Bir Murin Modelinde Glioblastomun İki Fotonlu İntravital Mikroskobu

Özet

Bir fare modelinde floresan etiketli demir oksit nanopartiküllerinin glioblastoma tümör iletiminin iki foton mikroskobu için yeni bir yaklaşım sunuyoruz.

Özet

İntravenöz olarak uygulanan kanser terapötiklerinin beyin tümörlerine verilmesi, kan-beyin bariyeri ile sınırlıdır. Beyin tümörlerinde makromoleküllerin birikimini ve dağılımını in vivo olarak doğrudan görüntülemek için bir yöntem, klinik öncesi modellerde ilaç dağıtımını anlama ve optimize etme yeteneğimizi büyük ölçüde artıracaktır. Bu protokol, bir fare glioblastoma (GBM) modelinde iki fotonlu intravital mikroskopi (2P-IVM) ile intravenöz olarak uygulanan floresan etiketli nanopartiküllerin gerçek zamanlı in vivo takibi için bir yöntemi açıklar.

Protokol, deney hayvanlarının anestezi ve analjezisi, bir kraniyal pencere oluşturma, GBM hücre implantasyonu, bir kafa çubuğu yerleştirme, 2P-IVM çalışmaları yürütme ve uzun süreli takip çalışmaları için cerrahi sonrası bakım dahil olmak üzere prosedürün çok aşamalı bir tanımını içerir. Temsili 2P-IVM görüntüleme seansları ve görüntü analizi gösteriyoruz, bu teknolojinin avantaj ve dezavantajlarını inceliyoruz ve potansiyel uygulamaları tartışıyoruz.

Bu yöntem, in vivo preklinik beyin görüntüleme alanındaki farklı araştırma soruları için kolayca değiştirilebilir ve uyarlanabilir.

Giriş

İki fotonlu intravital mikroskopi (2P-IVM), canlı doku^1'in görüntülenmesini sağlayan bir floresan görüntüleme tekniğidir.

İlk olarak 1990'larda geliştirilen 2P-IVM, çeşitli klinik öncesi modellerde retina², böbrek³, ince bağırsak⁴, koklea⁵, kalp⁶, trakea^{7 ve beynin} in vivo analizi için kullanılmıştır ^8,9. Sinirbilim alanında, 2P-IVM, uyanık hayvanlarda sağlıklı beynin gerçek zamanlı görüntülenmesi ....

Protokol

Bu protokolde açıklanan hayvan prosedürü, Laboratuvar Hayvanları Bakımı İdari Paneli'nin (APLAC) gerekliliklerine uygundur.

1. Hücre kültürü

1. Davlumbazın hazırlanması
   1. Ellerinizi yıkayın, eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin. Biyolojik güvenlik kabinini açın ve kanat seviyesini uygun bir açılma yüksekliğine ayarlayın. Davlumbazın 3-5 dakika kurumasına izin verin. Davlumbaz bölgesine %70 etanol püskürtün ve kağıt mendille silin.
   2. Tüm reaktifleri% 70 etanol ile püskürtün ve kağıt mendille silin. Reaktifleri kaputun içine taşıyın. Izgaraya herhangi bir eşya koymayın. Davlumbazda bir dökülme meydana geli....

Tartışmalar

Floresan etiketli demir oksit NP'lerin tümör iletimini değerlendirmek için bir kraniyal pencereden 2P-IVM kullanarak gerçek zamanlı in vivo NP takibi için bir yöntem sunuyoruz. Bu prosedür için cerrahi teknik, sabit bir el ve ileri deneysel cerrahi beceriler gerektirir. Canlı hayvan deneyimine geçmeden önce karkaslar veya hayaletler kullanarak pratik yapmanız önerilir. Alternatif olarak, Hoeferlin ve ark. termal hasarı azaltmak, cerrahi teknik değişkenliğini en aza indirmek ve cerrahiyi standa.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride infusion solution	Baxter Corp	533-JB1301P
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Invitrogen	11965-092
1 mL syringes	BD	Luer-Lok syringe, REF309628
10% FBS	Thermo fisher	Cytiva SH30910.03HI
10% DMSO	Sigma-Aldrich	D8418-50ML
2-photon microscope	Prairie Technologies, Bruker	Prairie Ultima IV
Alcohol applicators, 70%	Medline Industries, LP	MDS093810
Alcohol, spray bottle	Decon Labs Inc	Decon SaniHol, 04-355-122
Aluminum foil	Reynold Brands	Reynold Wrap non-stick aluminum foil
Anesthesia machine	Patterson Scientific	SAS3
Anesthesia monitoring	Kent Scientific	MouseSTAT Jr. Rodent Pulsoxymeter
Antibiotic-Antimycotic (100x), liquid	Invitrogen	15240-096
Betadine applicators	Professional Disposables International, Inc	S41125
Biopsy punch, 5 mm	Miltex	Size 5
Buprenorphine sustained release	Zoo Pharm	Bup SR Lab, 1.0 mg/mL	A generic drug can be used instead.
C6 rat glioma cell line	ATCC (American Tissue Culture Collection)	CCL-107
Cannulas	BD	16 G, 1.1/2”, 30 G, 1”
Carprofen	Pfizer	Rimadyl, 50 mg/ml	A generic drug can be used instead.
Cefazoline	Sagent Pharmaceuticals	25021-101-10, 1 g/vial	A generic drug can be used instead.
Cell strainer, 40 µm	Fisher Scientific	87711
Cotton tip applicators, 6”	Dyad Medical Sourcing, LLC	HCS1005
Dental cement	Stoelting Co	51459	Dental cement kit, clear, 2 components
Dexamethasone	Bimeda	138RX, 2 mg/mL	A generic drug can be used instead.
DietGel	ClearH2O	Recovery, 72-06-502
Drape	Cardinal Health	Bio Shield Wrap
Drill	Saeyang Microtech	Escort Pro, B08350
Drill tips	Hager & Meissinger GmbH	REF310104001001005	Size 005, US 1/4
FIJI imaging analysis software	National Institute of Health	https://imagej.net/software/fiji/
Forceps	Fisher Scientific	13-812-41
Gauze	Fisher HealthCare	Sterile Cotton Gauze Pad, 4 x 4”, 22-415-469
Gelfoam	Ethicon Inc.	Surgifoam absorbable gelatin sponge, Ref. 1972
Germinator	Cellpoint Scientific	Germinator 500, No. 11688
Glass coverslips, 5 mm diameter	Fisher Scientific	Menzel Cover glass
Gloves, non-sterile	Fisher Scientific	Nitrile powder-free medical examination gloves
Gloves, sterile	Medline Industries, LP	MDS104070
Hair removal cream	Church & Dwight	Nair Hair remover lotion
Hamilton syringe	Hamilton Company Inc	Gastight #1701, 10 µL
HBSS without Ca, Mg	Fisher Scientific	PI88284
Head bar	Hongway	5 mm inner diameter O-rings
Heating pad	Stoelting Co.	Rodent warmer X2
Insulin syringes	Exel International Medical Products	29G x 1/2″
Iron oxide nanoparticles	Covis Pharma GmbH	Feraheme ferumoxytol injection, 510 mg/17 mL, 59338077501
Isoflurane	Dechra	26675-46-7
Mice	Jackson Laboratories	NSG, Strain 005557
Microscope (surgery)	Seiler Medical	Seiler IQ Q-100-220
Nanoparticles	Custom		Iron oxide nanoparticles (Ferumoxytol) labeled with fluorescein isothiocyanate
Ophtalmic ointment	Major pharmaceuticals	Lubrifresh P.M. nighttime ointment, 203964
Oxygen	Linde Gas & Equipment Inc.	High Pressure Steel K Style Cylinder, 249CF, 2000PSIG, CGA 540
Plastic cups	Georgia-Pacirif Consumer Products	Dixie Portion Cup, 2 oz., Plastic, Clear, PK2400
Polyethylene tubing	Braintree Scientific	50-195-5494
Scale	Ohaus Corp	CR2200
Scalpel	Integra Life Sciences Production Corp	Integra Miltex Stainless steel disposable scalpel
Scissors	Fisher Scientific	13-804-18
Sealant	Henkel Corp	Loctite 4014
Single use lab gown	High Tech Conversions	17-444-081
Stereotactic frame	Stoelting Co.	Stoelting New Standard TM
Sterile Vacuum Bottle Top Filtration Systems	Fisher Scientific	S2GPU05RE, MilliporeSigma NO.:S2GPU05RE
Styrofoam box	N/A	N/A
Surgical gloves	Cardinal Health	19-163-108
Surgical glue, 3M Vetbond tissues adhesive	3M Animal Care Prodcuts	1469SB
Tail vein cathether	Custom		Consists of two 30 G cannulas connected with sillicone tubing
TrypLE Express (1x), no phenol red	Invitrogen	12604-039
Ultraviolett torch	Spring sunshine technology	Consciot