A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف البروتوكول الحالي مقايسات العدوى لاستجواب الالتزام بالشيغيلا والغزو والتكاثر داخل الخلايا باستخدام خطوط الخلايا الظهارية في المختبر .

Abstract

يسبب العامل الممرض البكتيري المعوي المتكيف مع الإنسان Shigella ملايين الإصابات كل عام ، ويخلق تأثيرات نمو طويلة الأجل بين مرضى الأطفال ، وهو سبب رئيسي لوفيات الإسهال في جميع أنحاء العالم. تسبب العدوى الإسهال المائي أو الدموي نتيجة لعبور العامل الممرض للجهاز الهضمي وإصابة الخلايا الظهارية المبطنة للقولون. مع الزيادات المذهلة في مقاومة المضادات الحيوية والنقص الحالي في اللقاحات المعتمدة ، تعد بروتوكولات البحث الموحدة ضرورية لدراسة هذا العامل الممرض الهائل. هنا ، يتم تقديم منهجيات لفحص التسبب الجزيئي للشيغيلا باستخدام التحليلات المختبرية للالتصاق البكتيري والغزو والتكاثر داخل الخلايا في الخلايا الظهارية القولونية. قبل تحليلات العدوى ، تم التحقق من النمط الظاهري للضراوة لمستعمرات الشيغيلا من خلال امتصاص صبغة الكونغو الحمراء على ألواح الآجار. يمكن أيضا اعتبار الوسائط المختبرية المكملة أثناء الزراعة البكتيرية لتقليد الظروف في الجسم الحي . ثم تستخدم الخلايا البكتيرية في بروتوكول موحد لإصابة الخلايا الظهارية القولونية في لوحات زراعة الأنسجة في تعدد ثابت من العدوى مع التكيفات لتحليل كل مرحلة من مراحل العدوى. لمقايسات الالتصاق ، يتم تحضين خلايا الشيغيلا بمستويات وسائط منخفضة لتعزيز الاتصال البكتيري بالخلايا الظهارية. لكل من مقايسات الغزو والتكرار داخل الخلايا ، يتم تطبيق الجنتاميسين لفترات زمنية مختلفة للقضاء على البكتيريا خارج الخلية وتمكين تقييم الغزو و / أو القياس الكمي لمعدلات النسخ المتماثل داخل الخلايا. تعدد جميع بروتوكولات العدوى البكتيريا الملتصقة و / أو الغازية و / أو داخل الخلايا عن طريق التخفيف المتسلسل لمحللات الخلايا الظهارية المصابة وطلاء وحدات تشكيل المستعمرة البكتيرية المتعلقة بإصابة التتر على ألواح أجار الكونغو الحمراء. تتيح هذه البروتوكولات معا توصيفا ومقارنات مستقلة لكل مرحلة من مراحل عدوى الشيغيلة للخلايا الظهارية لدراسة هذا العامل الممرض بنجاح.

Introduction

تشكل أمراض الإسهال التي تسببها مسببات الأمراض البكتيرية المعوية عبئا صحيا عالميا كبيرا. في عام 2016 ، كانت أمراض الإسهال مسؤولة عن 1.3 مليون حالة وفاة في جميع أنحاء العالم وكانت السبب الرئيسي الرابع للوفاة بين الأطفال الذين تقل أعمارهم عن خمس سنوات من سن 1,2. الممرض البكتيري المعوي سلبي الجرام Shigella هو العامل المسبب لداء الشيغيلات ، وهو سبب رئيسي لوفيات الإسهال في جميع أنحاء العالم3. يسبب داء الشيغيلات معدلات اعتلال ووفيات كبيرة كل عام لدى الأطفال من البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل 4,5 ، بينما ترتبط العدوى في البلدا....

Protocol

1. تحضير الكواشف والمواد

ملاحظة: تتوافق جميع وحدات التخزين مع الفحص باستخدام لوحين من 6 آبار.

  1. وسط TSB: أضف 0.5 لتر من الماء منزوع الأيونات (DI) إلى 15 جم من مرق الصويا التربتيك (TSB ، انظر جدول المواد) والأوتوكلاف. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
  2. وسط الأملاح الصفراوية (TSB + BS): لتحضير مكتب تقييس الاتصالات الذي يحتوي على 0,4٪ (وزن/حجم) من الأملاح الصفراوية، أعد تعليق 0,06 غرام من الأملاح الصفراوية (BS، انظر جدول المواد) في 15 مل من TSB المعقم. تعقيم المرشح باستخدام مرشح PES 0.22 ميكرومتر.
    ملاحظة: تتكون الأملاح الصفراوية من خليط 1: 1 من كولات الصوديوم وديوكسي كولات الصوديو....

النتائج

تم إجراء فحوصات الالتصاق والغزو والتكرار داخل الخلايا بمقارنة النوع البري S. flexneri 2457T (WT) إلى S. flexneri ΔVF (ΔVF) ، وهو متحولة يفترض أنها تنظم ضراوة الشيغيلا بشكل سلبي. وبما أن الشيغيلا تستخدم الأملاح الصفراوية كإشارة لتنظيم الفوعة17،18،

Discussion

يصف هذا البروتوكول مجموعة من ثلاثة مقايسات موحدة لدراسة التصاق الشيغيلة وغزوها وتكرارها داخل الخلايا للخلايا الظهارية المعوية. على الرغم من أن هذه الطرق هي مجرد نسخ معدلة من مقايسات الجنتاميسين الكلاسيكية المستخدمة لدراسة الغزو والتكاثر داخل الخلايا لمختلف مسببات الأمراض البكتير?.......

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

يشمل دعم المؤلفين قسم طب الأطفال في مستشفى ماساتشوستس العام ، وجائزة اللجنة التنفيذية لتمويل الدعم المؤقت للأبحاث (ISF) 2022A009041 ، ومنحة المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية R21AI146405 ، والمعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى منحة مركز أبحاث السمنة الغذائية في جامعة هارفارد (NORCH) 2P30DK040561-26. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرار النشر أو إعداد المخطوطة.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 μm PES filterMillipore-SigmaSCGP00525Sterile, polyethersulfone filter for sterilizing up to 50 mL media
14 mL culture tubesCorning35205917 mm x 100 mm polypropylene test tubes with cap
50 mL conical tubesCorning43082950 mL clear polypropylene conical bottom centrifuge tubes with leak-proof cap
6-well tissue culture platesCorning3516Plates are treated for optimal cell attachment
Bile saltsSigma-AldrichB87561:1 ratio of cholate to deoxycholate
Congo red dyeSigma-AldrichC6277A benzidine-based anionic diazo dye, >85% purity
Countess cell counting chamber slideInvitrogenC10283To be used with the Countess Automated Cell Counter
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD8418A a highly polar organic reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco10569-010DMEM is supplemented with high glucose, sodium pyruvate, GlutaMAX, and Phenol Red
Fetal Bovine Serum (FBS)Sigma-AldrichF4135Heat-inactivated, sterile
GentamicinSigma-AldrichG3632Stock concentration is 50 mg/mL
HT-29 cell lineATCCHTB-38Adenocarcinoma cell line; colorectal in origin
Paraffin filmBemisPM999Laboratory sealing film
Petri dishesThermo Fisher ScientificFB0875713100 mm x 15 mm Petri dishes for solid media
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific100100491x concentration; pH 7.4
Select agarInvitrogen30391023A mixture of polysaccharides extracted from red seaweed cell walls to make bacterial plating media
T75 flasksCorning430641UTissue culture flasks
Triton X-100Sigma-AldrichT8787A common non-ionic surfactant and emulsifier 
Trypan blue stainInvitrogenT10282A dye to detect dead tissue culture cells; only live cells can exclude the dye
Trypsin-EDTAGibco25200-056Reagent for cell dissociation for cell line maintenance and passaging
Tryptic Soy Broth (TSB)Sigma-AldrichT8907Bacterial growth media

References

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved