志贺氏菌上皮细胞感染分析

摘要

本方案描述了使用体外上皮细胞系询问志贺氏菌粘附、侵袭和细胞内复制的感染测定。

摘要

人类适应的肠道细菌病原体志贺氏菌每年引起数百万例感染，在儿科患者中产生长期生长效应，并且是全球腹泻死亡的主要原因。由于病原体通过胃肠道并感染结肠内壁的上皮细胞，感染会引起水样或血性腹泻。随着抗生素耐药性的惊人增加和目前缺乏批准的疫苗，标准化的研究方案对于研究这种可怕的病原体至关重要。在这里，提出了使用结肠上皮细胞中细菌粘附、侵袭和细胞内复制的体外分析来检查志贺氏菌分子发病机制的方法。在感染分析之前，志贺氏菌菌落的毒力表型通过在琼脂平板上摄取刚果红染料来验证。在细菌培养过程中，也可以考虑使用补充的实验室培养基来模拟体内条件。然后，在标准化方案中使用细菌细胞，以已建立的感染多重感染感染组织培养板中的结肠上皮细胞，并适应分析感染的每个阶段。对于依从性测定，志贺氏菌细胞与降低的培养基水平一起孵育，以促进细菌与上皮细胞的接触。对于侵袭和细胞内复制测定，庆大霉素应用于不同的时间间隔，以消除细胞外细菌并能够评估侵袭和/或细胞内复制速率的定量。所有感染方案都通过连续稀释受感染的上皮细胞裂解物并相对于感染滴度在刚果红琼脂平板上铺板细菌集落形成单位来枚举贴壁、侵袭和/或细胞内细菌。总之，这些方案能够对上皮细胞志贺氏菌感染的每个阶段进行独立的表征和比较，以成功研究这种病原体。

引言

由肠道细菌病原体引起的腹泻病是全球卫生的重大负担。2016 年，腹泻病导致全球 130 万人死亡，是 5 岁以下儿童的第四大死因 ^1,2。革兰氏阴性肠道细菌病原体志贺氏菌是志贺氏菌病的病原体，志贺氏菌病是全球腹泻死亡的主要原因³。志贺菌病每年在低收入和中等收入国家的儿童中造成严重的发病率和死亡率^4,5，而高收入国家的感染与日托中心、食源性和水源性疫情有关^6,7,8,9。无效的疫苗开发¹⁰和抗微生物药物耐药性（AMR）^11,12的上升使大规模志贺氏菌疫情的管理变得复杂。美国疾病控制与预防中心最近的数据显示，2020 年美国近 46% 的志贺氏菌感染表现出耐药性

研究方案

1.试剂和材料的制备

注意：所有体积均与使用两个 6 孔板的测定一致。

1. TSB 培养基：将 0.5 L 去离子 （DI） 水加入 15 g 胰蛋白酶大豆肉汤（TSB，参见 材料表）培养基和高压灭菌器中。在室温下储存。
2. 胆汁盐培养基（TSB + BS）：要制备含有0.4%（w/v）胆汁盐的TSB，将0.06g胆盐（BS，参见 材料表）重悬于15mL高压灭菌的TSB中。使用0.22μmPES过滤器过滤灭菌。
   注意：胆汁盐由胆酸钠和脱氧胆酸钠的 1：1 混合物组成。使用前立即准备新鲜培养基。
3. DMEM + 10% （v/v） FBS：将 5 mL 胎牛血清 （FBS） 加入 45 mL Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中。储存在4°C。
4. DMEM + 庆大霉素：向 50 mL 试管中加入 50 mL DMEM 和 50 μL 50 mg/mL 庆大霉素（参见 材料表）。
   注意：在每次实验之前，将新鲜等分试样在37°C水浴中加热。
5. PBS + 1% （v/v） Triton X-100：将 150 μL Triton X-100 加入 15 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中。
   注意：在每次实验之前，将新鲜....

讨论

该方案描述了一组三种标准化测定法，用于研究志贺氏菌的粘附，侵袭和肠上皮细胞的细胞内复制。尽管这些方法只是用于研究宿主细胞内各种细菌病原体的侵袭和细胞内复制的经典庆大霉素测定法的改进版本49,50,51，但在研究志贺氏菌时必须特别考虑。

志贺氏菌是兼性厌氧菌，在37°C.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm PES filter	Millipore-Sigma	SCGP00525	Sterile, polyethersulfone filter for sterilizing up to 50 mL media
14 mL culture tubes	Corning	352059	17 mm x 100 mm polypropylene test tubes with cap
50 mL conical tubes	Corning	430829	50 mL clear polypropylene conical bottom centrifuge tubes with leak-proof cap
6-well tissue culture plates	Corning	3516	Plates are treated for optimal cell attachment
Bile salts	Sigma-Aldrich	B8756	1:1 ratio of cholate to deoxycholate
Congo red dye	Sigma-Aldrich	C6277	A benzidine-based anionic diazo dye, >85% purity
Countess cell counting chamber slide	Invitrogen	C10283	To be used with the Countess Automated Cell Counter
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	A a highly polar organic reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	10569-010	DMEM is supplemented with high glucose, sodium pyruvate, GlutaMAX, and Phenol Red
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F4135	Heat-inactivated, sterile
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G3632	Stock concentration is 50 mg/mL
HT-29 cell line	ATCC	HTB-38	Adenocarcinoma cell line; colorectal in origin
Paraffin film	Bemis	PM999	Laboratory sealing film
Petri dishes	Thermo Fisher Scientific	FB0875713	100 mm x 15 mm Petri dishes for solid media
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010049	1x concentration; pH 7.4
Select agar	Invitrogen	30391023	A mixture of polysaccharides extracted from red seaweed cell walls to make bacterial plating media
T75 flasks	Corning	430641U	Tissue culture flasks
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	A common non-ionic surfactant and emulsifier
Trypan blue stain	Invitrogen	T10282	A dye to detect dead tissue culture cells; only live cells can exclude the dye
Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056	Reagent for cell dissociation for cell line maintenance and passaging
Tryptic Soy Broth (TSB)	Sigma-Aldrich	T8907	Bacterial growth media