الكشف عن الفرص العلاجية مع نماذج الميلانوما العضوية المشتقة من المريض

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لتوليد عضويات مشتقة من سرطان الجلد عن طريق زراعة معلقات الخلايا المنفصلة من أنسجة سرطان الجلد الطازجة. تلخص هذه الكائنات العضوية بأمانة الأورام الخاصة بالمريض في المختبر ، وتقدم نهجا مبتكرا لاستكشاف آليات تثبيط مناعة الورم ، وفحص الأدوية ، وآليات مقاومة الأدوية ، ونهج مراقبة السرطان.

Abstract

مع تطور العلاج المناعي ، هناك حاجة مستمرة لتطوير نماذج يمكنها تلخيص البيئة المكروية للورم للأورام المحلية. في حين أن النماذج التقليدية ثنائية وثلاثية الأبعاد يمكن أن تقدم نظرة ثاقبة لتطور السرطان وتطوره ، إلا أنها تفتقر إلى الجوانب الحاسمة التي تعيق التقليد المخلص للأورام المحلية. النموذج البديل الذي اكتسب الكثير من الاهتمام هو العضو العضوي المشتق من المريض. يلخص تطوير هذه الكائنات العضوية التواصل المعقد بين الخلايا ، والبيئة المكروية للورم ، والبنية النسيجية للأورام. تصف هذه الورقة بروتوكول إنشاء نماذج عضوي مشتق من سرطان الجلد (MPDO). للتحقق من صحة هذه النماذج ، قمنا بتقييم تكوين الخلايا المناعية ، بما في ذلك مستويات التعبير عن علامات تنشيط الخلايا التائية ، لتأكيد عدم التجانس الخلوي للعضويات. بالإضافة إلى ذلك ، لوصف الفائدة المحتملة ل MPDOs في العلاجات الخلوية ، قمنا بتقييم القدرات السامة للخلايا لعلاج الكائنات العضوية بالخلايا التائية γδ. في الختام ، توفر نماذج MPDO طرقا واعدة لفهم تعقيد الورم ، والتحقق من صحة الاستراتيجيات العلاجية ، وربما تطوير العلاج الشخصي.

Introduction

نماذج زراعة الخلايا التقليدية 2-D هي أدوات أساسية في أبحاث السرطان لدراسة تطور السرطان والعلاج¹. لا تسمح هذه النماذج فقط للظروف التجريبية الخاضعة للرقابة بالتحقيق في الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة وراء تطور السرطان وتطوره ، ولكنها توفر أيضا نتائج تجريبية فعالة من حيث التكلفة وسريعة نسبيا. ومع ذلك ، فإن استخدامها مقيد بسبب التنوع الخلوي المحدود في البيئة المكروية للورم (TME) ، والتي لا يمكن تلخيصها في الطبيعة المستوية لنماذج الثقافة^{الأحادية 2}. بالإضافة إلى ذلك ، توفر نماذج زراعة الخلايا بيئة مفرطة في التبسيط مقارنة بجسم الإنسان³. وبالتالي ، لفهم تطور السرطان بشك....

Protocol

تم الحصول على أنسجة سرطان الجلد البشري من المرضى الذين يتلقون العلاج في جامعة بنسلفانيا باستخدام بروتوكول جمع الأنسجة (UPCC08607) الذي وافق عليه مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة بنسلفانيا. وقع جميع المرضى على الموافقة المستنيرة. بعد استئصال أنسجة سرطان الجلد البشري ، يتم وضع أنسجة الورم في وسط النسر المعدل في Dulbecco (DMEM) ويتم الاحتفاظ بها عند 4 درجات مئوية حتى المعالجة (في غضون 6 ساعات). تم اشتقاق العضويات المشتقة من سرطان الجلد (MPDOs) من ورم جديد كما هو موضح في الشكل 1.

1. عزل الخلايا من أنسجة سرطان الجلد البشري

1. الاستعدادات قبل بدء الإجراء
   ملاحظ....

النتائج

تمت مراقبة شكل وحجم MPDOs بمرور الوقت لدراسة ديناميكيات نموها. كما هو موضح في الشكل 2 ، خلال فترة النمو الأولية ، زاد حجم العضو بشكل كبير طوال 7 أيام موضحة. بعد ملاحظة ديناميكيات نمو MPDO ، تحول الانتباه إلى تقييم تكوين الخلايا المناعية للتحقق من التلخيص المخلص.......

Discussion

عالج ظهور PDOs العديد من القيود التي تفرضها طرق أبحاث السرطان الأخرى التي تم إنشاؤها سابقا مع إدخال تطبيقات تحويلية محتملة في هذا المجال. تم اقتراح هذه التقنية العضوية في البداية في عام 2009 من قبل هانز كليفرز وزملائه ، الذين تمكنوا من إنشاء نظام زراعة عضوي معوي بنجاح عن طري?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Red Cap Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial	Corning	431420
50 mL Polypropylene Conical Tube	Corning	352070
100 mm TC-treated Cell Culture Dish	Corning	353003
105 mm Polystyrene Forceps Sterile	Caplugs Evergreen	222-1121-B1I
150 cm2 Cell Culture Flask	Corning	CLS430825
A83-01	Tocris	2939
Advanced DMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1)	Gibco	12634-010
B-27 Supplement (50x)	Gibco	17504-044
Brilliant Violet 510 anti-human Perforin Antibody	BioLegend	308120
Brilliant Violet 605 anti-human Ki-67 Antibody	BioLegend	350522
Brilliant Violet 650 anti-human CD366 (Tim-3) Antibody	BioLegend	345028
Brilliant Violet 711 anti-human CD45 Antibody	BioLegend	304050
Cell Culture Inserts 0.4 µm, 30 mm Diameter	Millipore Sigma	PIHP03050
Cell Staining Buffer	BioLegend	420201
Cell Strainer 40 µm Nylon	Corning	352340
Cell Strainer 70 µm Nylon	Corning	352350
Collagenase, Type IV, powder	Gibco	17104019
Cultrex Rat Collagen I	Trevigen	3440-100-01
Culture Plate, PS, 48 wells, TC treated with lid, sterile	Max Scientific	07-6048
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM - high glucose 4.5 mg/mL	Corning	MT10-0130CV
Dnase I - Grade II	Millipore Sigma	10104159001
DPBS, 1%	Corning	21-031-CV
Fetal Bovine Serum, FBS	Corning	MT35-010-CV
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I	BD Biosciences	556547
Forskolin	Tocris	1099
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)	ThermoFisher	10131035
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher	35050061
Ham's F12 Nutrient Mix	ThermoFisher	11765054
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Hygromycin B (50 mg/mL)	ThermoFisher	10687010
L-Glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-081
L-WRN cell	ATCC	CRL-3276
Matrigel Phenol Free & Growth Fact. Reduced	Corning	356231
Millex PVDF syringe filter, 0.22 μM	Millipore Sigma	SLGVR33RB
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-100G
Nunc TripleFlask Treated Cell Culture Flask	ThermoFisher	132867
PE/Cyanine5 anti-human CD8a Antibody	BioLegend	301010
PE-Cy 7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)	BD Biosciences	561272
Pen Strep	Gibco	15140-122
Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15-1MG
Recombinant Human FGF-acidic	Peprotech	100-17A
Sodium Bicarbonate Solution (NaHCO3) (7.5%)	Quality Biological	118-085-721
Stainless Steel Surgical Blades no. 22	Integra	4-322
TrypLE Express	Gibco	12604-021