Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
В настоящем протоколе описаны тесты на инфекции для исследования приверженности шигелл , инвазии и внутриклеточной репликации с использованием эпителиальных клеточных линий in vitro .
Адаптированный к человеку кишечный бактериальный патоген шигелла вызывает миллионы инфекций каждый год, создает долгосрочные эффекты роста среди педиатрических пациентов и является основной причиной смерти от диареи во всем мире. Инфекция вызывает водянистую или кровавую диарею в результате того, что патоген проходит через желудочно-кишечный тракт и инфицирует эпителиальные клетки, выстилающие толстую кишку. В условиях ошеломляющего роста устойчивости к антибиотикам и отсутствия в настоящее время одобренных вакцин стандартизированные протоколы исследований имеют решающее значение для изучения этого грозного патогена. Представлены методики изучения молекулярного патогенеза шигелл с использованием in vitro анализа бактериальной адгезии, инвазии и внутриклеточной репликации в эпителиальных клетках толстой кишки. Перед проведением анализа инфекции фенотип вирулентности колоний шигелл был проверен путем поглощения красного красителя Конго на агаровых пластинах. Во время бактериального культивирования также можно рассмотреть возможность использования дополнительных лабораторных сред для имитации условий in vivo . Затем бактериальные клетки используются в стандартизированном протоколе для инфицирования эпителиальных клеток толстой кишки в тканевых культуральных планшетах при установленной множественности инфекции с адаптацией для анализа каждой стадии инфекции. Для анализа на адгезию клетки шигелл инкубируют с пониженными уровнями среды, чтобы способствовать контакту бактерий с эпителиальными клетками. Как для инвазий, так и для внутриклеточной репликации гентамицин применяется в течение различных временных интервалов для уничтожения внеклеточных бактерий и обеспечения возможности оценки инвазии и/или количественной оценки скорости внутриклеточной репликации. Во всех протоколах инфекции перечисляются адгезивные, инвазированные и/или внутриклеточные бактерии путем последовательного разбавления лизатов инфицированных эпителиальных клеток и нанесения бактериальных колониеобразующих единиц относительно титров инфекции на пластинах из конголезского красного агара. Вместе эти протоколы позволяют проводить независимые характеристики и сравнения для каждой стадии инфекции эпителиальных клеток шигеллами для успешного изучения этого патогена.
Диарейные заболевания, вызываемые кишечными бактериальными патогенами, представляют собой серьезное глобальное бремя для здравоохранения. В 2016 г. диарейные заболевания стали причиной 1,3 миллиона случаев смерти во всем мире и были четвертой по значимости причиной смерти детей в возрасте до пяти лет. Грамотрицательный кишечный бактериальный патоген шигелла является возбудителем шигеллеза, основной причины смерти от диареи во всем мире3. Шигеллез ежегодно вызывает значительную заболеваемость и смертность среди детей из стран с низким и средним уровнем дохода
1. Подготовка реагентов и материалов
ПРИМЕЧАНИЕ: Все объемы соответствуют анализу с использованием двух 6-луночных планшетов.
Анализы приверженности, инвазии и внутриклеточной репликации были проведены, сравнивая S. flexneri 2457T дикого типа (WT) с S. flexneri ΔVF (ΔVF), мутантом, который, как предполагается, отрицательно регулирует вирулентность шигелл. Поскольку шигеллы используют желчные соли в ка?.......
Этот протокол описывает набор из трех стандартизированных анализов для изучения адгезии шигелл, инвазии и внутриклеточной репликации эпителиальных клеток кишечника. Несмотря на то, что эти методы являются всего лишь модифицированными версиями классических гентамициновых анали.......
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Поддержку авторам оказывают Отделение педиатрии Массачусетской больницы общего профиля, грант Исполнительного комитета по временному финансированию исследований (ISF) 2022A009041, грант Национального института аллергии и инфекционных заболеваний R21AI146405 и грант Национального института диабета и заболеваний пищеварительной системы и почек Исследовательский центр питания и ожирения в Гарварде (NORCH) 2P30DK040561-26. Спонсоры не играли никакой роли в планировании исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.22 μm PES filter | Millipore-Sigma | SCGP00525 | Sterile, polyethersulfone filter for sterilizing up to 50 mL media |
14 mL culture tubes | Corning | 352059 | 17 mm x 100 mm polypropylene test tubes with cap |
50 mL conical tubes | Corning | 430829 | 50 mL clear polypropylene conical bottom centrifuge tubes with leak-proof cap |
6-well tissue culture plates | Corning | 3516 | Plates are treated for optimal cell attachment |
Bile salts | Sigma-Aldrich | B8756 | 1:1 ratio of cholate to deoxycholate |
Congo red dye | Sigma-Aldrich | C6277 | A benzidine-based anionic diazo dye, >85% purity |
Countess cell counting chamber slide | Invitrogen | C10283 | To be used with the Countess Automated Cell Counter |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | A a highly polar organic reagent |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 10569-010 | DMEM is supplemented with high glucose, sodium pyruvate, GlutaMAX, and Phenol Red |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F4135 | Heat-inactivated, sterile |
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G3632 | Stock concentration is 50 mg/mL |
HT-29 cell line | ATCC | HTB-38 | Adenocarcinoma cell line; colorectal in origin |
Paraffin film | Bemis | PM999 | Laboratory sealing film |
Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | FB0875713 | 100 mm x 15 mm Petri dishes for solid media |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | 1x concentration; pH 7.4 |
Select agar | Invitrogen | 30391023 | A mixture of polysaccharides extracted from red seaweed cell walls to make bacterial plating media |
T75 flasks | Corning | 430641U | Tissue culture flasks |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | A common non-ionic surfactant and emulsifier |
Trypan blue stain | Invitrogen | T10282 | A dye to detect dead tissue culture cells; only live cells can exclude the dye |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | Reagent for cell dissociation for cell line maintenance and passaging |
Tryptic Soy Broth (TSB) | Sigma-Aldrich | T8907 | Bacterial growth media |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены