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Resumo

O presente protocolo descreve ensaios de infecção para interrogar a adesão, invasão e replicação intracelular de Shigella usando linhagens celulares epiteliais in vitro .

Resumo

O patógeno bacteriano entérico adaptado ao ser humano Shigella causa milhões de infecções a cada ano, cria efeitos de crescimento a longo prazo entre pacientes pediátricos e é uma das principais causas de mortes diarreicas em todo o mundo. A infecção induz diarreia aquosa ou sanguinolenta como resultado do patógeno transitar pelo trato gastrointestinal e infectar as células epiteliais que revestem o cólon. Com aumentos impressionantes na resistência aos antibióticos e a atual falta de vacinas aprovadas, protocolos de pesquisa padronizados são críticos para estudar esse formidável patógeno. Aqui, metodologias são apresentadas para examinar a patogênese molecular de Shigella usando análises in vitro de adesão, invasão e replicação intracelular bacteriana em células epiteliais colônicas. Antes das análises da infecção, o fenótipo de virulência das colônias de Shigella foi verificado pela absorção do corante vermelho Congo em placas de ágar. Meios laboratoriais suplementados também podem ser considerados durante a cultura bacteriana para mimetizar condições in vivo . As células bacterianas são então utilizadas em um protocolo padronizado para infectar células epiteliais colônicas em placas de cultura de tecidos em uma multiplicidade estabelecida de infecção com adaptações para analisar cada estágio da infecção. Para os ensaios de aderência, as células de Shigella são incubadas com níveis reduzidos de meios para promover o contato bacteriano com as células epiteliais. Tanto para ensaios de invasão quanto para replicação intracelular, a gentamicina é aplicada por vários intervalos de tempo para eliminar bactérias extracelulares e permitir a avaliação da invasão e/ou a quantificação das taxas de replicação intracelular. Todos os protocolos de infecção enumeram bactérias aderentes, invadidas e/ou intracelulares diluindo em série lisados de células epiteliais infectadas e plaqueando unidades formadoras de colônias bacterianas em relação aos títulos infectantes em placas de ágar vermelho Congo. Em conjunto, esses protocolos permitem caracterizar e comparar de forma independente cada estágio da infecção por Shigella em células epiteliais para estudar este patógeno com sucesso.

Introdução

As doenças diarreicas causadas por patógenos bacterianos entéricos são um importante fardo global para a saúde. Em 2016, as doenças diarreicas foram responsáveis por 1,3 milhão de mortes no mundo e foram a quarta causa de morte em crianças menores de cinco anos 1,2. O patógeno bacteriano entérico Gram-negativo Shigella é o agente causador da shiguelose, uma das principais causas de mortes diarreicas no mundo3. A shigelose causa morbidade e mortalidade significativas a cada ano em crianças de países de baixa e média renda 4,5, enquanto infecções em países de alta renda estão ligadas a surtos de creches, alimentos e água 6,7,8,9. O desenvolvimento ineficaz devacinas10 e o aumento das taxas de resistência antimicrobiana (RAM)11,12 têm dificultado o manejo de surtos de Shigella em larga escala. Dados recentes do Centers for Disease Control and Prevention mostram que quase 46% das infecções por Shigella nos Estados Unidos apresentaram resistência aos medicamentos em 202013,14, enquanto a Organização Mundial da Saúde declarou a Shigella como um patógeno prioritário para a RAM, para o qual novas terapias são urgentemente necessárias15.

As infecções por Shigella são facilmente transmitidas pela via fecal-oral após a ingestão de água ou alimentos contaminados, ou através do contato humano direto. Shigella evoluiu para ser um patógeno eficiente, adaptado ao homem, com uma dose infecciosa de 10-100 bactérias suficiente para causar doença16. Durante o trânsito do intestino delgado, Shigella é exposta a sinais ambientais, como temperatura elevada e bile17. A detecção desses sinais induz alterações transcricionais para expressar fatores de virulência que aumentam a capacidade da bactéria de infectar o cólon humano 17,18,19. Shigella não invade o epitélio colônico a partir da superfície apical, mas transita através da camada epitelial após captação em células especializadas de microdobras apresentadoras de antígenos (células M) dentro do epitélio associado ao folículo 20,21,22. Após a transcitose, as células de Shigella são fagocitadas por macrófagos residentes. Shigella escapa rapidamente do fagossomo e desencadeia a morte celular de macrófagos, resultando na liberação de citocinas pró-inflamatórias 5,23,24. Shigella então invade células epiteliais colônicas do lado basolateral, lisa o vacúolo macropinocítico e estabelece um nicho replicativo no citoplasma 5,25. As citocinas pró-inflamatórias, particularmente a interleucina-8 (IL-8), recrutam leucócitos polimorfonucleares neutrófilos (PMNs) para o local da infecção, o que enfraquece as tight junctions epiteliais e permite a infiltração bacteriana do revestimento epitelial para exacerbar a infecção basolateral5. Os PMNs destroem o revestimento epitelial infectado para conter a infecção, o que resulta nos sintomas característicos da disenteria bacilar (sangrenta)5. Embora os mecanismos de invasão e replicação intracelular tenham sido completamente caracterizados, novas pesquisas estão demonstrando novos conceitos importantes na infecção por Shigella, incluindo regulação da virulência durante o trânsito gastrointestinal (GI)17, adesão19, melhor acesso basolateral através da permeabilidade da barreira26 e carreamento assintomático em crianças desnutridas27.

A capacidade de Shigella spp causar doença diarreica é restrita a humanos e primatas não humanos (PNH)28. Modelos de infecção intestinal por Shigella foram desenvolvidos para zebrafish29, camundongos30, cobaias31, coelhos 21,32,33 e suínos34,35. No entanto, nenhum desses sistemas-modelo pode replicar com precisão as características da doença observadas durante a infecção humana36. Embora modelos de shigelose do NHP tenham sido estabelecidos para estudar a patogênese da Shigella, esses sistemas modelo são caros de implementar e requerem doses infecciosas artificialmente altas, até nove ordens de magnitude superiores à dose infecciosa em humanos 37,38,39,40,41,42. Assim, a notável adaptação de Shigella para infecção de hospedeiros humanos requer o uso de culturas de células derivadas de humanos para recriar modelos fisiologicamente relevantes para interrogação precisa da patogênese de Shigella.

Aqui, procedimentos detalhados são descritos para medir as taxas de aderência, invasão e replicação de Shigella dentro de células epiteliais colônicas HT-29. Usando esses protocolos padronizados, os mecanismos moleculares pelos quais os genes de virulência bacteriana e os sinais ambientais impactam cada etapa da infecção por Shigella podem ser interrogados para melhor entender a relação dinâmica de interação patógeno-hospedeiro.

Protocolo

1. Preparação de reagentes e materiais

NOTA: Todos os volumes são consistentes com um ensaio usando duas placas de 6 poços.

  1. Meio TSB: Adicionar 0,5 L de água deionizada (DI) a 15 g de caldo de soja tríptico (TSB, ver Tabela de Materiais) meio e autoclave. Conservar à temperatura ambiente.
  2. Meio de sais biliares (TSB + BS): Para preparar TSB contendo 0,4% (p/v) de sais biliares, ressuspenda 0,06 g de sais biliares (BS, ver Tabela de Materiais) em 15 mL de TSB autoclavado. Esterilizar o filtro usando um filtro de PES de 0,22 μm.
    NOTA: Os sais biliares consistem numa mistura 1:1 de colato de sódio e desoxicolato de sódio. Preparar meios frescos imediatamente antes da utilização.
  3. DMEM + 10% (v/v) de SFB: Adicionar 5 mL de soro fetal bovino (SFB) a 45 mL de meio de águia modificado (DMEM) de Dulbecco. Conservar a 4 °C.
  4. DMEM + gentamicina: Para um tubo de 50 mL, adicionar 50 mL de DMEM e 50 μL de 50 mg/mL de gentamicina (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: Fazer alíquota fresca e aquecer em banho-maria a 37 °C antes de cada experimento.
  5. PBS + 1% (v/v) Triton X-100: Adicionar 150 μL de Triton X-100 a 15 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
    NOTA: Fazer alíquota fresca e aquecer em banho-maria a 37 °C antes de cada experimento.
  6. TSB + placas indicadoras vermelhas Congo: Adicione 15 g de TSB, 7,5 g de ágar selecionado e 0,125 g de corante vermelho Congo (ver Tabela de Materiais) a um frasco de 1 L. Adicione 0,5 L de água DI e autoclave. Despeje 10-20 mL de meio em placas de Petri estéreis individuais (100 mm x 15 mm) e deixe solidificar.
    CUIDADO: O vermelho Congo é cancerígeno e uma toxina reprodutiva. Certifique-se de que o manuseio do vermelho Congo seja realizado usando o equipamento de proteção individual apropriado. Consulte a ficha de dados de segurança do produto para obter informações adicionais.
    NOTA: Aproximadamente 20 placas são feitas de 0,5 L de mídia vermelha Congo. As placas podem ser preparadas com 2-3 dias de antecedência e deixadas invertidas à temperatura ambiente até o uso. Para armazenamento a longo prazo, coloque placas invertidas em mangas plásticas a 4 °C por até 3 meses.
  7. DMEM + 10% (v/v) de SFB e 5% (v/v) de dimetilsulfóxido (DMSO): Adicionar 42,5 mL de DMEM, 5 mL de SFB e 2,5 mL de DMSO a um tubo de 50 mL. Conservar a 4 °C.

2. Preparação de bactérias

NOTA: Todos os protocolos de cultivo e armazenamento em laboratório de Shigella são adaptados de Payne, S. M.43.

CUIDADO: Shigella spp são patógenos do Grupo de Risco2 44. Realizar todo o trabalho laboratorial em ambiente BSL-2, com medidas adicionais de segurança tomadas para limitar exposições acidentais devido à baixa dose infecciosa de Shigella spp.

  1. Crescimento de Shigella a partir de estoques congelados
    1. Transfira uma pequena quantidade de cultura congelada do frasco criogênico para uma placa de ágar vermelho TSB + Congo usando um aplicador estéril.
    2. Chamas esterilizar um ciclo de inoculação e deixá-lo esfriar. Estria o inóculo para frente e para trás em um quadrante da placa. Chame o laço, deixe esfriar e, em seguida, passe do primeiro quadrante para o segundo quadrante da placa. Repita para colocar o inóculo no terceiro e quarto quadrantes da placa.
      NOTA: Alternativamente, estriar o inóculo usando um aplicador estéril fresco entre cada quadrante.
    3. Inverter a placa e incubar a 37 °C durante a noite.
      NOTA: A incubação a temperaturas ≥37 °C é necessária para a expressão dos fatores de virulência de Shigella necessários para a observação do fenótipo vermelho Congo positivo (CR+)45. As colônias avirulantes terão uma aparência branca e não serão invasivas.
    4. Selar a placa com filme de parafina e conservar refrigerado a 4 °C.
      NOTA: As colônias bacterianas permanecerão viáveis em placas de ágar por 1-2 semanas.
  2. Crescimento noturno de Shigella em cultura líquida
    1. Alíquota 3 mL de TSB em tubos de cultura estéreis de 14 mL.
    2. Escolha uma única colônia vermelha (CR+) bem isolada usando um aplicador estéril e ressuspenda em meio líquido.
    3. Incubar culturas durante a noite (16-18 h) a 37 °C com agitação a 250 rotações por minuto (rpm).

3. Preparação de células eucarióticas HT-29

NOTA: Todos os volumes são consistentes com um ensaio usando duas placas de 6 poços. As linhagens celulares HT-29 foram adquiridas da American Type Culture Collection (ATCC). Os protocolos de manutenção do HT-29 são adaptados das recomendações da ATCC46. Todos os meios devem ser pré-aquecidos em banho-maria a 37 °C antes da utilização. Todos os protocolos de manutenção do HT-29 devem ser realizados em gabinete de biossegurança. Abster-se de produzir bolhas ao misturar/trabalhar com células HT-29 em meios para evitar mudanças dramáticas no pH.

  1. Descongelamento de células HT-29 de estoque congelado
    1. Descongelar o frasco para injetáveis de células HT-29 num banho-maria a 37 °C.
      NOTA: Certifique-se de que a tampa permaneça totalmente acima da água para evitar contaminação. O descongelamento deve demorar menos de 2 min.
    2. Retire o frasco para injetáveis da água imediatamente após a cultura estar totalmente descongelada e descontamine com etanol a 70%. Certifique-se de que todas as etapas a partir deste ponto sejam executadas usando técnicas assépticas.
    3. Adicionar todo o conteúdo do frasco para injetáveis a um tubo de centrífuga de 15 ml contendo 9 ml de DMEM + 10% de SFB. Centrifugar a 125 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
    4. Decantar o sobrenadante em um recipiente de resíduos e ressuspender o pellet em 10 mL de DMEM quente + 10% FBS. Transferir as células ressuspensas para um frasco de cultura de tecidos (T75) de 75cm2 contendo 10 mL de DMEM quente + 10% de SFB (volume total de 20 mL).
    5. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2 até que as células atinjam 90% de confluência (aproximadamente 6-7 dias).
      NOTA: A confluência é estimada através de aproximação visual.
  2. Semeadura de células HT-29
    1. Pré-aquecer 20 mL de PBS e 50 mL de DMEM + 10% FBS em banho-maria a 37 °C e pré-aquecer 3 mL de tripsina-EDTA a 0,25% (p/v) à temperatura ambiente.
    2. Uma vez que as células HT-29 (a partir do passo 3.1) atinjam 90% de confluência, decantar o meio de cultura de células HT-29 do frasco T75 para um recipiente de resíduos. Despeje ~10 mL de PBS quente no frasco e gire suavemente para lavar. Decantar o PBS em um recipiente de resíduos. Lave com PBS morno novamente e decante.
    3. Adicionar 2-3 mL de 0,25% (p/v) de tripsina-EDTA e girar suavemente por toda a área de superfície. Incubar a 37 °C com 5% de CO2 durante 4 min.
    4. Retire o balão da incubadora e gire suavemente a tripsina-EDTA, garantindo visualmente que todas as células se desprendem da superfície.
    5. Adicione imediatamente 6 mL de DMEM quente + FBS a 10% para desativar a tripsina. Pipetar para cima e para baixo para misturar completamente.
    6. Transfira todo o conteúdo para um tubo de centrífuga de 15 mL e gire-o a 500 x g por 5 min à temperatura ambiente.
    7. Decantar suavemente o sobrenadante em um recipiente de resíduos e ressuspender o pellet em 6 mL de DMEM quente + 10% FBS.
    8. Imediatamente após a ressuspensão, transferir 10 μL de células HT-29 suspensas do meio da cultura para um tubo de PCR de 0,2 mL. Adicionar 10 μL de corante azul de Trypan ao tubo de PCR e misturar.
    9. Adicione 10 μL de mistura de células HT-29/azul de Trypan a uma lâmina descartável da câmara de contador de células da Condessa (ver Tabela de Materiais). Enumere o número de células vivas e calcule a viabilidade celular.
      Observação : ao documentar o número de células no exemplo, leia o número sob a contagem de células "ao vivo", não a contagem total de células. Alternativamente, a enumeração celular pode ser realizada manualmente usando um hemocitômetro.
    10. As células HT-29 ressuspendidas da semente em um frasco T75 fresco ou placa de 6 poços.
      1. Para o balão T75:
        1. Pipetar suavemente para misturar e, em seguida, transferir 2,5 x 106 células para um balão T75 fresco de acordo com a equação abaixo:
          figure-protocol-8849
        2. Adicionar DMEM quente + meio FBS a 10% para um volume final de 20 mL (concentração final de 1,25 x 105 células/mL).
        3. Dispersar as células uniformemente pelo balão, balançando suavemente para frente e para trás.
        4. Incubar a 37 °C com 5% de CO2 até que as células atinjam 80% de confluência.
          NOTA: Para um crescimento ideal, substitua o meio DMEM + 10% FBS no frasco T75 a cada ~3 dias. Decantar o meio para um recipiente de resíduos e adicionar 10 ml de PBS quente ao balão. Gire o PBS suavemente e decante-o no recipiente de resíduos. Em seguida, adicionar 20 mL de DMEM fresco e quente + FBS a 10% ao balão e retornar à incubadora a 37 °C, 5% CO2 .
      2. Para placa de 6 poços:
        1. Pipetar suavemente para misturar e, em seguida, transferir 5,85 x 106 células para um tubo cônico fresco de 50 mL de acordo com a equação abaixo:
          figure-protocol-9878
        2. Adicionar DMEM quente + meio FBS a 10% para um volume final de 26 mL (concentração final de 2,25 x 105 células/mL).
        3. Pipetar suavemente para misturar e, em seguida, distribuir 2 mL (4,5 x 105 células) em poços individuais de placas de 6 poços.
        4. Disperse as células uniformemente pelo poço, balançando suavemente para cima/para baixo e esquerda/direita 2-3x.
        5. Incubar a 37 °C com 5% de CO2 até que as células atinjam 80%-95% de confluência (aproximadamente 3-4 dias).
          NOTA: 85% de confluência é recomendada para ensaios de invasão e replicação intracelular, enquanto 90%-95% de confluência é recomendada para ensaios de adesão. As células devem atingir ~85% de confluência após 48 h de incubação com uma concentração final de aproximadamente 1 x 106 células/poço. Podem ser necessários ajustes no número de células semeadas e no comprimento de incubação.
  3. Fabricação de estoques HT-29 congelados
    1. Alíquota 1 mL de DMEM + 10% FBS + 5% meio DMSO em frascos criogênicos individuais.
    2. Adicionar 1 x 106 células HT-29 do passo 3.2.7 a cada frasco para injetáveis. Calcule o volume de células de acordo com a fórmula abaixo:
      figure-protocol-11261
    3. Loja HT-29 células a longo prazo abaixo de -130 °C em congelador de armazenamento de vapor de nitrogênio líquido.

4. Ensaio de adesão

NOTA: Todos os volumes são consistentes com um ensaio usando duas placas de 6 poços.

  1. Subcultura durante a noite culturas de Shigella via diluição 1:50 em meios frescos.
    1. Vórtice e, em seguida, adicionar 100 μL de cada cultura noturna a 5 mL de TSB fresco ou TSB + BS em um tubo de cultura de tamanho adequado.
      NOTA: Limitar o volume de cultura a <20% do volume do frasco ou tubo de cultura para garantir a aeração adequada.
    2. Incubar a 37 °C com agitação a 250 rpm até que as células atinjam uma densidade óptica (OD600) de 0,7 (fase logarítmica média de crescimento de Shigella ); cerca de 2-2,5 h.
      NOTA: Durante a subcultura, alíquota 50 mL de DMEM e um volume suficiente de PBS para todas as etapas de lavagem e colocar em banho-maria a 37 °C. Permitir que os meios atinjam 37 °C antes da utilização.
  2. Transferir 2 x 108 unidades formadoras de colônias (UFCs) Shigella subcultivadas para tubos individuais de microcentrífuga de 2 mL.
    NOTA: 2 x 108 UFC corresponde a aproximadamente 1 mL de células bacterianas em um OD600 de 0,7. Use leituras OD600 para aproximar UFC/mL de acordo com a calibração de cada espectrofotômetro individual.
  3. Lave cada amostra de Shigella 2x com PBS.
    1. Células de pellet por centrifugação a 17.000 x g por 2 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante, adicionar 1 mL de PBS morno e ressuspender bem o pellet, pipetando suavemente a amostra para cima e para baixo até que a mistura esteja totalmente homogênea (8-10x).
    2. Repita a etapa 4.3.1 1x tempo adicional.
    3. As células de pellets, por centrifugação a 17.000 x g por 2 min à temperatura ambiente, aspiram o sobrenadante e ressuspendem os pellets em 2 mL de DMEM quente.
      OBS: A concentração final das bactérias ressuspensas será de 1 x 108 UFC/mL.
  4. Vórtice e, em seguida, adicionar 1 ml (1 x 108 UFC) de Shigella ressuspendida a cada poço das monocamadas epiteliais colónicas HT-29 preparadas em placas de 6 poços (a partir do passo 3.2.10.2).
    NOTA: As infecções são normalmente realizadas em uma multiplicidade de infecção (MOI; proporção de células bacterianas para epiteliais) de 100. Para testar diferentes MOIs, diluir Shigella ressuspendida em DMEM quente até a concentração desejada e, em seguida, adicionar 1 mL de bactérias diluídas às monocamadas HT-29. Por exemplo, para testar um MOI de 10, dilua as bactérias 1:10 adicionando 150 μL de 1 x 108 UFC/mL de bactérias a 1,35 mL de DMEM aquecido e, em seguida, aplique 1 mL (1 x 107 UFCs) às células HT-29.
  5. Incubar as placas de 6 poços a 37 °C com 5% de CO2 durante 3 horas.
  6. Durante a incubação, determinar o título de infecção bacteriana.
    1. Preparar diluições seriadas de 10 vezes de células de Shigella ressuspensas (do passo 4.3.3) em PBS.
    2. Placa 100 μL das diluições 1 x 10-5 e 1 x 10-6 em placas TSB + vermelho Congo e incubar durante a noite a 37 °C.
      NOTA: O revestimento de 100 μL das diluições 1 x 10-5 e 1 x 10-6 corresponde a um fator de diluição final de 1 x 10-6 e 1 x 10-7, respectivamente.
  7. Após a incubação, lavar as monocamadas 4-5x com PBS.
    1. Aspirar o meio de cada poço.
      OBS: Ao aspirar o meio a partir de placas de 6 poços, guie a ponta do aspirador ao longo do lado inferior dos poços, tentando evitar o contato com as células HT-29.
    2. Adicione 1 mL de PBS morno a cada poço e lave delicadamente.
      NOTA: Para lavar suavemente as monocamadas de 6 poços com PBS, mova a placa para cima e para baixo e de um lado para o outro na bancada. Lavar placas em movimento circular e/ou remover a placa da superfície da bancada pode causar a remoção mecânica de células do plástico.
    3. Repita as etapas 4.7.1 e 4.7.2 4x vezes adicionais.
  8. Remover PBS por aspiração e lisar células HT-29 adicionando 1 mL de PBS + 1% Triton X-100 a cada poço.
  9. Incubar placas de 6 poços a 37 °C durante 5 minutos.
  10. Use um raspador de células ou uma ponta de pipeta dobrada para raspar as células lisadas do fundo do poço e transferir o 1 mL completo para um tubo de microcentrífuga fresco de 1,7 mL.
  11. Determine o número de bactérias associadas às células.
    1. Vórtice cada tubo (a partir do passo 4.10) durante pelo menos 30 s para deslocar ainda mais Shigella das células eucarióticas lisadas.
    2. Preparar diluições seriadas de lisados de 10 vezes em PBS.
    3. Placa 100 μL das diluições 1 x 10-2, 1 x 10-3 e 1 x 10-4 em placas TSB + vermelho Congo e incubar durante a noite a 37 °C.
      NOTA: O chapeamento de 100 μL das diluições 1 x 10-2, 1 x 10-3 e 1 x 10-4 corresponde a um fator de diluição final de 1 x 10-3, 1 x 10-4 e 1 x 10-5, respectivamente.

5. Ensaio de invasão

NOTA: Todos os volumes são consistentes com um ensaio usando duas placas de 6 poços.

  1. Subcultura durante a noite culturas de Shigella via diluição 1:50 em meios frescos.
    1. Vórtice e, em seguida, adicionar 100 μL de cada cultura noturna a 5 mL de TSB fresco ou TSB + BS em um tubo de cultura de tamanho adequado.
      NOTA: Limitar o volume de cultura a <20% do volume do frasco ou tubo de cultura para garantir a aeração adequada.
    2. Incubar a 37 °C com agitação a 250 rpm até que as células atinjam um OD600 de 0,7 (fase logarítmica média de crescimento de Shigella ); cerca de 2-2,5 h.
      NOTA: Durante a subcultura, alíquota 50 mL de DMEM + 50 mg/mL de gentamicina e um volume suficiente de PBS para todas as etapas de lavagem e colocar em banho-maria a 37 °C. Permitir que os meios atinjam 37 °C antes da utilização.
  2. Transfira 2 x 108 UFCs subcultivadas Shigella para tubos individuais de microcentrífuga de 2 mL.
    NOTA: 2 x 108 UFC corresponde a aproximadamente 1 mL de células bacterianas em um OD600 de 0,7. Use leituras OD600 para aproximar UFC/mL de acordo com a calibração de cada espectrofotômetro individual.
  3. Lave amostras de Shigella 1x com PBS.
    1. Células de pellet por centrifugação a 17.000 x g por 2 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante, adicionar 1 mL de PBS morno e ressuspender bem o pellet, pipetando suavemente a amostra para cima e para baixo até que a mistura esteja totalmente homogênea (8-10x).
    2. Repita a etapa 5.3.1. 1x tempo adicional.
    3. As células de pellets, por centrifugação a 17.000 x g por 2 min à temperatura ambiente, aspiram o sobrenadante e ressuspendem os pellets em 2 mL de DMEM quente.
      OBS: A concentração final das bactérias ressuspensas será de 1 x 108 UFC/mL.
  4. Vórtice e, em seguida, adicionar 1 mL (1 x 108 UFCs) de Shigella ressuspendida mais 1 mL de DMEM a cada poço das monocamadas epiteliais colônicas HT-29 preparadas em placas de 6 poços (a partir da etapa 3.2.10.2).
    NOTA: As infecções são normalmente realizadas em uma multiplicidade de infecção (MOI; proporção de células bacterianas para epiteliais) de 100. Para testar diferentes MOIs, diluir Shigella ressuspendida em DMEM até a concentração desejada e, em seguida, adicionar 1 mL de bactérias diluídas às monocamadas HT-29. Por exemplo, para testar um MOI de 10, dilua as bactérias 1:10 adicionando 150 μL de 1 x 108 UFC/mL de bactérias a 1,35 mL de DMEM e, em seguida, adicione 1 mL (1 x 107 UFCs) às células HT-29.
  5. Para promover o contato bacteriano com as células HT-29, centrifugar as placas de 6 poços a 2.000 x g por 10 min à temperatura ambiente ou 37 °C se o ajuste de temperatura puder ser ajustado.
    NOTA: A centrifugação promove o contato bacteriano com as células HT-29, o que ignora a necessidade de fatores de aderência e permite que as bactérias invadam rapidamente as células.
  6. Incubar placas de 6 poços a 37 °C com 5% de CO2 durante 45 minutos.
  7. Durante a incubação, determinar o título de infecção bacteriana.
    1. Preparar diluições seriadas de 10 vezes de células de Shigella ressuspensas (do passo 5.3.3) em PBS.
    2. Placa 100 μL das diluições 1 x 10-5 e 1 x 10-6 em placas TSB + vermelho Congo e incubar durante a noite a 37 °C.
      NOTA: O revestimento de 100 μL das diluições 1 x 10-5 e 1 x 10-6 corresponde a um fator de diluição final de 1 x 10-6 e 1 x 10-7, respectivamente.
  8. Lave bem as células HT-29 infectadas 3x com 1 mL de PBS.
    1. Aspirar o meio de cada poço.
      OBS: Ao aspirar o meio a partir de placas de 6 poços, guie a ponta do aspirador ao longo do lado inferior dos poços, tentando evitar o contato com as células HT-29.
    2. Adicione 1 mL de PBS morno a cada poço e lave delicadamente.
      NOTA: Para lavar suavemente as monocamadas de 6 poços com PBS, mova a placa para cima e para baixo e de um lado para o outro na bancada. Lavar placas em movimento circular e/ou remover a placa da superfície da bancada pode causar a remoção mecânica de células do plástico.
    3. Repita as etapas 5.8.1 e 5.8.2 2x vezes adicionais.
  9. Remover PBS por aspiração, em seguida, adicionar 2 mL de DMEM quente suplementado com 50 μg/mL de gentamicina em cada poço e incubar por 30 min a 37 °C com 5% de CO2.
  10. Lave bem as células HT-29 infectadas 3x com 1 mL de PBS.
    1. Repita o passo de lavagem 5.8.
  11. Remover PBS por aspiração, em seguida, adicionar 2 mL de DMEM quente suplementado com 50 μg/mL de gentamicina em cada poço e incubar por 60 min a 37 °C com 5% de CO2.
  12. Lave bem as células HT-29 infectadas 3x com 1 mL de PBS.
    1. Repita o passo de lavagem 5.8.
  13. Remover PBS por aspiração e lisar células HT-29 adicionando 1 mL de PBS + 1% Triton X-100 a cada poço.
  14. Incubar placas de 6 poços a 37 °C durante 5 minutos.
  15. Use um raspador de células ou uma ponta de pipeta dobrada para raspar as células lisadas do fundo do poço e transferir o 1 mL completo para um tubo de microcentrífuga fresco de 1,7 mL.
  16. Determine o número de bactérias intracelulares.
    1. Vórtice cada tubo (a partir do passo 5.15) durante pelo menos 30 s para deslocar ainda mais Shigella das células eucarióticas lisadas.
    2. Preparar diluições seriadas de lisados de 10 vezes em PBS.
    3. Placa 100 μL das diluições 1 x 10-2 e 1 x 10-3 em placas TSB + vermelho Congo e incubar durante a noite a 37 °C.
      NOTA: O chapeamento de 100 μL das diluições 1 x 10-2 e 1 x 10-3 corresponde a um fator de diluição final de 1 x 10-3 e 1 x 10-4, respectivamente.

6. Ensaio de replicação intracelular

NOTA: Todos os volumes são consistentes com um ensaio usando duas placas de 6 poços.

  1. Subcultura durante a noite culturas de Shigella via diluição 1:50 em meios frescos.
    1. Vórtice e, em seguida, adicionar 100 μL de cada cultura noturna a 5 mL de TSB fresco ou TSB + BS em um tubo de cultura de tamanho adequado.
      NOTA: Limitar o volume de cultura a <20% do volume do frasco ou tubo de cultura para garantir a aeração adequada.
    2. Incubar a 37 °C com agitação a 250 rpm até que as células atinjam um OD600 de 0,7 (fase logarítmica média de crescimento de Shigella ); cerca de 2-2,5 h.
      NOTA: Durante a subcultura, alíquota 50 mL de DMEM + 50 mg/mL de gentamicina e um volume suficiente de PBS para todas as etapas de lavagem e colocar em banho-maria a 37 °C. Permitir que os meios atinjam 37 °C antes da utilização.
  2. Transfira 2 x 108 UFCs subcultivadas Shigella para tubos individuais de microcentrífuga de 2 mL.
    NOTA: 2 x 108 UFC corresponde a aproximadamente 1 mL de células bacterianas em um OD600 de 0,7. Use leituras OD600 para aproximar UFC/mL de acordo com a calibração de cada espectrofotômetro individual.
  3. Lave amostras de Shigella 1x com PBS.
    1. Células de pellet por centrifugação a 17.000 x g por 2 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante, adicionar 1 mL de PBS morno e ressuspender bem o pellet, pipetando suavemente a amostra para cima e para baixo até que a mistura esteja totalmente homogênea (8-10x).
    2. Repita a etapa 6.3.1. 1x tempo adicional.
    3. As células de pellets, por centrifugação a 17.000 x g por 2 min à temperatura ambiente, aspiram o sobrenadante e ressuspendem os pellets em 2 mL de DMEM quente.
      OBS: A concentração final das bactérias ressuspensas será de 1 x 108 UFC/mL.
  4. Vórtice e, em seguida, adicionar 1 mL (1 x 108 UFCs) de Shigella ressuspendida mais 1 mL de DMEM a cada poço de monocamadas epiteliais colônicas HT-29 preparadas em placas de 6 poços (a partir da etapa 3.2.10.2).
    NOTA: As infecções são normalmente realizadas em uma multiplicidade de infecção (MOI; proporção de células bacterianas para epiteliais) de 100. Para testar diferentes MOIs, diluir Shigella ressuspendida em DMEM até a concentração desejada e, em seguida, adicionar 1 mL de bactérias diluídas às monocamadas HT-29. Por exemplo, para testar um MOI de 10, dilua as bactérias 1:10 adicionando 150 μL de 1 x 108 UFC/mL de bactérias a 1,35 mL de DMEM e, em seguida, aplique 1 mL (1 x 107 UFCs) às células HT-29.
  5. Para promover o contato bacteriano com as células HT-29, centrifugar as placas de 6 poços a 2.000 x g por 10 min à temperatura ambiente ou 37 °C se o ajuste de temperatura puder ser ajustado.
    NOTA: A centrifugação promove o contato bacteriano com as células HT-29, o que ignora a necessidade de fatores de aderência e permite que as bactérias invadam rapidamente as células.
  6. Incubar placas de 6 poços a 37 °C com 5% de CO2 durante 45 minutos.
  7. Durante a incubação, determinar o título de infecção bacteriana.
    1. Preparar diluições seriadas de 10 vezes de células de Shigella ressuspensas (do passo 6.3.3) em PBS.
    2. Placa 100 μL das diluições 1 x 10-5 e 1 x 10-6 em placas TSB + vermelho Congo e incubar durante a noite a 37 °C.
      NOTA: O revestimento de 100 μL das diluições 1 x 10-5 e 1 x 10-6 corresponde a um fator de diluição final de 1 x 10-6 e 1 x 10-7, respectivamente.
  8. Lave bem as células HT-29 infectadas 3x com 1 mL de PBS.
    1. Aspirar o meio de cada poço.
      OBS: Ao aspirar o meio a partir de placas de 6 poços, guie a ponta do aspirador ao longo do lado inferior dos poços, tentando evitar o contato com as células HT-29.
    2. Adicione 1 mL de PBS morno a cada poço e lave delicadamente.
      NOTA: Para lavar suavemente as monocamadas de 6 poços com PBS, mova a placa para cima e para baixo e de um lado para o outro na bancada. Lavar placas em movimento circular e/ou remover a placa da superfície da bancada pode causar a remoção mecânica de células do plástico.
    3. Repita as etapas 6.8.1 e 6.8.2 2x vezes adicionais.
  9. Remover PBS por aspiração, em seguida, adicionar 2 mL de DMEM quente suplementado com 50 μg/mL de gentamicina em cada poço e incubar por 30 min a 37 °C com 5% de CO2.
  10. Lave bem as células HT-29 infectadas 3x com 1 mL de PBS.
    1. Repetir o passo de lavagem 6.8.
  11. Remover PBS por aspiração, em seguida, adicionar 2 mL de DMEM quente com 50 μg/mL de gentamicina a cada poço das placas de 6 poços e incubar a 37 °C com 5% de CO2 pelo tempo desejado para permitir a replicação intracelular (até 24 h).
  12. Lave bem as células 2x com 1 mL de PBS.
    1. Repetir o passo de lavagem 6.8.
  13. Remover PBS por aspiração e lisar células HT-29 adicionando 1 mL de PBS + 1% Triton X-100 a cada poço.
  14. Incubar placas de 6 poços a 37 °C durante 5 minutos.
  15. Use um raspador de células ou uma ponta de pipeta dobrada para raspar as células lisadas do fundo do poço e transferir o 1 mL completo para um tubo de microcentrífuga fresco de 1,7 mL.
  16. Determine o número de bactérias intracelulares.
    1. Vórtice cada tubo (a partir do passo 6.15) durante pelo menos 30 s para deslocar ainda mais Shigella das células eucarióticas lisadas.
    2. Preparar diluições seriadas de lisados de 10 vezes em PBS.
    3. Placa 100 μL das diluições 1 x 10-2, 1 x 10-3 e 1 x 10-4 em placas TSB + Congo Red e incubar durante a noite a 37 °C.
      NOTA: O chapeamento de 100 μL das diluições 1 x 10-2, 1 x 10-3 e 1 x 10-4 corresponde a um fator de diluição final de 1 x 10-3, 1 x 10-4 e 1 x 10-5, respectivamente.

Resultados

Ensaios de aderência, invasão e replicação intracelular foram realizados comparando S. flexneri 2457T wild type (WT) com S. flexneri ΔVF (ΔVF), um mutante hipotetizado para regular negativamente a virulência de Shigella. Como Shigella utiliza sais biliares como sinal para regular a virulência 17,18,47, experimentos foram realizados após subcultivo bacteriano em meio TSB e TSB suplementado com sais biliares a 0,4% (p/v)

Discussão

Este protocolo descreve um conjunto de três ensaios padronizados para estudar a adesão, invasão e replicação intracelular de células epiteliais intestinais por Shigella. Embora esses métodos sejam apenas versões modificadas dos ensaios clássicos de gentamicina usados para estudar a invasão e replicação intracelular de vários patógenos bacterianos dentro das células hospedeiras 49,50,51, considerações especiais devem ser aplicadas no estudo

Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

O apoio aos autores inclui o Departamento de Pediatria do Hospital Geral de Massachusetts, o prêmio 2022A009041 do Comitê Executivo de Financiamento de Apoio Provisório à Pesquisa (ISF), o R21AI146405 de concessão do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas e o Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais concedem o Centro de Pesquisa em Obesidade Nutricional em Harvard (NORCH) 2P30DK040561-26. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 μm PES filterMillipore-SigmaSCGP00525Sterile, polyethersulfone filter for sterilizing up to 50 mL media
14 mL culture tubesCorning35205917 mm x 100 mm polypropylene test tubes with cap
50 mL conical tubesCorning43082950 mL clear polypropylene conical bottom centrifuge tubes with leak-proof cap
6-well tissue culture platesCorning3516Plates are treated for optimal cell attachment
Bile saltsSigma-AldrichB87561:1 ratio of cholate to deoxycholate
Congo red dyeSigma-AldrichC6277A benzidine-based anionic diazo dye, >85% purity
Countess cell counting chamber slideInvitrogenC10283To be used with the Countess Automated Cell Counter
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD8418A a highly polar organic reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco10569-010DMEM is supplemented with high glucose, sodium pyruvate, GlutaMAX, and Phenol Red
Fetal Bovine Serum (FBS)Sigma-AldrichF4135Heat-inactivated, sterile
GentamicinSigma-AldrichG3632Stock concentration is 50 mg/mL
HT-29 cell lineATCCHTB-38Adenocarcinoma cell line; colorectal in origin
Paraffin filmBemisPM999Laboratory sealing film
Petri dishesThermo Fisher ScientificFB0875713100 mm x 15 mm Petri dishes for solid media
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific100100491x concentration; pH 7.4
Select agarInvitrogen30391023A mixture of polysaccharides extracted from red seaweed cell walls to make bacterial plating media
T75 flasksCorning430641UTissue culture flasks
Triton X-100Sigma-AldrichT8787A common non-ionic surfactant and emulsifier 
Trypan blue stainInvitrogenT10282A dye to detect dead tissue culture cells; only live cells can exclude the dye
Trypsin-EDTAGibco25200-056Reagent for cell dissociation for cell line maintenance and passaging
Tryptic Soy Broth (TSB)Sigma-AldrichT8907Bacterial growth media

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