Aufdeckung therapeutischer Möglichkeiten mit Organoidmodellen von Melanom-Patienten

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Erzeugung von Organoiden von Melanompatienten vor, indem disassoziierte Zellsuspensionen aus frischem Melanomgewebe kultiviert werden. Diese Organoide rekapitulieren patientenspezifische Tumore in vitro originalgetreu und bieten einen innovativen Ansatz zur Erforschung immunsuppressiver Mechanismen von Tumoren, des Wirkstoffscreenings, der Arzneimittelresistenzmechanismen und der Krebsüberwachungsansätze.

Zusammenfassung

Mit der Entwicklung der Immuntherapie besteht ein anhaltender Bedarf, Modelle zu entwickeln, die die Tumormikroumgebung von nativen Tumoren rekapitulieren können. Traditionelle zwei- und dreidimensionale Modelle können zwar Einblicke in die Entstehung und den Verlauf von Krebs bieten, aber es fehlen entscheidende Aspekte, die eine originalgetreue Nachahmung nativer Tumoren behindern. Ein alternatives Modell, das viel Aufmerksamkeit erregt hat, ist das von Patienten abgeleitete Organoid. Die Entwicklung dieser Organoide rekapituliert die komplexe interzelluläre Kommunikation, die Tumormikroumgebung und die Histoarchitektur von Tumoren. In diesem Artikel wird das Protokoll für die Etablierung von Melanom-Patienten-abgeleiteten Organoid-Modellen (MPDO) beschrieben. Um diese Modelle zu validieren, untersuchten wir die Zusammensetzung der Immunzellen, einschließlich der Expressionsniveaus von T-Zell-Aktivierungsmarkern, um die zelluläre Heterogenität der Organoide zu bestätigen. Um den potenziellen Nutzen von MPDOs in zellulären Therapien zu beschreiben, untersuchten wir außerdem die zytotoxischen Fähigkeiten der Behandlung der Organoide mit γδ T-Zellen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die MPDO-Modelle vielversprechende Wege bieten, um die Komplexität von Tumoren zu verstehen, therapeutische Strategien zu validieren und möglicherweise die personalisierte Behandlung voranzutreiben.

Einleitung

Konventionelle 2-D-Zellkulturmodelle sind in der Krebsforschung ein wesentliches Werkzeug zur Untersuchung des Krebsverlaufs und der Krebstherapie¹. Diese Modelle ermöglichen nicht nur kontrollierte experimentelle Bedingungen, um die molekularen und zellulären Mechanismen zu untersuchen, die der Krebsentstehung und -progression zugrunde liegen, sondern liefern auch kostengünstige und relativ schnelle experimentelle Ergebnisse. Ihre Verwendung ist jedoch aufgrund der begrenzten zellulären Diversität in der Tumormikroumgebung (TME) eingeschränkt, die in einer koplanaren Natur von Monokulturmodellen nicht rekapituliert werden kann². Darüber hinaus bieten Zellkulturmodelle im Vergleich zum menschlichen Körper eine stark vereinfachte Umgebung³. Um das Fortschreiten der Krebserkrankung besser zu verstehen und wirksame Behandlungen zu entwickeln, haben sich die Forscher daher innovativen Modellen zugewandt, die darauf abzielen, die TME in der Natur genau zu rekapitulieren. Folglich ist die Aufrechterhaltung der Treue zu nativen Tumoren in diesen Modellen von größter Bedeutung. Angesichts der komplizierten Natur von Krebs könnte jede signifikante Abweichung vom ursprünglichen Tumor unvorhergesehene Variablen einführen, die aussagekräftige Schlussfolgerungen über das Tumorverhalten verwirren könnten.

Während sich patienteneigene Xenotransplantate (PDX) als Modellsystem herausgestellt haben, das die Überwachung der Tumorprogression in vivo ermöglicht, stellen einige Einschränkungen in Frage, wie gut der entwickelte Tumor die menschliche Krebsbiologie rekapituliert⁴. Zum Beispiel enthält Melanom TME tumorinfiltrierende Immunzellen und Stromazellen. Bei der Passage als Xenotransplantat gehen die Nicht-Krebszellen des Patienten allmählich verloren, wodurch Anpassungen vorgenommen werden können, die sich von denen in Patiententumoren unterscheiden. Während diese Einschränkungen durch begrenzte Passagen des PDX in vivo gemildert werden können, können die Unterschiede zwischen den Spezies immer noch ein Risiko für genetische Veränderungen des PDX darstellen, die von denen des nativen Tumors abweichen⁵. Darüber hinaus werden PDX-Modelle in der Regel in immungeschwächten Mäusen etabliert, um die Abstoßung von menschlichem Gewebe zu verhindern. Dies schränkt die Möglichkeiten ein, die Rolle des Immunsystems des Wirts bei Krebs zu untersuchen, insbesondere in immuntherapeutischen Studien⁶. Wir und andere haben PDXs in "humanisierte" Mäuse transplantiert ^7,8. Die Etablierung von PDX-Modellen in humanisierten Mäusen ist jedoch zeitaufwändig und teuer. Es kann mehrere Monate bis Jahre dauern, ein einzelnes PDX-Modell aus der Tumorprobe eines Patienten zu entwickeln, was die Geschwindigkeit und den Umfang der Forschung einschränkt. Trotz dieser Einschränkungen hat sich gezeigt, dass PDX-Modelle die Biologie der TME genau repräsentieren und daher unter anderem für die Entwicklung von Krebstherapeutika, personalisierter Medizin und Immuntherapie ausgiebig eingesetzt wurden⁹.

Eine alternative 3D-Kulturtechnik, die sich entwickelt hat, ist das patientenabgeleitete Organoid (PDO), bei dem ein frisch resezierter Patiententumor kultiviert wird, um Modelle zu erstellen, die die phänotypische Heterogenität, Histoarchitektur und interzelluläre Kommunikation beibehalten¹⁰. Seine Fähigkeit, nativen Tumoren sehr ähnlich zu sein, wurde bereits gezeigt, indem kultivierte Organoide aus nicht-muskelinvasivem (NMIBC) und muskelinvasivem Blasenkrebs (MIBC) erfolgreich Schlüsselaspekte der elterlichen Tumoren rekapitulierten¹¹. Aufgrund ihres Potenzials und ihrer Vorteile gegenüber anderen Modellen bieten PDOs eine Vielzahl von maßgeschneiderten Anwendungen, die anderen Modellen fehlen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Erforschung und Entwicklung von Immun-Checkpoint-Inhibitoren sowie zellulären und zielgerichteten Therapien. Zum Beispiel haben wir zuvor Melanom-Patienten-abgeleitete Organoide (MPDOs) verwendet, um die Fähigkeit von tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TILs) zu untersuchen, durch IL-2 und Anti-PD1-Antikörper (αPD-1) erweitert zu werden. Die Ergebnisse zeigten, dass die durch IL-2 und αPD-1 verstärkten TILs nicht nur eine höhere Anzahl aufwiesen, sondern auch MPDOs erfolgreich infiltrieren und Melanomzellen mit höherer Effizienz abtöten konnten als TILs, die mit anderen Methoden expandiert wurden¹². Andere Gruppen haben ähnliche Ergebnisse gezeigt, bei denen die Verwendung von Anti-PD-1 und/oder Anti-PD-L1 dazu führt, dass TILs in PDOs funktionsfähig bleiben, was in der Folge zur Tumorabtötung führt¹³. Darüber hinaus hat unsere Gruppe MPDOs auch verwendet, um die Infiltration und Abtötungsfähigkeit von γδ-T-Zellen zu beurteilen¹⁴. Die Anwendbarkeit von PDOs erstreckt sich über ein breites Spektrum von Bereichen, darunter TIL-Expansion, Zytotoxizitätsstudien und das Screening kleiner Moleküle. All diese Anwendungen unterstreichen das Potenzial und die Benutzerfreundlichkeit, die dieses Modell mit sich bringt. Daher beschreiben wir das detaillierte Protokoll für die Kultur von MPDOs.

Protokoll

Humanes Melanomgewebe wurde von Patienten gewonnen, die an der University of Pennsylvania unter Verwendung des Gewebeentnahmeprotokolls (UPCC08607) behandelt wurden, das vom Institutional Review Board der University of Pennsylvania genehmigt wurde. Alle Patienten haben eine Einverständniserklärung unterschrieben. Nach der Resektion des humanen Melanomgewebes wird das Tumorgewebe in das modifizierte Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco gelegt und bis zur Verarbeitung (innerhalb von 6 h) bei 4 °C gehalten. Melanom-Patienten-derived Organoide (MPDOs) wurden aus einem frischen Tumor gewonnen, wie in Abbildung 1 dargestellt.

1. Isolierung von Zellen aus menschlichem Melanomgewebe

1. Vorbereitungen vor Beginn des Eingriffs
   HINWEIS: Zwei Kulturmethoden (Matrigel und Kollagengel) können verwendet werden, um dissoziiertes Melanomgewebe zu kultivieren:
   1. Für die Matrigel-Methode: Bereiten Sie eine Beschichtungslösung aus Wachstumsfaktor-reduzierter (GFR) Basalmembranmatrix her, indem Sie die GFR-Basalmembranmatrix mit organoidem Kulturmedium (siehe Tabelle 1) im Verhältnis 1:2 verdünnen. Geben Sie etwa 115 μl der aufgetauten Lösung in jede der mehreren Vertiefungen einer 48-Well-Platte und lassen Sie sie 30 Minuten lang bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator erstarren.
   2. Für die Kollagen-Gel-Methode: Geben Sie 1 ml Kollagengel (siehe Tabelle 1) in eine 30 mm dicke innere Membraneinlage. Lassen Sie das Gel 30 min bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator erstarren.
2. Bereiten Sie das L-WRN konditioniertes Medium¹⁵ vor. L-WRN-konditioniertes Medium wird aus einer L-WRN-Zelllinie hergestellt, die so entwickelt wurde, dass Wnt3a, R-Spondin 3 und Noggin in einem einzigen konditionierten Medium sezerniert wird, das häufig für Zellkulturen verwendet wird.
   1. Tauen Sie ein Kryoröhrchen mit L-WRN-Zellen im 37 °C warmen Wasserbad auf. 5 ml L-Zell-Medium (siehe Tabelle 1) und die L-WRN-Zellsuspension werden in ein konisches 15-ml-Röhrchen gegeben und bei 120 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Saugen Sie den Überstand an und stellen Sie sicher, dass ~500 μl am Boden verbleiben, um das Pellet der Zellen zu resuspendieren.
   2. Übertragen Sie das Zellpellet im Überstand in 30 mL L-Zellmedium auf Eis und fügen Sie 150 μl Hygromycin (500 μg/ml) und 300 μl G418 (500 μg/ml) hinzu. Die Zellen werden mit einer Dichte von 3 × 10⁶ auf einen T-150-Kolben ausgesät und bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ bis ~90 % konfluent inkubiert.
   3. Sobald die Zellen zu ~90 % konfluiert sind, teilen Sie die Zellen in fünf T-150-Kolben auf, indem Sie sie mit 20 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen, aspirieren und mit 3 ml Trypsinersatz verdauen. Nach 5 min mit 9 mL L-Zell-Medium neutralisieren und anschließend 5 min bei 120 × g bei 4 °C zentrifugieren. Wenn ~100 % zusammenfließen, teilen Sie die fünf T-150-Kolben in 10 T-175 3-Lagen-Kolben auf.
   4. Sobald sie zusammenfließen, waschen Sie die Zellen mit 2 x 50 mL PBS und dann mit 25 mL Waschmedium (siehe Tabelle 1).
   5. 75 ml Primärkulturmedium in jeden T-175 3-Schicht-Kolben geben und 3 Tage lang bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ inkubieren (siehe Tabelle 1).
   6. Nach 3 Tagen ernten Sie das konditionierte Medium in einen konischen 50-ml-Behälter und schleudern Sie ihn 5 Minuten lang bei 4 °C bei 1.100 × g . Sammeln Sie den Überstand (konditioniertes Medium) und stellen Sie sicher, dass 5 ml zurückbleiben.
   7. Geben Sie frische 75 ml primäres Zellkulturmedium in jeden T-175 3-Schicht-Kolben und inkubieren Sie weitere 3 Tage, um zusätzliches konditioniertes Medium zu sammeln.
   8. Dem gesammelten konditionierten Medium wird das gleiche Volumen des primären Zellkulturmediums (50 % Volumen) zugesetzt und der Inhalt mit einem 0,22-μm-Filter vakuumfiltriert. Lagern Sie Aliquots in 50-ml-Röhrchen und lagern Sie sie bei -20 °C für den Langzeitgebrauch oder 4 °C für bis zu 2-3 Wochen. Verwenden Sie dieses Medium als Ergänzung zu den Organoid-Kulturmedien (siehe Tabelle 1).
      HINWEIS: Tauen Sie die Aliquoten vor der Verwendung über Nacht bei 4 °C auf.
3. Gewinnung des Zellgemischs aus frischem Melanomgewebe
   1. Waschen Sie das frisch resezierte Melanomgewebe in einer 10-ml-Petrischale mit Waschmedium. Nach der ersten Spülung überführen Sie den Tumor mit einer sterilen Pinzette in eine zweite Petrischale, um ihn weiter zu waschen, und wiederholen Sie diesen Vorgang 3x auf Eis, um die Integrität und Lebensfähigkeit des Tumors zu erhalten. Verwenden Sie während dieser Spülzyklen eine sterile Schere und eine Klinge, um überschüssiges Bindegewebe, Fett und Blutreste zu entfernen. Legen Sie den Tumor nach den drei Waschgängen in eine leere Petrischale und hacken Sie ihn mit sterilen Klingen fein auf.
      HINWEIS: Nach dem Zerkleinern sollte der Tumor eine gelartige Konsistenz aufweisen. Je feiner der Tumor zerkleinert wird, desto höher ist die Zellausbeute. Dies liegt daran, dass größere Klumpen des Tumors schwieriger zu verdauen sind und im nächsten Schritt möglicherweise nicht durch das 70 μm Nylon-Zellsieb gelangen.
   2. Nachdem das Tumorgewebe gründlich gewaschen und zerkleinert wurde, wird es in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit 10 ml des vorbereiteten Verdauungsmediums überführt (siehe Tabelle 1). Stellen Sie den Konus in ein Wasserbad bei 37 °C und achten Sie darauf, dass der Inhalt alle 5 Minuten vortext wird.
   3. Nach 25 Minuten fügen Sie 30 ml des ADMEM/F12-Mediums mit 10 % FBS hinzu, um die Verdauung zu stoppen.
      HINWEIS: Diese angegebenen Mengen sind für Tumoren mit einem Gewicht von nicht mehr als 0,2 g bestimmt.
   4. Filtrieren Sie die verdaute Zellsuspension durch ein 70 μm Nylon-Zellsieb und spülen Sie das Sieb dann mit ADMEM/F12 (1x) reduziertem Serummedium (1:1) mit 10 % FBS. Verwenden Sie nach dem Waschschritt eine Pipette, um alle verbleibenden Medien am Boden des Filters zu entfernen, um sicherzustellen, dass die höchstmögliche Anzahl von Zellen entnommen wird. Anschließend bei 300 × g 7 min bei 4 °C zentrifugieren. Der Überstand ist zu verwerfen und das Pellet in einem Organoid-Kulturmedium zu resuspendieren (siehe Tabelle 1).
   5. Kultivieren Sie die Melanom-Einzelzellsuspension entweder in Matrigel- oder Kollagen-Kultursystemen:
      1. Matrigel: Zählen Sie die Einzelzellsuspension, um sicherzustellen, dass etwa 2 × 10⁵ Zellen in die vorgewärmten Matrigel-beschichteten Vertiefungen ausgesät werden, die mit 200 μl Organoid-Kulturmedium ergänzt werden.
         HINWEIS: Matrigel-basierte Organoide werden verwendet, um die Pathophysiologie zu untersuchen, die Wirksamkeit von Arzneimitteln zu überprüfen und die Toxizität von Arzneimitteln^{zu testen 16}.
      2. Kollagengel: Zählen Sie die einzellige Suspension, um sicherzustellen, dass etwa 10⁶ Zellen mit 1 ml Kollagengel gemischt werden. Geben Sie die Mischung zu den vorverfestigten Kollagen-Gel-Membraneinsätzen und geben Sie diese in eine 6-Well-Platte. Fügen Sie genügend Organoid-Kulturmedium hinzu, um die Einsätze mit den Zellen und dem Kollagengel einzutauchen.
         HINWEIS: Kollagengel-Organoide werden verwendet, um die T-Zell-Migration zu messen und die Gewebeentwicklung^{zu untersuchen 16}.
   6. Lassen Sie die Organoide wachsen und stellen Sie sicher, dass alle 3 Tage frisches Medium hinzugefügt wird.
   7. Lassen Sie die Organoide passieren, sobald sie eine Größe von 150-200 μm erreicht haben, oder konservieren Sie sie bis zur weiteren Verwendung.
      1. Für die Passage der Organoide die Organoide in ein konisches 15 mL Format überführen und mit 1x DPSB waschen. Die Mischung bei 300 × g 7 min bei 4 °C zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und geben Sie den Trypsinersatz (50-100 μl pro Organoid) für 10 min in ein 37 °C heißes Wasserbad, wobei darauf zu achten ist, dass der Inhalt alle 3 Minuten vortexiert wird.
      2. Stoppen Sie die Verdauung mit ADMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1) Medium mit 10% FBS. Die Mischung wird 7 Minuten lang bei 300 × g zentrifugiert und in organoidem Nährmedium resuspendiert.
      3. Die Einzelzellsuspension wird in eine neue Matrigel/Kollagen-beschichtete Vertiefung mit der gleichen anfänglichen Aussaatdichte ausgesät (2 × 10⁵ Zellen in 200 μl Organoid-Kulturmedium für Matrigel-beschichtete Vertiefungen in einer 48-Well-Platte oder 10⁶ Zellen in 1 ml Organoid-Kulturmedium für kollagenbeschichtete 30 mm innere Membraneinlage).
      4. Für die Kryokonservierung werden MPDOs unter Verwendung des Trypsin-Ersatzes in Einzelzellsuspensionen verdaut, gefolgt von der Resuspension von 10⁶ Zellen in 1 ml Gefriermedium (siehe Tabelle 1).

Ergebnisse

Die Form und Größe der MPDOs wurden im Laufe der Zeit überwacht, um ihre Wachstumsdynamik zu untersuchen. Wie in Abbildung 2 zu sehen ist, nahm die Größe der Organoide während der anfänglichen Wachstumsphase während der dargestellten 7 Tage erheblich zu. Nach der Beobachtung der MPDO-Wachstumsdynamik wandte sich die Aufmerksamkeit der Bewertung der Immunzellzusammensetzung zu, um die originalgetreue Rekapitulation der Organoide zu verifizieren. Diese...

Diskussion

Das Aufkommen von PDOs hat mehrere Einschränkungen behoben, die durch andere zuvor etablierte Krebsforschungsmethoden aufgeworfen wurden, und gleichzeitig transformative potenzielle Anwendungen in diesem Bereich eingeführt. Diese Organoid-Technologie wurde ursprünglich im Jahr 2009 von Hans Clevers und Kollegen vorgeschlagen, die erfolgreich ein Darm-Organoid-Kultursystem etablieren konnten, indem sie Lgr5⁺ -Stammzellen aus dem Darm von Mäusen in einem 3D-Matrixgel kultivi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Red Cap Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial	Corning	431420
50 mL Polypropylene Conical Tube	Corning	352070
100 mm TC-treated Cell Culture Dish	Corning	353003
105 mm Polystyrene Forceps Sterile	Caplugs Evergreen	222-1121-B1I
150 cm2 Cell Culture Flask	Corning	CLS430825
A83-01	Tocris	2939
Advanced DMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1)	Gibco	12634-010
B-27 Supplement (50x)	Gibco	17504-044
Brilliant Violet 510 anti-human Perforin Antibody	BioLegend	308120
Brilliant Violet 605 anti-human Ki-67 Antibody	BioLegend	350522
Brilliant Violet 650 anti-human CD366 (Tim-3) Antibody	BioLegend	345028
Brilliant Violet 711 anti-human CD45 Antibody	BioLegend	304050
Cell Culture Inserts 0.4 µm, 30 mm Diameter	Millipore Sigma	PIHP03050
Cell Staining Buffer	BioLegend	420201
Cell Strainer 40 µm Nylon	Corning	352340
Cell Strainer 70 µm Nylon	Corning	352350
Collagenase, Type IV, powder	Gibco	17104019
Cultrex Rat Collagen I	Trevigen	3440-100-01
Culture Plate, PS, 48 wells, TC treated with lid, sterile	Max Scientific	07-6048
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM - high glucose 4.5 mg/mL	Corning	MT10-0130CV
Dnase I - Grade II	Millipore Sigma	10104159001
DPBS, 1%	Corning	21-031-CV
Fetal Bovine Serum, FBS	Corning	MT35-010-CV
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I	BD Biosciences	556547
Forskolin	Tocris	1099
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)	ThermoFisher	10131035
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher	35050061
Ham's F12 Nutrient Mix	ThermoFisher	11765054
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Hygromycin B (50 mg/mL)	ThermoFisher	10687010
L-Glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-081
L-WRN cell	ATCC	CRL-3276
Matrigel Phenol Free & Growth Fact. Reduced	Corning	356231
Millex PVDF syringe filter, 0.22 μM	Millipore Sigma	SLGVR33RB
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-100G
Nunc TripleFlask Treated Cell Culture Flask	ThermoFisher	132867
PE/Cyanine5 anti-human CD8a Antibody	BioLegend	301010
PE-Cy 7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)	BD Biosciences	561272
Pen Strep	Gibco	15140-122
Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15-1MG
Recombinant Human FGF-acidic	Peprotech	100-17A
Sodium Bicarbonate Solution (NaHCO3) (7.5%)	Quality Biological	118-085-721
Stainless Steel Surgical Blades no. 22	Integra	4-322
TrypLE Express	Gibco	12604-021