Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В настоящем протоколе описаны тесты на инфекции для исследования приверженности шигелл , инвазии и внутриклеточной репликации с использованием эпителиальных клеточных линий in vitro .

Аннотация

Адаптированный к человеку кишечный бактериальный патоген шигелла вызывает миллионы инфекций каждый год, создает долгосрочные эффекты роста среди педиатрических пациентов и является основной причиной смерти от диареи во всем мире. Инфекция вызывает водянистую или кровавую диарею в результате того, что патоген проходит через желудочно-кишечный тракт и инфицирует эпителиальные клетки, выстилающие толстую кишку. В условиях ошеломляющего роста устойчивости к антибиотикам и отсутствия в настоящее время одобренных вакцин стандартизированные протоколы исследований имеют решающее значение для изучения этого грозного патогена. Представлены методики изучения молекулярного патогенеза шигелл с использованием in vitro анализа бактериальной адгезии, инвазии и внутриклеточной репликации в эпителиальных клетках толстой кишки. Перед проведением анализа инфекции фенотип вирулентности колоний шигелл был проверен путем поглощения красного красителя Конго на агаровых пластинах. Во время бактериального культивирования также можно рассмотреть возможность использования дополнительных лабораторных сред для имитации условий in vivo . Затем бактериальные клетки используются в стандартизированном протоколе для инфицирования эпителиальных клеток толстой кишки в тканевых культуральных планшетах при установленной множественности инфекции с адаптацией для анализа каждой стадии инфекции. Для анализа на адгезию клетки шигелл инкубируют с пониженными уровнями среды, чтобы способствовать контакту бактерий с эпителиальными клетками. Как для инвазий, так и для внутриклеточной репликации гентамицин применяется в течение различных временных интервалов для уничтожения внеклеточных бактерий и обеспечения возможности оценки инвазии и/или количественной оценки скорости внутриклеточной репликации. Во всех протоколах инфекции перечисляются адгезивные, инвазированные и/или внутриклеточные бактерии путем последовательного разбавления лизатов инфицированных эпителиальных клеток и нанесения бактериальных колониеобразующих единиц относительно титров инфекции на пластинах из конголезского красного агара. Вместе эти протоколы позволяют проводить независимые характеристики и сравнения для каждой стадии инфекции эпителиальных клеток шигеллами для успешного изучения этого патогена.

Введение

Диарейные заболевания, вызываемые кишечными бактериальными патогенами, представляют собой серьезное глобальное бремя для здравоохранения. В 2016 г. диарейные заболевания стали причиной 1,3 миллиона случаев смерти во всем мире и были четвертой по значимости причиной смерти детей в возрасте до пяти лет. Грамотрицательный кишечный бактериальный патоген шигелла является возбудителем шигеллеза, основной причины смерти от диареи во всем мире3. Шигеллез ежегодно вызывает значительную заболеваемость и смертность среди детей из стран с низким и средним уровнем дохода

протокол

1. Подготовка реагентов и материалов

ПРИМЕЧАНИЕ: Все объемы соответствуют анализу с использованием двух 6-луночных планшетов.

  1. Среда TSB: Добавьте 0,5 л деионизированной (DI) воды к 15 г среды триптического соевого бульона (TSB, см. Таблицу материалов) и автоклав. Хранить при комнатной температуре.
  2. Среда желчных солей (БСЭ + БС): Для приготовления БСЭ, содержащего 0,4% (по массе) желчных солей, ресуспендировать 0,06 г желчных солей (БС, см. Таблицу материалов) в 15 мл автоклавного БСЭ. Фильтр стерилизовать с помощью фильтра PES 0,22 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Желчные соли состоя....

Результаты

Анализы приверженности, инвазии и внутриклеточной репликации были проведены, сравнивая S. flexneri 2457T дикого типа (WT) с S. flexneri ΔVF (ΔVF), мутантом, который, как предполагается, отрицательно регулирует вирулентность шигелл. Поскольку шигеллы используют желчные соли в ка?.......

Обсуждение

Этот протокол описывает набор из трех стандартизированных анализов для изучения адгезии шигелл, инвазии и внутриклеточной репликации эпителиальных клеток кишечника. Несмотря на то, что эти методы являются всего лишь модифицированными версиями классических гентамициновых анали.......

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Поддержку авторам оказывают Отделение педиатрии Массачусетской больницы общего профиля, грант Исполнительного комитета по временному финансированию исследований (ISF) 2022A009041, грант Национального института аллергии и инфекционных заболеваний R21AI146405 и грант Национального института диабета и заболеваний пищеварительной системы и почек Исследовательский центр питания и ожирения в Гарварде (NORCH) 2P30DK040561-26. Спонсоры не играли никакой роли в планировании исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 μm PES filterMillipore-SigmaSCGP00525Sterile, polyethersulfone filter for sterilizing up to 50 mL media
14 mL culture tubesCorning35205917 mm x 100 mm polypropylene test tubes with cap
50 mL conical tubesCorning43082950 mL clear polypropylene conical bottom centrifuge tubes with leak-proof cap
6-well tissue culture platesCorning3516Plates are treated for optimal cell attachment
Bile saltsSigma-AldrichB87561:1 ratio of cholate to deoxycholate
Congo red dyeSigma-AldrichC6277A benzidine-based anionic diazo dye, >85% purity
Countess cell counting chamber slideInvitrogenC10283To be used with the Countess Automated Cell Counter
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD8418A a highly polar organic reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco10569-010DMEM is supplemented with high glucose, sodium pyruvate, GlutaMAX, and Phenol Red
Fetal Bovine Serum (FBS)Sigma-AldrichF4135Heat-inactivated, sterile
GentamicinSigma-AldrichG3632Stock concentration is 50 mg/mL
HT-29 cell lineATCCHTB-38Adenocarcinoma cell line; colorectal in origin
Paraffin filmBemisPM999Laboratory sealing film
Petri dishesThermo Fisher ScientificFB0875713100 mm x 15 mm Petri dishes for solid media
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific100100491x concentration; pH 7.4
Select agarInvitrogen30391023A mixture of polysaccharides extracted from red seaweed cell walls to make bacterial plating media
T75 flasksCorning430641UTissue culture flasks
Triton X-100Sigma-AldrichT8787A common non-ionic surfactant and emulsifier 
Trypan blue stainInvitrogenT10282A dye to detect dead tissue culture cells; only live cells can exclude the dye
Trypsin-EDTAGibco25200-056Reagent for cell dissociation for cell line maintenance and passaging
Tryptic Soy Broth (TSB)Sigma-AldrichT8907Bacterial growth media

Ссылки

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены