Aufdeckung therapeutischer Möglichkeiten mit Organoidmodellen von Melanom-Patienten

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Erzeugung von Organoiden von Melanompatienten vor, indem disassoziierte Zellsuspensionen aus frischem Melanomgewebe kultiviert werden. Diese Organoide rekapitulieren patientenspezifische Tumore in vitro originalgetreu und bieten einen innovativen Ansatz zur Erforschung immunsuppressiver Mechanismen von Tumoren, des Wirkstoffscreenings, der Arzneimittelresistenzmechanismen und der Krebsüberwachungsansätze.

Zusammenfassung

Mit der Entwicklung der Immuntherapie besteht ein anhaltender Bedarf, Modelle zu entwickeln, die die Tumormikroumgebung von nativen Tumoren rekapitulieren können. Traditionelle zwei- und dreidimensionale Modelle können zwar Einblicke in die Entstehung und den Verlauf von Krebs bieten, aber es fehlen entscheidende Aspekte, die eine originalgetreue Nachahmung nativer Tumoren behindern. Ein alternatives Modell, das viel Aufmerksamkeit erregt hat, ist das von Patienten abgeleitete Organoid. Die Entwicklung dieser Organoide rekapituliert die komplexe interzelluläre Kommunikation, die Tumormikroumgebung und die Histoarchitektur von Tumoren. In diesem Artikel wird das Protokoll für die Etablierung von Melanom-Patienten-abgeleiteten Organoid-Modellen (MPDO) beschrieben. Um diese Modelle zu validieren, untersuchten wir die Zusammensetzung der Immunzellen, einschließlich der Expressionsniveaus von T-Zell-Aktivierungsmarkern, um die zelluläre Heterogenität der Organoide zu bestätigen. Um den potenziellen Nutzen von MPDOs in zellulären Therapien zu beschreiben, untersuchten wir außerdem die zytotoxischen Fähigkeiten der Behandlung der Organoide mit γδ T-Zellen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die MPDO-Modelle vielversprechende Wege bieten, um die Komplexität von Tumoren zu verstehen, therapeutische Strategien zu validieren und möglicherweise die personalisierte Behandlung voranzutreiben.

Einleitung

Konventionelle 2-D-Zellkulturmodelle sind in der Krebsforschung ein wesentliches Werkzeug zur Untersuchung des Krebsverlaufs und der Krebstherapie¹. Diese Modelle ermöglichen nicht nur kontrollierte experimentelle Bedingungen, um die molekularen und zellulären Mechanismen zu untersuchen, die der Krebsentstehung und -progression zugrunde liegen, sondern liefern auch kostengünstige und relativ schnelle experimentelle Ergebnisse. Ihre Verwendung ist jedoch aufgrund der begrenzten zellulären Diversität in der Tumormikroumgebung (TME) eingeschränkt, die in einer koplanaren Natur von Monokulturmodellen nicht rekapitu....

Protokoll

Humanes Melanomgewebe wurde von Patienten gewonnen, die an der University of Pennsylvania unter Verwendung des Gewebeentnahmeprotokolls (UPCC08607) behandelt wurden, das vom Institutional Review Board der University of Pennsylvania genehmigt wurde. Alle Patienten haben eine Einverständniserklärung unterschrieben. Nach der Resektion des humanen Melanomgewebes wird das Tumorgewebe in das modifizierte Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco gelegt und bis zur Verarbeitung (innerhalb von 6 h) bei 4 °C gehalten. Melanom-Patienten-derived Organoide (MPDOs) wurden aus einem frischen Tumor gewonnen, wie in Abbildung 1 d....

Diskussion

Das Aufkommen von PDOs hat mehrere Einschränkungen behoben, die durch andere zuvor etablierte Krebsforschungsmethoden aufgeworfen wurden, und gleichzeitig transformative potenzielle Anwendungen in diesem Bereich eingeführt. Diese Organoid-Technologie wurde ursprünglich im Jahr 2009 von Hans Clevers und Kollegen vorgeschlagen, die erfolgreich ein Darm-Organoid-Kultursystem etablieren konnten, indem sie Lgr5⁺ -Stammzellen aus dem Darm von Mäusen in einem 3D-Matrixgel kultivi.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Red Cap Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial	Corning	431420
50 mL Polypropylene Conical Tube	Corning	352070
100 mm TC-treated Cell Culture Dish	Corning	353003
105 mm Polystyrene Forceps Sterile	Caplugs Evergreen	222-1121-B1I
150 cm2 Cell Culture Flask	Corning	CLS430825
A83-01	Tocris	2939
Advanced DMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1)	Gibco	12634-010
B-27 Supplement (50x)	Gibco	17504-044
Brilliant Violet 510 anti-human Perforin Antibody	BioLegend	308120
Brilliant Violet 605 anti-human Ki-67 Antibody	BioLegend	350522
Brilliant Violet 650 anti-human CD366 (Tim-3) Antibody	BioLegend	345028
Brilliant Violet 711 anti-human CD45 Antibody	BioLegend	304050
Cell Culture Inserts 0.4 µm, 30 mm Diameter	Millipore Sigma	PIHP03050
Cell Staining Buffer	BioLegend	420201
Cell Strainer 40 µm Nylon	Corning	352340
Cell Strainer 70 µm Nylon	Corning	352350
Collagenase, Type IV, powder	Gibco	17104019
Cultrex Rat Collagen I	Trevigen	3440-100-01
Culture Plate, PS, 48 wells, TC treated with lid, sterile	Max Scientific	07-6048
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM - high glucose 4.5 mg/mL	Corning	MT10-0130CV
Dnase I - Grade II	Millipore Sigma	10104159001
DPBS, 1%	Corning	21-031-CV
Fetal Bovine Serum, FBS	Corning	MT35-010-CV
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I	BD Biosciences	556547
Forskolin	Tocris	1099
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)	ThermoFisher	10131035
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher	35050061
Ham's F12 Nutrient Mix	ThermoFisher	11765054
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Hygromycin B (50 mg/mL)	ThermoFisher	10687010
L-Glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-081
L-WRN cell	ATCC	CRL-3276
Matrigel Phenol Free & Growth Fact. Reduced	Corning	356231
Millex PVDF syringe filter, 0.22 μM	Millipore Sigma	SLGVR33RB
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-100G
Nunc TripleFlask Treated Cell Culture Flask	ThermoFisher	132867
PE/Cyanine5 anti-human CD8a Antibody	BioLegend	301010
PE-Cy 7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)	BD Biosciences	561272
Pen Strep	Gibco	15140-122
Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15-1MG
Recombinant Human FGF-acidic	Peprotech	100-17A
Sodium Bicarbonate Solution (NaHCO3) (7.5%)	Quality Biological	118-085-721
Stainless Steel Surgical Blades no. 22	Integra	4-322
TrypLE Express	Gibco	12604-021