Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie des Glioblastoms im Mausmodell

Zusammenfassung

Wir stellen einen neuartigen Ansatz für die Zwei-Photonen-Mikroskopie der Tumorabgabe von fluoreszenzmarkierten Eisenoxid-Nanopartikeln an das Glioblastom in einem Mausmodell vor.

Zusammenfassung

Die Verabreichung von intravenös verabreichten Krebstherapeutika an Hirntumoren ist durch die Blut-Hirn-Schranke begrenzt. Eine Methode zur direkten Abbildung der Akkumulation und Verteilung von Makromolekülen in Hirntumoren in vivo würde unsere Fähigkeit, die Wirkstoffabgabe in präklinischen Modellen zu verstehen und zu optimieren, erheblich verbessern. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Echtzeit-In-vivo-Verfolgung von intravenös verabreichten fluoreszenzmarkierten Nanopartikeln mit Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie (2P-IVM) in einem Mausmodell des Glioblastoms (GBM).

Das Protokoll enthält eine mehrstufige Beschreibung des Verfahrens, einschließlich Anästhesie und Analgesie von Versuchstieren, Schaffung eines Schädelfensters, GBM-Zellimplantation, Platzierung einer Kopfstange, Durchführung von 2P-IVM-Studien und postoperativer Versorgung für Langzeit-Follow-up-Studien. Wir zeigen repräsentative 2P-IVM-Bildgebungssitzungen und Bildanalysen, untersuchen die Vor- und Nachteile dieser Technologie und diskutieren mögliche Anwendungen.

Diese Methode kann leicht modifiziert und für verschiedene Forschungsfragen im Bereich der präklinischen Hirnbildgebung in vivo angepasst werden.

Einleitung

Die Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie (2P-IVM) ist ein Fluoreszenzbildgebungsverfahren, das die Visualisierung von lebendem Gewebe^{ermöglicht 1}.

2P-IVM wurde erstmals in den 1990er Jahren entwickelt und wurde für die In-vivo-Analyse der Netzhaut², der Niere³, des Dünndarms⁴, der Cochlea⁵, des Herzens⁶, der Luftröhre^{7 und des} Gehirns in verschiedenen präklinischen Modellen verwendet ^8,9. Im Bereich....

Protokoll

Das in diesem Protokoll beschriebene Tierverfahren entspricht den Anforderungen des Verwaltungsgremiums für die Behandlung von Versuchstieren (APLAC).

1. Zellkultur

1. Vorbereitung der Haube
   1. Waschen Sie sich die Hände, tragen Sie Handschuhe und einen Laborkittel. Schalten Sie die biologische Sicherheitswerkbank ein und stellen Sie die Flügelhöhe auf eine geeignete Öffnungshöhe ein. Lassen Sie die Haube 3-5 Minuten lang reinigen. Besprühen Sie den Haubenbereich mit 70% Ethanol und wischen Sie ihn mit Seidenpapier ab.
   2. Besprühen Sie alle Reagenzien mit 70% Ethanol und wischen Sie sie mit Seidenpapier a....

Diskussion

Wir präsentieren eine Methode zur Echtzeit-In-vivo-NP-Verfolgung mit 2P-IVM durch ein kraniales Fenster, um die Tumorabgabe von fluoreszenzmarkierten Eisenoxid-NPs zu bewerten. Die Operationstechnik für diesen Eingriff erfordert eine ruhige Hand und fortgeschrittene experimentelle chirurgische Fähigkeiten. Es ist ratsam, den Umgang mit Kadavern oder Phantomen zu üben, bevor Sie zur Live-Tiererfahrung übergehen. Als Alternative implementierten Hoeferlin et al. einen Roboterbohrer, um thermische Schäden zu r.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride infusion solution	Baxter Corp	533-JB1301P
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Invitrogen	11965-092
1 mL syringes	BD	Luer-Lok syringe, REF309628
10% FBS	Thermo fisher	Cytiva SH30910.03HI
10% DMSO	Sigma-Aldrich	D8418-50ML
2-photon microscope	Prairie Technologies, Bruker	Prairie Ultima IV
Alcohol applicators, 70%	Medline Industries, LP	MDS093810
Alcohol, spray bottle	Decon Labs Inc	Decon SaniHol, 04-355-122
Aluminum foil	Reynold Brands	Reynold Wrap non-stick aluminum foil
Anesthesia machine	Patterson Scientific	SAS3
Anesthesia monitoring	Kent Scientific	MouseSTAT Jr. Rodent Pulsoxymeter
Antibiotic-Antimycotic (100x), liquid	Invitrogen	15240-096
Betadine applicators	Professional Disposables International, Inc	S41125
Biopsy punch, 5 mm	Miltex	Size 5
Buprenorphine sustained release	Zoo Pharm	Bup SR Lab, 1.0 mg/mL	A generic drug can be used instead.
C6 rat glioma cell line	ATCC (American Tissue Culture Collection)	CCL-107
Cannulas	BD	16 G, 1.1/2”, 30 G, 1”
Carprofen	Pfizer	Rimadyl, 50 mg/ml	A generic drug can be used instead.
Cefazoline	Sagent Pharmaceuticals	25021-101-10, 1 g/vial	A generic drug can be used instead.
Cell strainer, 40 µm	Fisher Scientific	87711
Cotton tip applicators, 6”	Dyad Medical Sourcing, LLC	HCS1005
Dental cement	Stoelting Co	51459	Dental cement kit, clear, 2 components
Dexamethasone	Bimeda	138RX, 2 mg/mL	A generic drug can be used instead.
DietGel	ClearH2O	Recovery, 72-06-502
Drape	Cardinal Health	Bio Shield Wrap
Drill	Saeyang Microtech	Escort Pro, B08350
Drill tips	Hager & Meissinger GmbH	REF310104001001005	Size 005, US 1/4
FIJI imaging analysis software	National Institute of Health	https://imagej.net/software/fiji/
Forceps	Fisher Scientific	13-812-41
Gauze	Fisher HealthCare	Sterile Cotton Gauze Pad, 4 x 4”, 22-415-469
Gelfoam	Ethicon Inc.	Surgifoam absorbable gelatin sponge, Ref. 1972
Germinator	Cellpoint Scientific	Germinator 500, No. 11688
Glass coverslips, 5 mm diameter	Fisher Scientific	Menzel Cover glass
Gloves, non-sterile	Fisher Scientific	Nitrile powder-free medical examination gloves
Gloves, sterile	Medline Industries, LP	MDS104070
Hair removal cream	Church & Dwight	Nair Hair remover lotion
Hamilton syringe	Hamilton Company Inc	Gastight #1701, 10 µL
HBSS without Ca, Mg	Fisher Scientific	PI88284
Head bar	Hongway	5 mm inner diameter O-rings
Heating pad	Stoelting Co.	Rodent warmer X2
Insulin syringes	Exel International Medical Products	29G x 1/2″
Iron oxide nanoparticles	Covis Pharma GmbH	Feraheme ferumoxytol injection, 510 mg/17 mL, 59338077501
Isoflurane	Dechra	26675-46-7
Mice	Jackson Laboratories	NSG, Strain 005557
Microscope (surgery)	Seiler Medical	Seiler IQ Q-100-220
Nanoparticles	Custom		Iron oxide nanoparticles (Ferumoxytol) labeled with fluorescein isothiocyanate
Ophtalmic ointment	Major pharmaceuticals	Lubrifresh P.M. nighttime ointment, 203964
Oxygen	Linde Gas & Equipment Inc.	High Pressure Steel K Style Cylinder, 249CF, 2000PSIG, CGA 540
Plastic cups	Georgia-Pacirif Consumer Products	Dixie Portion Cup, 2 oz., Plastic, Clear, PK2400
Polyethylene tubing	Braintree Scientific	50-195-5494
Scale	Ohaus Corp	CR2200
Scalpel	Integra Life Sciences Production Corp	Integra Miltex Stainless steel disposable scalpel
Scissors	Fisher Scientific	13-804-18
Sealant	Henkel Corp	Loctite 4014
Single use lab gown	High Tech Conversions	17-444-081
Stereotactic frame	Stoelting Co.	Stoelting New Standard TM
Sterile Vacuum Bottle Top Filtration Systems	Fisher Scientific	S2GPU05RE, MilliporeSigma NO.:S2GPU05RE
Styrofoam box	N/A	N/A
Surgical gloves	Cardinal Health	19-163-108
Surgical glue, 3M Vetbond tissues adhesive	3M Animal Care Prodcuts	1469SB
Tail vein cathether	Custom		Consists of two 30 G cannulas connected with sillicone tubing
TrypLE Express (1x), no phenol red	Invitrogen	12604-039
Ultraviolett torch	Spring sunshine technology	Consciot