تحاليل عدوى الخلايا الظهارية مع الشيغيلة

Summary

يصف البروتوكول الحالي مقايسات العدوى لاستجواب الالتزام بالشيغيلا والغزو والتكاثر داخل الخلايا باستخدام خطوط الخلايا الظهارية في المختبر .

Abstract

يسبب العامل الممرض البكتيري المعوي المتكيف مع الإنسان Shigella ملايين الإصابات كل عام ، ويخلق تأثيرات نمو طويلة الأجل بين مرضى الأطفال ، وهو سبب رئيسي لوفيات الإسهال في جميع أنحاء العالم. تسبب العدوى الإسهال المائي أو الدموي نتيجة لعبور العامل الممرض للجهاز الهضمي وإصابة الخلايا الظهارية المبطنة للقولون. مع الزيادات المذهلة في مقاومة المضادات الحيوية والنقص الحالي في اللقاحات المعتمدة ، تعد بروتوكولات البحث الموحدة ضرورية لدراسة هذا العامل الممرض الهائل. هنا ، يتم تقديم منهجيات لفحص التسبب الجزيئي للشيغيلا باستخدام التحليلات المختبرية للالتصاق البكتيري والغزو والتكاثر داخل الخلايا في الخلايا الظهارية القولونية. قبل تحليلات العدوى ، تم التحقق من النمط الظاهري للضراوة لمستعمرات الشيغيلا من خلال امتصاص صبغة الكونغو الحمراء على ألواح الآجار. يمكن أيضا اعتبار الوسائط المختبرية المكملة أثناء الزراعة البكتيرية لتقليد الظروف في الجسم الحي . ثم تستخدم الخلايا البكتيرية في بروتوكول موحد لإصابة الخلايا الظهارية القولونية في لوحات زراعة الأنسجة في تعدد ثابت من العدوى مع التكيفات لتحليل كل مرحلة من مراحل العدوى. لمقايسات الالتصاق ، يتم تحضين خلايا الشيغيلا بمستويات وسائط منخفضة لتعزيز الاتصال البكتيري بالخلايا الظهارية. لكل من مقايسات الغزو والتكرار داخل الخلايا ، يتم تطبيق الجنتاميسين لفترات زمنية مختلفة للقضاء على البكتيريا خارج الخلية وتمكين تقييم الغزو و / أو القياس الكمي لمعدلات النسخ المتماثل داخل الخلايا. تعدد جميع بروتوكولات العدوى البكتيريا الملتصقة و / أو الغازية و / أو داخل الخلايا عن طريق التخفيف المتسلسل لمحللات الخلايا الظهارية المصابة وطلاء وحدات تشكيل المستعمرة البكتيرية المتعلقة بإصابة التتر على ألواح أجار الكونغو الحمراء. تتيح هذه البروتوكولات معا توصيفا ومقارنات مستقلة لكل مرحلة من مراحل عدوى الشيغيلة للخلايا الظهارية لدراسة هذا العامل الممرض بنجاح.

Introduction

تشكل أمراض الإسهال التي تسببها مسببات الأمراض البكتيرية المعوية عبئا صحيا عالميا كبيرا. في عام 2016 ، كانت أمراض الإسهال مسؤولة عن 1.3 مليون حالة وفاة في جميع أنحاء العالم وكانت السبب الرئيسي الرابع للوفاة بين الأطفال الذين تقل أعمارهم عن خمس سنوات من سن ^1,2. الممرض البكتيري المعوي سلبي الجرام Shigella هو العامل المسبب لداء الشيغيلات ، وهو سبب رئيسي لوفيات الإسهال في جميع أنحاء العالم³. يسبب داء الشيغيلات معدلات اعتلال ووفيات كبيرة كل عام لدى الأطفال من البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل ^4,5 ، بينما ترتبط العدوى في البلدا....

Protocol

1. تحضير الكواشف والمواد

ملاحظة: تتوافق جميع وحدات التخزين مع الفحص باستخدام لوحين من 6 آبار.

1. وسط TSB: أضف 0.5 لتر من الماء منزوع الأيونات (DI) إلى 15 جم من مرق الصويا التربتيك (TSB ، انظر جدول المواد) والأوتوكلاف. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
2. وسط الأملاح الصفراوية (TSB + BS): لتحضير مكتب تقييس الاتصالات الذي يحتوي على 0,4٪ (وزن/حجم) من الأملاح الصفراوية، أعد تعليق 0,06 غرام من الأملاح الصفراوية (BS، انظر جدول المواد) في 15 مل من TSB المعقم. تعقيم المرشح باستخدام مرشح PES 0.22 ميكرومتر.
   ملاحظة: تتكون الأملاح الصفراوية من خليط 1: 1 من كولات الصوديوم وديوكسي كولات الصوديو....

النتائج

تم إجراء فحوصات الالتصاق والغزو والتكرار داخل الخلايا بمقارنة النوع البري S. flexneri 2457T (WT) إلى S. flexneri ΔVF (ΔVF) ، وهو متحولة يفترض أنها تنظم ضراوة الشيغيلا بشكل سلبي. وبما أن الشيغيلا تستخدم الأملاح الصفراوية كإشارة لتنظيم الفوعة^17،18،

Discussion

يصف هذا البروتوكول مجموعة من ثلاثة مقايسات موحدة لدراسة التصاق الشيغيلة وغزوها وتكرارها داخل الخلايا للخلايا الظهارية المعوية. على الرغم من أن هذه الطرق هي مجرد نسخ معدلة من مقايسات الجنتاميسين الكلاسيكية المستخدمة لدراسة الغزو والتكاثر داخل الخلايا لمختلف مسببات الأمراض البكتير?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm PES filter	Millipore-Sigma	SCGP00525	Sterile, polyethersulfone filter for sterilizing up to 50 mL media
14 mL culture tubes	Corning	352059	17 mm x 100 mm polypropylene test tubes with cap
50 mL conical tubes	Corning	430829	50 mL clear polypropylene conical bottom centrifuge tubes with leak-proof cap
6-well tissue culture plates	Corning	3516	Plates are treated for optimal cell attachment
Bile salts	Sigma-Aldrich	B8756	1:1 ratio of cholate to deoxycholate
Congo red dye	Sigma-Aldrich	C6277	A benzidine-based anionic diazo dye, >85% purity
Countess cell counting chamber slide	Invitrogen	C10283	To be used with the Countess Automated Cell Counter
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	A a highly polar organic reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	10569-010	DMEM is supplemented with high glucose, sodium pyruvate, GlutaMAX, and Phenol Red
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F4135	Heat-inactivated, sterile
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G3632	Stock concentration is 50 mg/mL
HT-29 cell line	ATCC	HTB-38	Adenocarcinoma cell line; colorectal in origin
Paraffin film	Bemis	PM999	Laboratory sealing film
Petri dishes	Thermo Fisher Scientific	FB0875713	100 mm x 15 mm Petri dishes for solid media
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010049	1x concentration; pH 7.4
Select agar	Invitrogen	30391023	A mixture of polysaccharides extracted from red seaweed cell walls to make bacterial plating media
T75 flasks	Corning	430641U	Tissue culture flasks
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	A common non-ionic surfactant and emulsifier
Trypan blue stain	Invitrogen	T10282	A dye to detect dead tissue culture cells; only live cells can exclude the dye
Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056	Reagent for cell dissociation for cell line maintenance and passaging
Tryptic Soy Broth (TSB)	Sigma-Aldrich	T8907	Bacterial growth media