Shigella ile Epitel Hücre Enfeksiyonu Analizleri

Özet

Mevcut protokol, in vitro epitel hücre dizileri kullanılarak Shigella aderansı, invazyonu ve hücre içi replikasyonunu sorgulamak için enfeksiyon testlerini açıklamaktadır.

Özet

İnsan tarafından uyarlanmış enterik bakteriyel patojen Shigella, her yıl milyonlarca enfeksiyona neden olur, pediatrik hastalar arasında uzun vadeli büyüme etkileri yaratır ve dünya çapında ishal ölümlerinin önde gelen nedenidir. Enfeksiyon, patojenin gastrointestinal sistemden geçmesi ve kolonu kaplayan epitel hücrelerini enfekte etmesi sonucu sulu veya kanlı ishale neden olur. Antibiyotik direncindeki şaşırtıcı artışlar ve onaylanmış aşıların mevcut eksikliği nedeniyle, standartlaştırılmış araştırma protokolleri bu zorlu patojeni incelemek için kritik öneme sahiptir. Burada, kolonik epitel hücrelerinde bakteriyel aderans, invazyon ve hücre içi replikasyonun in vitro analizlerini kullanarak Shigella'nın moleküler patogenezini incelemek için metodolojiler sunulmaktadır. Enfeksiyon analizlerinden önce, Shigella kolonilerinin virülans fenotipi, Kongo kırmızı boyasının agar plakalarına alınmasıyla doğrulandı. Takviye edilmiş laboratuvar ortamı, in vivo koşulları taklit etmek için bakteri kültürü sırasında da düşünülebilir. Bakteri hücreleri daha sonra, enfeksiyonun her aşamasını analiz etmek için adaptasyonlarla belirlenmiş bir enfeksiyon çokluğunda doku kültürü plakalarındaki kolon epitel hücrelerini enfekte etmek için standart bir protokolde kullanılır. Aderans testleri için, Shigella hücreleri, epitel hücreleriyle bakteriyel teması teşvik etmek için azaltılmış ortam seviyeleri ile inkübe edilir. Hem invazyon hem de hücre içi replikasyon deneyleri için, hücre dışı bakterileri ortadan kaldırmak ve invazyonun değerlendirilmesini ve / veya hücre içi replikasyon oranlarının ölçülmesini sağlamak için çeşitli zaman aralıklarında gentamisin uygulanır. Tüm enfeksiyon protokolleri, enfekte epitel hücre lizatlarını seri olarak seyrelterek ve Kongo kırmızı agar plakaları üzerindeki enfekte titrelere göre bakteri kolonisi oluşturan birimleri kaplayarak yapışık, istila edilmiş ve/veya hücre içi bakterileri numaralandırır. Birlikte, bu protokoller, bu patojeni başarılı bir şekilde incelemek için epitel hücrelerinin Shigella enfeksiyonunun her aşaması için bağımsız karakterizasyon ve karşılaştırmalar sağlar.

Giriş

Enterik bakteriyel patojenlerin neden olduğu ishalli hastalıklar önemli bir küresel sağlık yüküdür. 2016 yılında, ishalli hastalıklar dünya çapında 1,3 milyon ölümden sorumluydu ve^beş yaşından küçük çocuklarda dördüncü önde gelen ölüm nedeniydi ^1,2. Gram-negatif, enterik bakteriyel patojen Shigella, dünya çapında ishal ölümlerinin önemli bir nedeni olan shigellozun etken maddesidir³. Shigellosis her yıl düşük ve orta gelirli ülkelerdeki çocuklarda önemli morbidite ve mortaliteye neden olurken, ^4,5 yüksek gelirli ülkeler....

Protokol

1. Reaktiflerin ve malzemelerin hazırlanması

NOT: Tüm hacimler, iki adet 6 oyuklu plaka kullanan bir tahlil ile tutarlıdır.

1. TSB ortamı: 15 g Triptik Soya Suyu (TSB, Malzeme Tablosuna bakınız) ortamına ve otoklava 0,5 L deiyonize (DI) su ekleyin. Oda sıcaklığında saklayın.
2. Safra tuzları ortamı (TSB + BS): % 0.4 (a / h) safra tuzları içeren TSB'yi hazırlamak için, 15 mL otoklavlanmış TSB içinde 0.06 g safra tuzunu (BS, Malzeme Tablosuna bakınız) yeniden süspanse edin. Filtre, 0,22 μm PES filtresi kullanarak sterilize edilir.
   NOT: Safra tuzları, 1:1 sodyum kolat ve sodyu....

Tartışmalar

Bu protokol, bağırsak epitel hücrelerinin Shigella aderansı, invazyonu ve hücre içi replikasyonunu incelemek için üç standart testi açıklar. Bu yöntemler, konakçı hücreler içindeki çeşitli bakteriyel patojenlerin invazyonunu ve hücre içi replikasyonunu incelemek için kullanılan klasik gentamisin testlerinin yalnızca değiştirilmiş versiyonları olsa da 49,50,51, Shigella'yı incelerken .......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm PES filter	Millipore-Sigma	SCGP00525	Sterile, polyethersulfone filter for sterilizing up to 50 mL media
14 mL culture tubes	Corning	352059	17 mm x 100 mm polypropylene test tubes with cap
50 mL conical tubes	Corning	430829	50 mL clear polypropylene conical bottom centrifuge tubes with leak-proof cap
6-well tissue culture plates	Corning	3516	Plates are treated for optimal cell attachment
Bile salts	Sigma-Aldrich	B8756	1:1 ratio of cholate to deoxycholate
Congo red dye	Sigma-Aldrich	C6277	A benzidine-based anionic diazo dye, >85% purity
Countess cell counting chamber slide	Invitrogen	C10283	To be used with the Countess Automated Cell Counter
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	A a highly polar organic reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	10569-010	DMEM is supplemented with high glucose, sodium pyruvate, GlutaMAX, and Phenol Red
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F4135	Heat-inactivated, sterile
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G3632	Stock concentration is 50 mg/mL
HT-29 cell line	ATCC	HTB-38	Adenocarcinoma cell line; colorectal in origin
Paraffin film	Bemis	PM999	Laboratory sealing film
Petri dishes	Thermo Fisher Scientific	FB0875713	100 mm x 15 mm Petri dishes for solid media
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010049	1x concentration; pH 7.4
Select agar	Invitrogen	30391023	A mixture of polysaccharides extracted from red seaweed cell walls to make bacterial plating media
T75 flasks	Corning	430641U	Tissue culture flasks
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	A common non-ionic surfactant and emulsifier
Trypan blue stain	Invitrogen	T10282	A dye to detect dead tissue culture cells; only live cells can exclude the dye
Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056	Reagent for cell dissociation for cell line maintenance and passaging
Tryptic Soy Broth (TSB)	Sigma-Aldrich	T8907	Bacterial growth media