Melanom Hasta Kaynaklı Organoid Modellerle Terapötik Fırsatların Ortaya Çıkarılması

Özet

Burada, taze melanom dokularından ayrışmış hücre süspansiyonlarını kültürleyerek melanom hastadan türetilmiş organoidler oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Bu organoidler, hastaya özgü tümörleri in vitro olarak aslına uygun olarak özetleyerek, tümör immünosupresif mekanizmalarını, ilaç taramasını, ilaç direnç mekanizmalarını ve kanser sürveyans yaklaşımlarını keşfetmek için yenilikçi bir yaklaşım sunar.

Özet

İmmünoterapinin gelişmesiyle birlikte, doğal tümörlerin tümör mikroçevresini özetleyebilecek modellerin geliştirilmesine devam eden bir ihtiyaç vardır. Geleneksel iki ve üç boyutlu modeller, kanser gelişimi ve ilerlemesi hakkında fikir verebilirken, bunlar, doğal tümörlerin sadık bir taklidini engelleyen önemli yönlerden yoksundur. Çok dikkat çeken alternatif bir model, hastadan türetilen organoiddir. Bu organoidlerin gelişimi, karmaşık hücreler arası iletişimi, tümör mikroçevresini ve tümörlerin histomimarisini özetler. Bu makale, melanom hastadan türetilmiş organoid (MPDO) modellerin oluşturulmasına yönelik protokolü açıklamaktadır. Bu modelleri doğrulamak için, organoidlerin hücresel heterojenliğini doğrulamak için T hücresi aktivasyon belirteçlerinin ekspresyon seviyeleri de dahil olmak üzere bağışıklık hücresi bileşimini değerlendirdik. Ek olarak, MPDO'ların hücresel tedavilerdeki potansiyel faydasını tanımlamak için, organoidlerin γδ T hücreleri ile tedavi edilmesinin sitotoksik yeteneklerini değerlendirdik. Sonuç olarak, MPDO modelleri, tümör karmaşıklığını anlamak, terapötik stratejileri doğrulamak ve potansiyel olarak kişiselleştirilmiş tedaviyi ilerletmek için umut verici yollar sunmaktadır.

Giriş

Konvansiyonel 2 boyutlu hücre kültürü modelleri, kanserin ilerlemesini ve tedavisini incelemek için kanser araştırmalarında temel araçlardır¹. Bu modeller, kanser gelişimi ve ilerlemesinin altında yatan moleküler ve hücresel mekanizmaları araştırmak için kontrollü deneysel koşullara izin vermekle kalmaz, aynı zamanda uygun maliyetli ve nispeten hızlı deneysel sonuçlar sağlar. Bununla birlikte, mono-kültür modellerinin eş düzlemli bir doğasında özetlenemeyen tümör mikroçevresindeki (TME) sınırlı hücresel çeşitlilik nedeniyle kullanımları sınırlıdır². Ek olarak, hücre kültürü modelleri ins....

Protokol

İnsan melanom dokuları, Pennsylvania Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanan doku toplama protokolü (UPCC08607) kullanılarak Pennsylvania Üniversitesi'nde tedavi gören hastalardan elde edildi. Tüm hastalar bilgilendirilmiş onam imzalamıştır. İnsan melanom dokularının rezeksiyonunu takiben, tümör dokusu Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamına (DMEM) yerleştirilir ve işlenene kadar (6 saat içinde) 4 ° C'de tutulur. Melanom hasta kaynaklı organoidler (MPDO'lar), Şekil 1'de gösterildiği gibi taze bir tümörden türetilmiştir.

1. İnsan melanom dokusundan hücrele....

Tartışmalar

PDO'ların ortaya çıkışı, daha önce kurulmuş diğer kanser araştırma yöntemlerinin ortaya çıkardığı çoklu sınırlamaları ele alırken, bu alanda dönüştürücü potansiyel uygulamaları tanıtmıştır. Bu organoid teknolojisi ilk olarak 2009 yılında, farelerin bağırsağından türetilen Lgr5 ⁺ kök hücrelerini, R-sponsin, EGF ve Noggin faktörleri²⁰ içeren bir 3D matris jelinde kültürleyerek başarılı bir şekilde bir bağ.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Red Cap Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial	Corning	431420
50 mL Polypropylene Conical Tube	Corning	352070
100 mm TC-treated Cell Culture Dish	Corning	353003
105 mm Polystyrene Forceps Sterile	Caplugs Evergreen	222-1121-B1I
150 cm2 Cell Culture Flask	Corning	CLS430825
A83-01	Tocris	2939
Advanced DMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1)	Gibco	12634-010
B-27 Supplement (50x)	Gibco	17504-044
Brilliant Violet 510 anti-human Perforin Antibody	BioLegend	308120
Brilliant Violet 605 anti-human Ki-67 Antibody	BioLegend	350522
Brilliant Violet 650 anti-human CD366 (Tim-3) Antibody	BioLegend	345028
Brilliant Violet 711 anti-human CD45 Antibody	BioLegend	304050
Cell Culture Inserts 0.4 µm, 30 mm Diameter	Millipore Sigma	PIHP03050
Cell Staining Buffer	BioLegend	420201
Cell Strainer 40 µm Nylon	Corning	352340
Cell Strainer 70 µm Nylon	Corning	352350
Collagenase, Type IV, powder	Gibco	17104019
Cultrex Rat Collagen I	Trevigen	3440-100-01
Culture Plate, PS, 48 wells, TC treated with lid, sterile	Max Scientific	07-6048
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM - high glucose 4.5 mg/mL	Corning	MT10-0130CV
Dnase I - Grade II	Millipore Sigma	10104159001
DPBS, 1%	Corning	21-031-CV
Fetal Bovine Serum, FBS	Corning	MT35-010-CV
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I	BD Biosciences	556547
Forskolin	Tocris	1099
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)	ThermoFisher	10131035
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher	35050061
Ham's F12 Nutrient Mix	ThermoFisher	11765054
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Hygromycin B (50 mg/mL)	ThermoFisher	10687010
L-Glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-081
L-WRN cell	ATCC	CRL-3276
Matrigel Phenol Free & Growth Fact. Reduced	Corning	356231
Millex PVDF syringe filter, 0.22 μM	Millipore Sigma	SLGVR33RB
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-100G
Nunc TripleFlask Treated Cell Culture Flask	ThermoFisher	132867
PE/Cyanine5 anti-human CD8a Antibody	BioLegend	301010
PE-Cy 7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)	BD Biosciences	561272
Pen Strep	Gibco	15140-122
Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15-1MG
Recombinant Human FGF-acidic	Peprotech	100-17A
Sodium Bicarbonate Solution (NaHCO3) (7.5%)	Quality Biological	118-085-721
Stainless Steel Surgical Blades no. 22	Integra	4-322
TrypLE Express	Gibco	12604-021