Двухфотонная прижизненная микроскопия глиобластомы на мышиной модели

Резюме

Представлен новый подход к двухфотонной микроскопии доставки из опухоли флуоресцентно-меченых наночастиц оксида железа в глиобластому на мышиной модели.

Аннотация

Внутривенное введение противораковых препаратов к опухолям головного мозга ограничено гематоэнцефалическим барьером. Метод прямой визуализации накопления и распределения макромолекул в опухолях головного мозга in vivo значительно расширит нашу способность понимать и оптимизировать доставку лекарств в доклинических моделях. Этот протокол описывает метод отслеживания in vivo в режиме реального времени внутривенно введенных флуоресцентно меченных наночастиц с помощью двухфотонной прижизненной микроскопии (2P-IVM) на мышиной модели глиобластомы (GBM).

Протокол содержит многоступенчатое описание процедуры, включающее анестезию и анальгезию экспериментальных животных, создание краниального окна, имплантацию клеток GBM, установку планки на голову, проведение исследований 2P-IVM и послеоперационный уход для долгосрочных последующих исследований. Мы покажем репрезентативные сеансы визуализации 2P-IVM и анализ изображений, рассмотрим преимущества и недостатки этой технологии, а также обсудим потенциальные области применения.

Этот метод может быть легко модифицирован и адаптирован для различных исследовательских задач в области доклинической визуализации головного мозга in vivo .

Введение

Двухфотонная прижизненная микроскопия (2P-IVM) — это метод флуоресцентной визуализации, который позволяет визуализировать живую ткань¹.

Впервые разработанный в 1990-х годах, метод 2P-IVM использовался для анализа in vivo сетчатки², почки³, тонкой кишки⁴, улитки⁵, сердца⁶, трахеи^{7 и} головного мозга в различных доклинических моделях ^8,9. В области неврологии 2P-IVM приобрел важное значение как метод ....

протокол

Процедура содержания животных, описанная в этом протоколе, соответствует требованиям Административной группы по уходу за лабораторными животными (APLAC).

1. Клеточная культура

1. Подготовка вытяжки
   1. Вымойте руки, наденьте перчатки и лабораторный халат. Включите шкаф биологической безопасности и установите уровень створки на соответствующую высоту открывания. Дайте вытяжке продуться в течение 3-5 минут. Опрыскайте область капюшона 70% этиловым спиртом и протрите папиросной бумагой.
   2. Опрыскайте все реагенты 70% этиловым спиртом и протрите папиросной бумагой. Переместите реагенты в колпак. Не кладите на ....

Результаты

Здесь мы выполнили операцию на краниальном окне и приживили клетки C6 в мышиной модели GBM NSG (n = 5). Надлежащая герметизация между всеми компонентами, участвующими в создании окна (рис. 1A), обеспечит долговечность окон при длительной визуализации и, кроме того, снизит заболе?.......

Обсуждение

Мы представляем метод отслеживания НЧ in vivo в режиме реального времени с использованием 2P-IVM через краниальное окно для оценки доставки в опухоль флуоресцентно меченных НЧ оксида железа. Хирургическая техника этой процедуры требует твердой руки и продвинутых экспериментальных хи?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride infusion solution	Baxter Corp	533-JB1301P
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Invitrogen	11965-092
1 mL syringes	BD	Luer-Lok syringe, REF309628
10% FBS	Thermo fisher	Cytiva SH30910.03HI
10% DMSO	Sigma-Aldrich	D8418-50ML
2-photon microscope	Prairie Technologies, Bruker	Prairie Ultima IV
Alcohol applicators, 70%	Medline Industries, LP	MDS093810
Alcohol, spray bottle	Decon Labs Inc	Decon SaniHol, 04-355-122
Aluminum foil	Reynold Brands	Reynold Wrap non-stick aluminum foil
Anesthesia machine	Patterson Scientific	SAS3
Anesthesia monitoring	Kent Scientific	MouseSTAT Jr. Rodent Pulsoxymeter
Antibiotic-Antimycotic (100x), liquid	Invitrogen	15240-096
Betadine applicators	Professional Disposables International, Inc	S41125
Biopsy punch, 5 mm	Miltex	Size 5
Buprenorphine sustained release	Zoo Pharm	Bup SR Lab, 1.0 mg/mL	A generic drug can be used instead.
C6 rat glioma cell line	ATCC (American Tissue Culture Collection)	CCL-107
Cannulas	BD	16 G, 1.1/2”, 30 G, 1”
Carprofen	Pfizer	Rimadyl, 50 mg/ml	A generic drug can be used instead.
Cefazoline	Sagent Pharmaceuticals	25021-101-10, 1 g/vial	A generic drug can be used instead.
Cell strainer, 40 µm	Fisher Scientific	87711
Cotton tip applicators, 6”	Dyad Medical Sourcing, LLC	HCS1005
Dental cement	Stoelting Co	51459	Dental cement kit, clear, 2 components
Dexamethasone	Bimeda	138RX, 2 mg/mL	A generic drug can be used instead.
DietGel	ClearH2O	Recovery, 72-06-502
Drape	Cardinal Health	Bio Shield Wrap
Drill	Saeyang Microtech	Escort Pro, B08350
Drill tips	Hager & Meissinger GmbH	REF310104001001005	Size 005, US 1/4
FIJI imaging analysis software	National Institute of Health	https://imagej.net/software/fiji/
Forceps	Fisher Scientific	13-812-41
Gauze	Fisher HealthCare	Sterile Cotton Gauze Pad, 4 x 4”, 22-415-469
Gelfoam	Ethicon Inc.	Surgifoam absorbable gelatin sponge, Ref. 1972
Germinator	Cellpoint Scientific	Germinator 500, No. 11688
Glass coverslips, 5 mm diameter	Fisher Scientific	Menzel Cover glass
Gloves, non-sterile	Fisher Scientific	Nitrile powder-free medical examination gloves
Gloves, sterile	Medline Industries, LP	MDS104070
Hair removal cream	Church & Dwight	Nair Hair remover lotion
Hamilton syringe	Hamilton Company Inc	Gastight #1701, 10 µL
HBSS without Ca, Mg	Fisher Scientific	PI88284
Head bar	Hongway	5 mm inner diameter O-rings
Heating pad	Stoelting Co.	Rodent warmer X2
Insulin syringes	Exel International Medical Products	29G x 1/2″
Iron oxide nanoparticles	Covis Pharma GmbH	Feraheme ferumoxytol injection, 510 mg/17 mL, 59338077501
Isoflurane	Dechra	26675-46-7
Mice	Jackson Laboratories	NSG, Strain 005557
Microscope (surgery)	Seiler Medical	Seiler IQ Q-100-220
Nanoparticles	Custom		Iron oxide nanoparticles (Ferumoxytol) labeled with fluorescein isothiocyanate
Ophtalmic ointment	Major pharmaceuticals	Lubrifresh P.M. nighttime ointment, 203964
Oxygen	Linde Gas & Equipment Inc.	High Pressure Steel K Style Cylinder, 249CF, 2000PSIG, CGA 540
Plastic cups	Georgia-Pacirif Consumer Products	Dixie Portion Cup, 2 oz., Plastic, Clear, PK2400
Polyethylene tubing	Braintree Scientific	50-195-5494
Scale	Ohaus Corp	CR2200
Scalpel	Integra Life Sciences Production Corp	Integra Miltex Stainless steel disposable scalpel
Scissors	Fisher Scientific	13-804-18
Sealant	Henkel Corp	Loctite 4014
Single use lab gown	High Tech Conversions	17-444-081
Stereotactic frame	Stoelting Co.	Stoelting New Standard TM
Sterile Vacuum Bottle Top Filtration Systems	Fisher Scientific	S2GPU05RE, MilliporeSigma NO.:S2GPU05RE
Styrofoam box	N/A	N/A
Surgical gloves	Cardinal Health	19-163-108
Surgical glue, 3M Vetbond tissues adhesive	3M Animal Care Prodcuts	1469SB
Tail vein cathether	Custom		Consists of two 30 G cannulas connected with sillicone tubing
TrypLE Express (1x), no phenol red	Invitrogen	12604-039
Ultraviolett torch	Spring sunshine technology	Consciot