Análise de Infecção de Células Epiteliais com Shigella

Resumo

O presente protocolo descreve ensaios de infecção para interrogar a adesão, invasão e replicação intracelular de Shigella usando linhagens celulares epiteliais in vitro .

Resumo

O patógeno bacteriano entérico adaptado ao ser humano Shigella causa milhões de infecções a cada ano, cria efeitos de crescimento a longo prazo entre pacientes pediátricos e é uma das principais causas de mortes diarreicas em todo o mundo. A infecção induz diarreia aquosa ou sanguinolenta como resultado do patógeno transitar pelo trato gastrointestinal e infectar as células epiteliais que revestem o cólon. Com aumentos impressionantes na resistência aos antibióticos e a atual falta de vacinas aprovadas, protocolos de pesquisa padronizados são críticos para estudar esse formidável patógeno. Aqui, metodologias são apresentadas para examinar a patogênese molecular de Shigella usando análises in vitro de adesão, invasão e replicação intracelular bacteriana em células epiteliais colônicas. Antes das análises da infecção, o fenótipo de virulência das colônias de Shigella foi verificado pela absorção do corante vermelho Congo em placas de ágar. Meios laboratoriais suplementados também podem ser considerados durante a cultura bacteriana para mimetizar condições in vivo . As células bacterianas são então utilizadas em um protocolo padronizado para infectar células epiteliais colônicas em placas de cultura de tecidos em uma multiplicidade estabelecida de infecção com adaptações para analisar cada estágio da infecção. Para os ensaios de aderência, as células de Shigella são incubadas com níveis reduzidos de meios para promover o contato bacteriano com as células epiteliais. Tanto para ensaios de invasão quanto para replicação intracelular, a gentamicina é aplicada por vários intervalos de tempo para eliminar bactérias extracelulares e permitir a avaliação da invasão e/ou a quantificação das taxas de replicação intracelular. Todos os protocolos de infecção enumeram bactérias aderentes, invadidas e/ou intracelulares diluindo em série lisados de células epiteliais infectadas e plaqueando unidades formadoras de colônias bacterianas em relação aos títulos infectantes em placas de ágar vermelho Congo. Em conjunto, esses protocolos permitem caracterizar e comparar de forma independente cada estágio da infecção por Shigella em células epiteliais para estudar este patógeno com sucesso.

Introdução

As doenças diarreicas causadas por patógenos bacterianos entéricos são um importante fardo global para a saúde. Em 2016, as doenças diarreicas foram responsáveis por 1,3 milhão de mortes no mundo e foram a quarta causa de morte em crianças menores de cinco anos ^1,2. O patógeno bacteriano entérico Gram-negativo Shigella é o agente causador da shiguelose, uma das principais causas de mortes diarreicas no mundo³. A shigelose causa morbidade e mortalidade significativas a cada ano em crianças de países de baixa e média renda ^4,5<....

Protocolo

1. Preparação de reagentes e materiais

NOTA: Todos os volumes são consistentes com um ensaio usando duas placas de 6 poços.

1. Meio TSB: Adicionar 0,5 L de água deionizada (DI) a 15 g de caldo de soja tríptico (TSB, ver Tabela de Materiais) meio e autoclave. Conservar à temperatura ambiente.
2. Meio de sais biliares (TSB + BS): Para preparar TSB contendo 0,4% (p/v) de sais biliares, ressuspenda 0,06 g de sais biliares (BS, ver Tabela de Materiais) em 15 mL de TSB autoclavado. Esterilizar o filtro usando um filtro de PES de 0,22 μm.
   NOTA: Os sais biliares consistem numa mist....

Discussão

Este protocolo descreve um conjunto de três ensaios padronizados para estudar a adesão, invasão e replicação intracelular de células epiteliais intestinais por Shigella. Embora esses métodos sejam apenas versões modificadas dos ensaios clássicos de gentamicina usados para estudar a invasão e replicação intracelular de vários patógenos bacterianos dentro das células hospedeiras 49,50,51, considerações especiais devem ser aplicadas no estudo

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm PES filter	Millipore-Sigma	SCGP00525	Sterile, polyethersulfone filter for sterilizing up to 50 mL media
14 mL culture tubes	Corning	352059	17 mm x 100 mm polypropylene test tubes with cap
50 mL conical tubes	Corning	430829	50 mL clear polypropylene conical bottom centrifuge tubes with leak-proof cap
6-well tissue culture plates	Corning	3516	Plates are treated for optimal cell attachment
Bile salts	Sigma-Aldrich	B8756	1:1 ratio of cholate to deoxycholate
Congo red dye	Sigma-Aldrich	C6277	A benzidine-based anionic diazo dye, >85% purity
Countess cell counting chamber slide	Invitrogen	C10283	To be used with the Countess Automated Cell Counter
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	A a highly polar organic reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	10569-010	DMEM is supplemented with high glucose, sodium pyruvate, GlutaMAX, and Phenol Red
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F4135	Heat-inactivated, sterile
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G3632	Stock concentration is 50 mg/mL
HT-29 cell line	ATCC	HTB-38	Adenocarcinoma cell line; colorectal in origin
Paraffin film	Bemis	PM999	Laboratory sealing film
Petri dishes	Thermo Fisher Scientific	FB0875713	100 mm x 15 mm Petri dishes for solid media
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010049	1x concentration; pH 7.4
Select agar	Invitrogen	30391023	A mixture of polysaccharides extracted from red seaweed cell walls to make bacterial plating media
T75 flasks	Corning	430641U	Tissue culture flasks
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	A common non-ionic surfactant and emulsifier
Trypan blue stain	Invitrogen	T10282	A dye to detect dead tissue culture cells; only live cells can exclude the dye
Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056	Reagent for cell dissociation for cell line maintenance and passaging
Tryptic Soy Broth (TSB)	Sigma-Aldrich	T8907	Bacterial growth media