Análisis de Infección de Células Epiteliales con Shigella

Resumen

El presente protocolo describe ensayos de infección para interrogar la adherencia, invasión y replicación intracelular de Shigella utilizando líneas celulares epiteliales in vitro .

Resumen

Shigella, patógeno bacteriano entérico adaptado al ser humano, causa millones de infecciones cada año, crea efectos de crecimiento a largo plazo entre los pacientes pediátricos y es una de las principales causas de muertes diarreicas en todo el mundo. La infección induce diarrea acuosa o sanguinolenta como resultado de que el patógeno transita por el tracto gastrointestinal e infecta las células epiteliales que recubren el colon. Con el asombroso aumento de la resistencia a los antibióticos y la actual falta de vacunas aprobadas, los protocolos de investigación estandarizados son fundamentales para estudiar este formidable patógeno. Aquí, se presentan metodologías para examinar la patogénesis molecular de Shigella utilizando análisis in vitro de adherencia bacteriana, invasión y replicación intracelular en células epiteliales del colon. Antes de los análisis de infección, el fenotipo de virulencia de las colonias de Shigella se verificó mediante la absorción del colorante rojo Congo en placas de agar. También se pueden considerar medios de laboratorio suplementados durante el cultivo bacteriano para imitar las condiciones in vivo. A continuación, las células bacterianas se utilizan en un protocolo estandarizado para infectar las células epiteliales del colon en placas de cultivo de tejidos en una multiplicidad establecida de infección con adaptaciones para analizar cada etapa de la infección. Para los ensayos de adherencia, las células de Shigella se incuban con niveles reducidos de medios para promover el contacto bacteriano con las células epiteliales. Tanto para los ensayos de invasión como para los de replicación intracelular, la gentamicina se aplica durante varios intervalos de tiempo para eliminar las bacterias extracelulares y permitir la evaluación de la invasión y/o la cuantificación de las tasas de replicación intracelular. Todos los protocolos de infección enumeran las bacterias adherentes, invadidas y/o intracelulares mediante la dilución en serie de lisados de células epiteliales infectadas y la siembra de unidades formadoras de colonias bacterianas en relación con los títulos de infección en placas de agar rojo Congo. En conjunto, estos protocolos permiten la caracterización independiente y las comparaciones para cada etapa de la infección por Shigella de las células epiteliales para estudiar este patógeno con éxito.

Introducción

Las enfermedades diarreicas causadas por patógenos bacterianos entéricos son una importante carga para la salud mundial. En 2016, las enfermedades diarreicas fueron responsables de 1,3 millones de muertes en todo el mundo y fueron la cuarta causa de muerte en niños menores de cinco años ^1,2. El patógeno bacteriano entérico gramnegativo Shigella es el agente causal de la shigelosis, una de las principales causas de muerte diarreica en todo el mundo³. La shigelosis causa una morbilidad y mortalidad significativas cada año en niños de países de ingresos bajos y medianos

Protocolo

1. Preparación de reactivos y materiales

NOTA: Todos los volúmenes son consistentes con un ensayo que utiliza dos placas de 6 pocillos.

1. Medio TSB: Añadir 0,5 L de agua desionizada (DI) a 15 g de medio caldo de soja tríptico (TSB, ver Tabla de Materiales) y autoclave. Almacenar a temperatura ambiente.
2. Medio de sales biliares (TSB + BS): Para preparar TSB que contenga 0,4% (p/v) de sales biliares, vuelva a suspender 0,06 g de sales biliares (BS, consulte la Tabla de materiales) en 15 ml de TSB esterilizada en autoclave. Esterilizar con filtro con un filtro PES de 0,22 μm.<....

Discusión

Este protocolo describe un conjunto de tres ensayos estandarizados para estudiar la adherencia a Shigella, la invasión y la replicación intracelular de las células epiteliales intestinales. Aunque estos métodos no son más que versiones modificadas de los ensayos clásicos de gentamicina utilizados para estudiar la invasión y replicación intracelular de diversos patógenos bacterianos dentro de las células huésped 49,50,51, se deben aplicar consideraciones especiales cuando se estudia Shigella.<.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm PES filter	Millipore-Sigma	SCGP00525	Sterile, polyethersulfone filter for sterilizing up to 50 mL media
14 mL culture tubes	Corning	352059	17 mm x 100 mm polypropylene test tubes with cap
50 mL conical tubes	Corning	430829	50 mL clear polypropylene conical bottom centrifuge tubes with leak-proof cap
6-well tissue culture plates	Corning	3516	Plates are treated for optimal cell attachment
Bile salts	Sigma-Aldrich	B8756	1:1 ratio of cholate to deoxycholate
Congo red dye	Sigma-Aldrich	C6277	A benzidine-based anionic diazo dye, >85% purity
Countess cell counting chamber slide	Invitrogen	C10283	To be used with the Countess Automated Cell Counter
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	A a highly polar organic reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	10569-010	DMEM is supplemented with high glucose, sodium pyruvate, GlutaMAX, and Phenol Red
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F4135	Heat-inactivated, sterile
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G3632	Stock concentration is 50 mg/mL
HT-29 cell line	ATCC	HTB-38	Adenocarcinoma cell line; colorectal in origin
Paraffin film	Bemis	PM999	Laboratory sealing film
Petri dishes	Thermo Fisher Scientific	FB0875713	100 mm x 15 mm Petri dishes for solid media
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010049	1x concentration; pH 7.4
Select agar	Invitrogen	30391023	A mixture of polysaccharides extracted from red seaweed cell walls to make bacterial plating media
T75 flasks	Corning	430641U	Tissue culture flasks
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	A common non-ionic surfactant and emulsifier
Trypan blue stain	Invitrogen	T10282	A dye to detect dead tissue culture cells; only live cells can exclude the dye
Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056	Reagent for cell dissociation for cell line maintenance and passaging
Tryptic Soy Broth (TSB)	Sigma-Aldrich	T8907	Bacterial growth media