Dévoilement des opportunités thérapeutiques avec des modèles organoïdes dérivés de patients atteints de mélanome

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour générer des organoïdes dérivés de patients atteints de mélanome en cultivant des suspensions cellulaires dissociées à partir de tissus de mélanome frais. Ces organoïdes récapitulent fidèlement les tumeurs spécifiques aux patients in vitro, offrant une approche innovante pour explorer les mécanismes immunosuppresseurs tumoraux, le dépistage des médicaments, les mécanismes de résistance aux médicaments et les approches de surveillance du cancer.

Résumé

Avec le développement de l’immunothérapie, il est nécessaire de développer des modèles capables de récapituler le microenvironnement tumoral des tumeurs natives. Alors que les modèles bidimensionnels et tridimensionnels traditionnels peuvent offrir des informations sur le développement et la progression du cancer, ceux-ci manquent d’aspects cruciaux qui entravent une imitation fidèle des tumeurs natives. Un modèle alternatif qui a suscité beaucoup d’attention est l’organoïde dérivé du patient. Le développement de ces organoïdes récapitule la communication intercellulaire complexe, le microenvironnement tumoral et l’histoarchitecture des tumeurs. Cet article décrit le protocole d’établissement de modèles d’organoïdes dérivés de patients atteints de mélanome (MPDO). Pour valider ces modèles, nous avons évalué la composition des cellules immunitaires, y compris les niveaux d’expression des marqueurs d’activation des lymphocytes T, afin de confirmer l’hétérogénéité cellulaire des organoïdes. De plus, pour décrire l’utilité potentielle des MPDO dans les thérapies cellulaires, nous avons évalué les capacités cytotoxiques du traitement des organoïdes avec des lymphocytes T γδ. En conclusion, les modèles MPDO offrent des pistes prometteuses pour comprendre la complexité tumorale, valider les stratégies thérapeutiques et potentiellement faire progresser le traitement personnalisé.

Introduction

Les modèles de culture cellulaire 2D conventionnels sont des outils essentiels dans la recherche sur le cancer pour étudier la progression et le traitement du cancer¹. Ces modèles permettent non seulement d’établir des conditions expérimentales contrôlées pour étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents au développement et à la progression du cancer, mais fournissent également des résultats expérimentaux rentables et relativement rapides. Leur utilisation est toutefois limitée en raison de la diversité cellulaire limitée dans le microenvironnement tumoral (TME), qui ne peut pas être récapitu....

Protocole

Des tissus de mélanome humain ont été obtenus chez des patients recevant un traitement à l’Université de Pennsylvanie en utilisant le protocole de collecte de tissus (UPCC08607) approuvé par le Conseil d’examen institutionnel de l’Université de Pennsylvanie. Tous les patients ont signé un consentement éclairé. Après la résection des tissus de mélanome humain, le tissu tumoral est placé dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) et maintenu à 4 °C jusqu’au traitement (dans les 6 heures). Les organoïdes dérivés de patients atteints de mélanome (MPDO) ont été dérivés d’une tumeur récente, comme illustré à la fig....

Discussion

L’émergence des AOP a permis de remédier à de multiples limites posées par d’autres méthodes de recherche sur le cancer précédemment établies, tout en introduisant des applications potentielles transformatrices dans le domaine. Cette technologie d’organoïde a été initialement proposée en 2009 par Hans Clevers et ses collègues, qui ont réussi à établir un système de culture d’organoïdes intestinaux en cultivant des cellules souches ^Lgr5+ dérivées de .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Red Cap Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial	Corning	431420
50 mL Polypropylene Conical Tube	Corning	352070
100 mm TC-treated Cell Culture Dish	Corning	353003
105 mm Polystyrene Forceps Sterile	Caplugs Evergreen	222-1121-B1I
150 cm2 Cell Culture Flask	Corning	CLS430825
A83-01	Tocris	2939
Advanced DMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1)	Gibco	12634-010
B-27 Supplement (50x)	Gibco	17504-044
Brilliant Violet 510 anti-human Perforin Antibody	BioLegend	308120
Brilliant Violet 605 anti-human Ki-67 Antibody	BioLegend	350522
Brilliant Violet 650 anti-human CD366 (Tim-3) Antibody	BioLegend	345028
Brilliant Violet 711 anti-human CD45 Antibody	BioLegend	304050
Cell Culture Inserts 0.4 µm, 30 mm Diameter	Millipore Sigma	PIHP03050
Cell Staining Buffer	BioLegend	420201
Cell Strainer 40 µm Nylon	Corning	352340
Cell Strainer 70 µm Nylon	Corning	352350
Collagenase, Type IV, powder	Gibco	17104019
Cultrex Rat Collagen I	Trevigen	3440-100-01
Culture Plate, PS, 48 wells, TC treated with lid, sterile	Max Scientific	07-6048
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM - high glucose 4.5 mg/mL	Corning	MT10-0130CV
Dnase I - Grade II	Millipore Sigma	10104159001
DPBS, 1%	Corning	21-031-CV
Fetal Bovine Serum, FBS	Corning	MT35-010-CV
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I	BD Biosciences	556547
Forskolin	Tocris	1099
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)	ThermoFisher	10131035
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher	35050061
Ham's F12 Nutrient Mix	ThermoFisher	11765054
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Hygromycin B (50 mg/mL)	ThermoFisher	10687010
L-Glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-081
L-WRN cell	ATCC	CRL-3276
Matrigel Phenol Free & Growth Fact. Reduced	Corning	356231
Millex PVDF syringe filter, 0.22 μM	Millipore Sigma	SLGVR33RB
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-100G
Nunc TripleFlask Treated Cell Culture Flask	ThermoFisher	132867
PE/Cyanine5 anti-human CD8a Antibody	BioLegend	301010
PE-Cy 7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)	BD Biosciences	561272
Pen Strep	Gibco	15140-122
Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15-1MG
Recombinant Human FGF-acidic	Peprotech	100-17A
Sodium Bicarbonate Solution (NaHCO3) (7.5%)	Quality Biological	118-085-721
Stainless Steel Surgical Blades no. 22	Integra	4-322
TrypLE Express	Gibco	12604-021