico e crescita del tumore

1. Guarigione
   1. Monitora l'animale su un tappetino riscaldato in una gabbia di recupero fino a quando non riprende piena coscienza. Alloggiare gli animali separatamente dopo l'intervento chirurgico per ridurre il rischio di lesioni.
   2. Somministrare una dieta di recupero, come gel d'acqua disponibili in commercio con elettroliti o zuccheri. In alternativa, fornire cibo da laboratorio standard inumidito per garantire una facile alimentazione ed evitare disidratazione e ipoglicemia.
2. Monitoraggio
   1. Al momento del recupero, monitorare quotidianamente l'animale per segni di dolore, angoscia o infezione. Se necessario, somministrare analgesici, farmaci antinfiammatori o antibiotici. Se un animale raggiunge l'endpoint dello studio, sopprimerlo in modo umano. Dopo l'ultima sessione di imaging, sopprimere il topo mediante asfissia da anidride carbonica, seguita da lussazione cervicale.
      NOTA: Esempi di criteri di eutanasia precoce includono, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, una significativa perdita di peso (>20%), disturbi neurologici, dispnea, sanguinamento eccessivo durante l'intervento chirurgico o comportamento stereotipato pronunciato. Ispezionare la finestra cranica e pulirla con soluzione fisiologica o alcol quando necessario.
   2. Per monitorare la crescita del tumore e pianificare i punti temporali dell'imaging, eseguire l'imaging a bioluminescenza (BLI) di tutto il corpo. A tal fine, iniettare 150 mg/kg di D-luciferina per via intraperitoneale e visualizzare l'animale dopo 5-15 minuti.

4. Sintesi di nanoparticelle

1. Preparazione delle particelle
   1. Aggiungere 11,17 mL di Ferumoxytol (6 mmol di Fe in totale) a una soluzione contenente 50 mL di NaOH 5 M, 20 mL di acqua deionizzata (acqua deionizzata) e 20 mL di epicloridrina. Osservare la segregazione di fase in questa fase. Incubare la miscela a RT agitando delicatamente per 24 ore.
   2. Dopo 24 ore, la soluzione diventa uniforme. Rimuovere l'epicloridrina in eccesso utilizzando un tubo per dialisi (12.000-14.000 Da cutoff) contro l'acqua per 3 giorni.
   3. Dopo la dialisi, trasferire la soluzione rimasta nella provetta in un flacone di vetro (volume totale ~110 ml). Aggiungere 30 mL di idrossido di ammoniaca e mescolare la miscela a 37 °C per 18-20 ore.
   4. Dopo aver mescolato, ripetere la dialisi contro l'acqua per 3 giorni. Trasferire la soluzione rimanente nel tubo di dialisi in un nuovo flacone di vetro con un volume totale di ~110 ml.
2. Coniugazione dell'isotiocianato di fluoresceina (FITC)
   1. Prelevare 27,5 mL di particelle funzionalizzate con ammina per la coniugazione FITC. Concentrare le particelle utilizzando un filtro per ultracentrifugazione da 10 kDa e lavare con un tampone pH 9 (Na₂CO₃/NaHCO₃) a 5752 x g a 25 °C per 10 min.
   2. Aggiungere 4 mL di soluzione nel filtro e ultracentrifugare la provetta a 5752 x g a 25 °C per 10 min. Scartare il filtrato e riempire nuovamente il filtro con tampone per un secondo ciclo di lavaggio con lo stesso protocollo.
   3. Scartare il filtrato e raccogliere la soluzione nel filtro utilizzando una pipetta. Stimare la concentrazione molare della particella in base alla concentrazione di massa di ferumoxytol, assumendo che il diametro di ciascuna particella sia di 5 nm.
   4. Sciogliere FITC in dimetilsolfossido anidro (DMSO) a 10 mg/mL. Aggiungere lentamente 1,4 mL di FITC disciolto in DMSO nella particella concentrata funzionalizzata con ammine. Il rapporto molare di FITC: particella è 20:1. Successivamente, incubare la soluzione a 4 °C per 8 ore al buio.
   5. Estinguere la reazione aggiungendo NH₃ in eccesso. H₂O (la concentrazione finale di NH₃. H₂O è 50 mM), quindi lasciare la soluzione a 4 °C al buio per 2 ore. Lavare via l'eccesso di FITC utilizzando un tampone Na₂CO₃/NaHCO₃ (pH 9) attraverso un filtro da 10 kDa a 5752 x g a 25 °C per 10 min. Il pH finale della soluzione viene regolato a 7,4 utilizzando una soluzione acquosa di HCl.

5. 2P-IVM

NOTA: Per le sessioni 2P-IVM è stato utilizzato un microscopio Prairie Ultima IV con un tavolino personalizzato (Figura 2 e Supplemental Coding File 1) che consente di regolare la posizione della finestra cranica orizzontalmente e verticalmente. Il software Fiji è stato utilizzato per la post-elaborazione e l'analisi delle immagini. In questo modo, il raggio laser può essere regolato per colpire il vetro con un angolo di 90°, riducendo gli artefatti e migliorando la qualità dell'immagine.

1. Sessione di imaging
   1. Accendi il laser Ti-Sapphire. Accendere l'interruttore principale del sistema e il software Prairie View.
   2. Anestetizzare l'animale, come descritto sopra (passaggio 2.2). Esegui sessioni di imaging per un massimo di 2 ore per animale. Ridurre al minimo il tempo di imaging per ridurre il rischio di complicanze dell'anestesia e la morbilità o mortalità associate.
   3. Immobilizzare il topo sotto il microscopio a due fotoni utilizzando un tavolino personalizzato (Figura 1B, colonna di destra). Posizionare l'animale in posizione prona su un cuscinetto riscaldato progettato per la chirurgia dei roditori e fissarlo leggermente con del nastro adesivo facendo attenzione a non restringere il torace. Metti una goccia d'acqua sulla finestra cranica e regola la messa a fuoco.
   4. Acquisire la frequenza cardiaca e l'ossigenazione del sangue per monitorare i parametri vitali degli animali. Posizionare il sensore sulla zampa posteriore e tenere il dispositivo di monitoraggio all'esterno della camera di imaging a due fotoni.
   5. Una volta che l'animale è sul tavolino del microscopio, regolare la posizione della testa. Utilizzando il binocolo e l'illuminazione fluorescente a campo largo, impostare il filtro della proteina fluorescente rossa (RFP) e trovare il campo visivo di imaging desiderato (Figura 1B, colonna di destra).
   6. Una volta determinato l'orientamento del campione e il campo visivo, passare dalla modalità widefield alla modalità di microscopia a scansione ottica (LSM).
   7. Assicurati che il laser Ti-Sapphire sia bloccato a 920 nm e che tutti gli otturatori siano aperti. Portare le tensioni dei rivelatori a tubo fotomoltiplicatore (PMT) GaAsP fino a 500-600 V. Utilizzare due PMT con set di filtri con passa banda a 595/50 (RFP) e 525/50.
   8. Premere Live Image e modificare lentamente la cella pockel per aumentare la potenza del laser sul campione fino a quando non è visibile un'immagine.
   9. Una volta ottenuta un'immagine nitida, utilizzare il software e il tavolino motorizzato per impostare la parte superiore e inferiore di una pila di immagini all'interno dell'area campione desiderata. Attenzione alla dimensione del passo e tenere in considerazione che l'asse Z regola la profondità dell'obiettivo.
   10. Con l'aumentare della profondità, le immagini diventeranno più scure. Aumentare lentamente il guadagno pockels/PMT per mantenere l'immagine luminosa. Fai attenzione a non usare troppa energia in quanto può portare a fototossicità e danni ai tessuti.
   11. Impostate un percorso di salvataggio e avviate la serie Z. Passa automaticamente alle posizioni di partenza e di arrivo utilizzando le impostazioni pockel/PMT impostate. Una volta completata la pila, utilizzare la riproduzione per esaminare la qualità della pila. Una volta completata l'acquisizione delle immagini necessarie, spegnere il laser Ti-Sapphire.
   12. Spostare l'animale in una gabbia di recupero, come descritto sopra (passaggio 3.1).
   13. Esci dalla vista Prairie e assicurati che tutti i dati vengano salvati/trasferiti. Spegnere il computer e spegnere tutto l'hardware.
2. Post-elaborazione con FIJI
   NOTA: Fiji è un software open-source focalizzato sull'analisi di immagini biologiche²¹.
   1. Scarica FIJI per quanto riguarda il sistema operativo. Decomprimere il contenuto della cartella ed eseguire il file .exe.
   2. Trascinare il file .env raccolto dall'immagine a due fotoni nella finestra di dialogo. Dividi i canali in diverse caselle immagine. Questo creerà due immagini diverse con canali diversi, uno contenente il segnale della cella e l'altro il segnale della particella.
   3. Copia una delle immagini e fai clic su File > Nuovo > Appunti interni per creare un'altra immagine. Rinomina una delle immagini come Sorgente e l'altra come Copia.
   4. Usa l'immagine di copia e fai clic su Elabora > Migliora contrasto nella finestra di dialogo. Fare clic su Normalizza e OK , quindi su Elabora > Arrotonda. Questa immagine viene utilizzata per creare una maschera e non per l'analisi. Fare clic su Immagine > Regola > soglia nella finestra di dialogo. Utilizzare la scala scorrevole e il metodo appropriati per l'estrazione, quindi fare clic su Applica.
   5. Utilizzate Elabora > Binario > Erode per erodere i singoli pixel sullo sfondo e fate clic su Elabora > binario > Dilata per aggiungere nuovamente pixel all'immagine.
   6. Fare clic su Elabora > Calcolatrice di immagini nella finestra di dialogo, selezionare l'immagine sorgente come prima e selezionare la seconda immagine come Copia. Usate AND per creare l'intersezione di entrambe le immagini. Ripetere lo stesso passaggio per l'altra immagine del canale.
   7. Per l'analisi del segnale al di fuori della regione vascolare, apri un'immagine copiata inalterata ed elimina l'area vascolare del segnale con lo strumento ROI a mano libera.
   8. Impostare i parametri desiderati andando su Analizza > Imposta misurazioni. Assicurarsi che le opzioni Area, Densità integrata e Valore medio grigio siano selezionate.
   9. A questo punto, analizza con Analizza > Misura. Apparirà una finestra con le misure. Copiare i dati in un foglio di calcolo.
   10. Ora seleziona una piccola area dell'immagine che non ha fluorescenza. Questo sarà lo sfondo.
   11. Fare clic su Analizza > Misura per l'area geografica. Copiare i dati in un foglio di calcolo.
   12. Salvare l'immagine risultante come File > Salvare con nome > Analizza il tipo di file per rimisurazioni o pubblicazione.

Risultati

Qui, abbiamo eseguito un intervento chirurgico alla finestra cranica e innestato cellule C6 in un modello murino NSG di GBM (n = 5). Una tenuta adeguata tra tutti i componenti coinvolti nella creazione della finestra (Figura 1A) garantirà la durata delle finestre per l'imaging a lungo termine e, inoltre, ridurrà la morbilità. Utilizzando lo stadio adattato per la 2P-IVM in vivo (Figura 2), abbiamo potuto visualizzare gli animali sotto anestesia per u...

Discussione

Presentiamo un metodo per il monitoraggio in tempo reale delle NP in vivo utilizzando 2P-IVM attraverso una finestra cranica per valutare la somministrazione tumorale di NP di ossido di ferro marcate con fluorescenza. La tecnica chirurgica per questa procedura richiede una mano ferma e abilità chirurgiche sperimentali avanzate. Si consiglia di esercitarsi nell'uso di carcasse o fantasmi prima di passare all'esperienza animale dal vivo. In alternativa, Hoeferlin et al. hanno implementato un trapano robotico per ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride infusion solution	Baxter Corp	533-JB1301P
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Invitrogen	11965-092
1 mL syringes	BD	Luer-Lok syringe, REF309628
10% FBS	Thermo fisher	Cytiva SH30910.03HI
10% DMSO	Sigma-Aldrich	D8418-50ML
2-photon microscope	Prairie Technologies, Bruker	Prairie Ultima IV
Alcohol applicators, 70%	Medline Industries, LP	MDS093810
Alcohol, spray bottle	Decon Labs Inc	Decon SaniHol, 04-355-122
Aluminum foil	Reynold Brands	Reynold Wrap non-stick aluminum foil
Anesthesia machine	Patterson Scientific	SAS3
Anesthesia monitoring	Kent Scientific	MouseSTAT Jr. Rodent Pulsoxymeter
Antibiotic-Antimycotic (100x), liquid	Invitrogen	15240-096
Betadine applicators	Professional Disposables International, Inc	S41125
Biopsy punch, 5 mm	Miltex	Size 5
Buprenorphine sustained release	Zoo Pharm	Bup SR Lab, 1.0 mg/mL	A generic drug can be used instead.
C6 rat glioma cell line	ATCC (American Tissue Culture Collection)	CCL-107
Cannulas	BD	16 G, 1.1/2”, 30 G, 1”
Carprofen	Pfizer	Rimadyl, 50 mg/ml	A generic drug can be used instead.
Cefazoline	Sagent Pharmaceuticals	25021-101-10, 1 g/vial	A generic drug can be used instead.
Cell strainer, 40 µm	Fisher Scientific	87711
Cotton tip applicators, 6”	Dyad Medical Sourcing, LLC	HCS1005
Dental cement	Stoelting Co	51459	Dental cement kit, clear, 2 components
Dexamethasone	Bimeda	138RX, 2 mg/mL	A generic drug can be used instead.
DietGel	ClearH2O	Recovery, 72-06-502
Drape	Cardinal Health	Bio Shield Wrap
Drill	Saeyang Microtech	Escort Pro, B08350
Drill tips	Hager & Meissinger GmbH	REF310104001001005	Size 005, US 1/4
FIJI imaging analysis software	National Institute of Health	https://imagej.net/software/fiji/
Forceps	Fisher Scientific	13-812-41
Gauze	Fisher HealthCare	Sterile Cotton Gauze Pad, 4 x 4”, 22-415-469
Gelfoam	Ethicon Inc.	Surgifoam absorbable gelatin sponge, Ref. 1972
Germinator	Cellpoint Scientific	Germinator 500, No. 11688
Glass coverslips, 5 mm diameter	Fisher Scientific	Menzel Cover glass
Gloves, non-sterile	Fisher Scientific	Nitrile powder-free medical examination gloves
Gloves, sterile	Medline Industries, LP	MDS104070
Hair removal cream	Church & Dwight	Nair Hair remover lotion
Hamilton syringe	Hamilton Company Inc	Gastight #1701, 10 µL
HBSS without Ca, Mg	Fisher Scientific	PI88284
Head bar	Hongway	5 mm inner diameter O-rings
Heating pad	Stoelting Co.	Rodent warmer X2
Insulin syringes	Exel International Medical Products	29G x 1/2″
Iron oxide nanoparticles	Covis Pharma GmbH	Feraheme ferumoxytol injection, 510 mg/17 mL, 59338077501
Isoflurane	Dechra	26675-46-7
Mice	Jackson Laboratories	NSG, Strain 005557
Microscope (surgery)	Seiler Medical	Seiler IQ Q-100-220
Nanoparticles	Custom		Iron oxide nanoparticles (Ferumoxytol) labeled with fluorescein isothiocyanate
Ophtalmic ointment	Major pharmaceuticals	Lubrifresh P.M. nighttime ointment, 203964
Oxygen	Linde Gas & Equipment Inc.	High Pressure Steel K Style Cylinder, 249CF, 2000PSIG, CGA 540
Plastic cups	Georgia-Pacirif Consumer Products	Dixie Portion Cup, 2 oz., Plastic, Clear, PK2400
Polyethylene tubing	Braintree Scientific	50-195-5494
Scale	Ohaus Corp	CR2200
Scalpel	Integra Life Sciences Production Corp	Integra Miltex Stainless steel disposable scalpel
Scissors	Fisher Scientific	13-804-18
Sealant	Henkel Corp	Loctite 4014
Single use lab gown	High Tech Conversions	17-444-081
Stereotactic frame	Stoelting Co.	Stoelting New Standard TM
Sterile Vacuum Bottle Top Filtration Systems	Fisher Scientific	S2GPU05RE, MilliporeSigma NO.:S2GPU05RE
Styrofoam box	N/A	N/A
Surgical gloves	Cardinal Health	19-163-108
Surgical glue, 3M Vetbond tissues adhesive	3M Animal Care Prodcuts	1469SB
Tail vein cathether	Custom		Consists of two 30 G cannulas connected with sillicone tubing
TrypLE Express (1x), no phenol red	Invitrogen	12604-039
Ultraviolett torch	Spring sunshine technology	Consciot