쥐 모델에서 교모세포종의 Two-Photon Intravital Microscopy

요약

우리는 마우스 모델에서 형광 표지된 산화철 나노입자를 교모세포종에 전달하는 종양 전달에 대한 이광자 현미경에 대한 새로운 접근 방식을 제시합니다.

초록

뇌종양에 정맥 주사로 투여되는 암 치료제의 전달은 혈액-뇌 장벽에 의해 제한됩니다. 생체 내 뇌종양에서 거대분자의 축적 및 분포를 직접 이미지화하는 방법은 전임상 모델에서 약물 전달을 이해하고 최적화하는 능력을 크게 향상시킬 것입니다. 이 프로토콜은 교모세포종(GBM)의 마우스 모델에서 2광자 생체 내 현미경(2P-IVM)을 사용하여 정맥 투여된 형광 표지 나노 입자의 실시간 생체 내 추적 방법을 설명합니다.

프로토콜에는 실험 동물의 마취 및 진통, 두개골 창 만들기, 교모세포종 세포 이식, 헤드 바 배치, 2P-IVM 연구 수행 및 장기 추적 연구를 위한 수술 후 관리를 포함한 절차에 대한 다단계 설명이 포함되어 있습니다. 대표적인 2P-IVM 이미징 세션과 이미지 분석을 보여주고, 이 기술의 장점과 단점을 살펴보고, 잠재적인 응용 분야에 대해 논의합니다.

이 방법은 생체 내 전임상 뇌 영상 분야의 다양한 연구 질문에 대해 쉽게 수정하고 적용할 수 있습니다.

서문

2광자 생체 내 현미경(2P-IVM)은 생체 조직¹을 시각화할 수 있는 형광 이미징 기술입니다.

1990년대에 처음 개발된 2P-IVM은 다양한 전임상 모델에서 망막², 신장³, 소장⁴, 달팽이관⁵, 심장⁶, 기관^{7 및 뇌}의 생체 내 분석에 사용되었습니다 ^8,9. 신경과학 분야에서, 2P-IVM은 알츠하이머병¹¹, 파킨슨병¹² 및 교모세포종(GBM)13,14,15,16과 같은 신경계 질환을 연구할 뿐만 아니라, 깨어 있는 동물¹⁰에서 건강한 뇌의 실시간 이미징을 위한 기술로서 중....

프로토콜

이 프로토콜에 설명된 동물 절차는 APLAC(Administrative Panel on Laboratory Animal Care)의 요구 사항을 따릅니다.

1. 세포 배양

1. 후드 준비
   1. 손을 씻고 장갑과 실험실 가운을 착용하십시오. 생물 안전 작업대를 켜고 새시 높이를 적절한 개방 높이로 설정합니다. 후드를 3-5분 동안 퍼지시키십시오. 후드 부분에 70% 에탄올을 뿌리고 티슈 페이퍼로 닦아냅니다.
   2. 모든 시약에 70% 에탄올을 뿌리고 티슈 페이퍼로 닦아냅니다. 시약을 후드로 옮깁니다. 그릴 위에 물건을 올려 놓지 마십시오. 후드에 엎질러진 경우 물티슈로 덮고 70% 에탄올을 뿌린 다음 다시 닦으십시오.
   3. 실험이 끝나면 각 품목의 뚜껑을 조심스럽게 닫고 모든 재료를 닦고 후드에서 품목을 제거한 다음 원래 위치로 옮깁니다. 후드에 70% 에탄올을 뿌리고 닦아냅니다. 새시를 닫고 생물 안전 작업대를 끕니다.
2. 성장 배지의 제조
   1. 50mL의 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)에 100% 소 태아 혈청(FBS) 50mL를 추가합니다. 항생제-항진균액 5mL(100×)를 추가합니....

토론

두개창을 통해 2P-IVM을 사용하여 형광 표지된 산화철 NP의 종양 전달을 평가하는 실시간 in vivo NP 추적 방법을 제시합니다. 이 시술을 위한 수술 기법은 안정된 손과 고급 실험 수술 기술을 필요로 합니다. 살아있는 동물 체험으로 넘어가기 전에 사체나 유령을 사용하는 연습을 하는 것이 좋습니다. 이에 대한 대안으로 Hoeferlin 등은 로봇 드릴을 구현하여 열 손상을 줄이고, 수술 기법의 변동성.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride infusion solution	Baxter Corp	533-JB1301P
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Invitrogen	11965-092
1 mL syringes	BD	Luer-Lok syringe, REF309628
10% FBS	Thermo fisher	Cytiva SH30910.03HI
10% DMSO	Sigma-Aldrich	D8418-50ML
2-photon microscope	Prairie Technologies, Bruker	Prairie Ultima IV
Alcohol applicators, 70%	Medline Industries, LP	MDS093810
Alcohol, spray bottle	Decon Labs Inc	Decon SaniHol, 04-355-122
Aluminum foil	Reynold Brands	Reynold Wrap non-stick aluminum foil
Anesthesia machine	Patterson Scientific	SAS3
Anesthesia monitoring	Kent Scientific	MouseSTAT Jr. Rodent Pulsoxymeter
Antibiotic-Antimycotic (100x), liquid	Invitrogen	15240-096
Betadine applicators	Professional Disposables International, Inc	S41125
Biopsy punch, 5 mm	Miltex	Size 5
Buprenorphine sustained release	Zoo Pharm	Bup SR Lab, 1.0 mg/mL	A generic drug can be used instead.
C6 rat glioma cell line	ATCC (American Tissue Culture Collection)	CCL-107
Cannulas	BD	16 G, 1.1/2”, 30 G, 1”
Carprofen	Pfizer	Rimadyl, 50 mg/ml	A generic drug can be used instead.
Cefazoline	Sagent Pharmaceuticals	25021-101-10, 1 g/vial	A generic drug can be used instead.
Cell strainer, 40 µm	Fisher Scientific	87711
Cotton tip applicators, 6”	Dyad Medical Sourcing, LLC	HCS1005
Dental cement	Stoelting Co	51459	Dental cement kit, clear, 2 components
Dexamethasone	Bimeda	138RX, 2 mg/mL	A generic drug can be used instead.
DietGel	ClearH2O	Recovery, 72-06-502
Drape	Cardinal Health	Bio Shield Wrap
Drill	Saeyang Microtech	Escort Pro, B08350
Drill tips	Hager & Meissinger GmbH	REF310104001001005	Size 005, US 1/4
FIJI imaging analysis software	National Institute of Health	https://imagej.net/software/fiji/
Forceps	Fisher Scientific	13-812-41
Gauze	Fisher HealthCare	Sterile Cotton Gauze Pad, 4 x 4”, 22-415-469
Gelfoam	Ethicon Inc.	Surgifoam absorbable gelatin sponge, Ref. 1972
Germinator	Cellpoint Scientific	Germinator 500, No. 11688
Glass coverslips, 5 mm diameter	Fisher Scientific	Menzel Cover glass
Gloves, non-sterile	Fisher Scientific	Nitrile powder-free medical examination gloves
Gloves, sterile	Medline Industries, LP	MDS104070
Hair removal cream	Church & Dwight	Nair Hair remover lotion
Hamilton syringe	Hamilton Company Inc	Gastight #1701, 10 µL
HBSS without Ca, Mg	Fisher Scientific	PI88284
Head bar	Hongway	5 mm inner diameter O-rings
Heating pad	Stoelting Co.	Rodent warmer X2
Insulin syringes	Exel International Medical Products	29G x 1/2″
Iron oxide nanoparticles	Covis Pharma GmbH	Feraheme ferumoxytol injection, 510 mg/17 mL, 59338077501
Isoflurane	Dechra	26675-46-7
Mice	Jackson Laboratories	NSG, Strain 005557
Microscope (surgery)	Seiler Medical	Seiler IQ Q-100-220
Nanoparticles	Custom		Iron oxide nanoparticles (Ferumoxytol) labeled with fluorescein isothiocyanate
Ophtalmic ointment	Major pharmaceuticals	Lubrifresh P.M. nighttime ointment, 203964
Oxygen	Linde Gas & Equipment Inc.	High Pressure Steel K Style Cylinder, 249CF, 2000PSIG, CGA 540
Plastic cups	Georgia-Pacirif Consumer Products	Dixie Portion Cup, 2 oz., Plastic, Clear, PK2400
Polyethylene tubing	Braintree Scientific	50-195-5494
Scale	Ohaus Corp	CR2200
Scalpel	Integra Life Sciences Production Corp	Integra Miltex Stainless steel disposable scalpel
Scissors	Fisher Scientific	13-804-18
Sealant	Henkel Corp	Loctite 4014
Single use lab gown	High Tech Conversions	17-444-081
Stereotactic frame	Stoelting Co.	Stoelting New Standard TM
Sterile Vacuum Bottle Top Filtration Systems	Fisher Scientific	S2GPU05RE, MilliporeSigma NO.:S2GPU05RE
Styrofoam box	N/A	N/A
Surgical gloves	Cardinal Health	19-163-108
Surgical glue, 3M Vetbond tissues adhesive	3M Animal Care Prodcuts	1469SB
Tail vein cathether	Custom		Consists of two 30 G cannulas connected with sillicone tubing
TrypLE Express (1x), no phenol red	Invitrogen	12604-039
Ultraviolett torch	Spring sunshine technology	Consciot