マウスモデルにおける神経膠芽腫の2光子生体内顕微鏡

要約

マウスモデルにおける膠芽腫への蛍光標識酸化鉄ナノ粒子の腫瘍送達の2光子顕微鏡法の新しいアプローチを紹介します。

要約

脳腫瘍に対する静脈内投与されたがん治療薬の送達は、血液脳関門によって制限される。 in vivo における脳腫瘍における高分子の蓄積と分布を直接画像化する方法は、前臨床モデルにおける薬物送達を理解し、最適化する能力を大幅に向上させるでしょう。このプロトコルはglioblastoma (GBM)のマウス モデルの2光子のintravital顕微鏡検査(2P-IVM)の静脈内投与された蛍光標識されたnanoparticlesの生体 内の 追跡のための実時間方法を説明する。

プロトコルには、実験動物の麻酔と鎮痛、頭蓋窓の作成、GBM細胞の移植、ヘッドバーの配置、2P-IVM研究の実施、長期フォローアップ研究のための術後ケアなど、手順の多段階の説明が含まれています。代表的な2P-IVMイメージングセッションと画像解析を示し、この技術の長所と短所を検討し、潜在的なアプリケーションについて議論します。

この方法は、 in vivo 前臨床脳イメージングの分野におけるさまざまな研究課題に簡単に変更および適応できます。

概要

2光子生体内顕微鏡(2P-IVM)は、生体組織¹の可視化を可能にする蛍光イメージング技術です。

1990年代に初めて開発された2P-IVMは、網膜²、腎臓³、小腸⁴、蝸牛⁵、心臓⁶、気管^7、脳のin vivo解析にさまざまな前^{臨床モデルで}使用されています^8,9。神経科学の分野では、2P-IVMは、覚醒動物の健康な脳のリアルタイムイメージング¹⁰や、アルツハイマー病¹¹、パーキンソン病¹²、神経膠芽腫(GBM)13、^14、15、16などの神経系疾患の研究技術として重要性を増しています

プロトコル

このプロトコルに記載されている動物手順は、実験動物管理委員会(APLAC)の要件に準拠しています。

1. 細胞培養

1. フードの準備
   1. 手を洗い、手袋と白衣を着用してください。生物学的安全キャビネットの電源を入れ、サッシのレベルを適切な開口部の高さに設定します。フードを3〜5分間パージします。フード部分に70%エタノールをスプレーし、ティッシュペーパーで拭き取ります。
   2. すべての試薬に70%エタノールをスプレーし、ティッシュペーパーで拭き取ります。試薬をフードに移します。グリルの上に物を置かないでください。フードにこぼれた場合は、ワイプで覆い、70%エタノールをスプレーしてから、もう一度拭いてください。
   3. 実験後、各アイテムの蓋を慎重に閉め、すべての材料を拭き取り、フードからアイテムをすべて取り外して、元の場所に移します。フードに70%エタノールをスプレーし、拭き取ります。サッシを閉め、生物学的安全キャビネットの電源を切ります。
2. 増殖培地の調製
   1. 50 mLの100%ウシ胎児血清(FBS)を500 mLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に加えます。5 mLの抗生物質-抗真菌剤溶液(100x)を追加します。
   2. すべての試薬を滅菌済みの500 mLろ過ボトル(0.22 μmフィルター)に通します。<....

ディスカッション

頭蓋窓を通る2P-IVMを使用して、蛍光標識酸化鉄NPの腫瘍送達を評価するためのリアルタイムin vivoNP 追跡方法を紹介します。この手術の手術技術には、安定した手と高度な実験的手術技術が必要です。生きた動物の体験に進む前に、死骸やファントムを使って練習することをお勧めします。代替案として、Hoeferlinらは、熱損傷を減らし、手術技術のばらつきを最小限に抑え、手術を標準?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride infusion solution	Baxter Corp	533-JB1301P
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Invitrogen	11965-092
1 mL syringes	BD	Luer-Lok syringe, REF309628
10% FBS	Thermo fisher	Cytiva SH30910.03HI
10% DMSO	Sigma-Aldrich	D8418-50ML
2-photon microscope	Prairie Technologies, Bruker	Prairie Ultima IV
Alcohol applicators, 70%	Medline Industries, LP	MDS093810
Alcohol, spray bottle	Decon Labs Inc	Decon SaniHol, 04-355-122
Aluminum foil	Reynold Brands	Reynold Wrap non-stick aluminum foil
Anesthesia machine	Patterson Scientific	SAS3
Anesthesia monitoring	Kent Scientific	MouseSTAT Jr. Rodent Pulsoxymeter
Antibiotic-Antimycotic (100x), liquid	Invitrogen	15240-096
Betadine applicators	Professional Disposables International, Inc	S41125
Biopsy punch, 5 mm	Miltex	Size 5
Buprenorphine sustained release	Zoo Pharm	Bup SR Lab, 1.0 mg/mL	A generic drug can be used instead.
C6 rat glioma cell line	ATCC (American Tissue Culture Collection)	CCL-107
Cannulas	BD	16 G, 1.1/2”, 30 G, 1”
Carprofen	Pfizer	Rimadyl, 50 mg/ml	A generic drug can be used instead.
Cefazoline	Sagent Pharmaceuticals	25021-101-10, 1 g/vial	A generic drug can be used instead.
Cell strainer, 40 µm	Fisher Scientific	87711
Cotton tip applicators, 6”	Dyad Medical Sourcing, LLC	HCS1005
Dental cement	Stoelting Co	51459	Dental cement kit, clear, 2 components
Dexamethasone	Bimeda	138RX, 2 mg/mL	A generic drug can be used instead.
DietGel	ClearH2O	Recovery, 72-06-502
Drape	Cardinal Health	Bio Shield Wrap
Drill	Saeyang Microtech	Escort Pro, B08350
Drill tips	Hager & Meissinger GmbH	REF310104001001005	Size 005, US 1/4
FIJI imaging analysis software	National Institute of Health	https://imagej.net/software/fiji/
Forceps	Fisher Scientific	13-812-41
Gauze	Fisher HealthCare	Sterile Cotton Gauze Pad, 4 x 4”, 22-415-469
Gelfoam	Ethicon Inc.	Surgifoam absorbable gelatin sponge, Ref. 1972
Germinator	Cellpoint Scientific	Germinator 500, No. 11688
Glass coverslips, 5 mm diameter	Fisher Scientific	Menzel Cover glass
Gloves, non-sterile	Fisher Scientific	Nitrile powder-free medical examination gloves
Gloves, sterile	Medline Industries, LP	MDS104070
Hair removal cream	Church & Dwight	Nair Hair remover lotion
Hamilton syringe	Hamilton Company Inc	Gastight #1701, 10 µL
HBSS without Ca, Mg	Fisher Scientific	PI88284
Head bar	Hongway	5 mm inner diameter O-rings
Heating pad	Stoelting Co.	Rodent warmer X2
Insulin syringes	Exel International Medical Products	29G x 1/2″
Iron oxide nanoparticles	Covis Pharma GmbH	Feraheme ferumoxytol injection, 510 mg/17 mL, 59338077501
Isoflurane	Dechra	26675-46-7
Mice	Jackson Laboratories	NSG, Strain 005557
Microscope (surgery)	Seiler Medical	Seiler IQ Q-100-220
Nanoparticles	Custom		Iron oxide nanoparticles (Ferumoxytol) labeled with fluorescein isothiocyanate
Ophtalmic ointment	Major pharmaceuticals	Lubrifresh P.M. nighttime ointment, 203964
Oxygen	Linde Gas & Equipment Inc.	High Pressure Steel K Style Cylinder, 249CF, 2000PSIG, CGA 540
Plastic cups	Georgia-Pacirif Consumer Products	Dixie Portion Cup, 2 oz., Plastic, Clear, PK2400
Polyethylene tubing	Braintree Scientific	50-195-5494
Scale	Ohaus Corp	CR2200
Scalpel	Integra Life Sciences Production Corp	Integra Miltex Stainless steel disposable scalpel
Scissors	Fisher Scientific	13-804-18
Sealant	Henkel Corp	Loctite 4014
Single use lab gown	High Tech Conversions	17-444-081
Stereotactic frame	Stoelting Co.	Stoelting New Standard TM
Sterile Vacuum Bottle Top Filtration Systems	Fisher Scientific	S2GPU05RE, MilliporeSigma NO.:S2GPU05RE
Styrofoam box	N/A	N/A
Surgical gloves	Cardinal Health	19-163-108
Surgical glue, 3M Vetbond tissues adhesive	3M Animal Care Prodcuts	1469SB
Tail vein cathether	Custom		Consists of two 30 G cannulas connected with sillicone tubing
TrypLE Express (1x), no phenol red	Invitrogen	12604-039
Ultraviolett torch	Spring sunshine technology	Consciot