Dévoilement des opportunités thérapeutiques avec des modèles organoïdes dérivés de patients atteints de mélanome

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour générer des organoïdes dérivés de patients atteints de mélanome en cultivant des suspensions cellulaires dissociées à partir de tissus de mélanome frais. Ces organoïdes récapitulent fidèlement les tumeurs spécifiques aux patients in vitro, offrant une approche innovante pour explorer les mécanismes immunosuppresseurs tumoraux, le dépistage des médicaments, les mécanismes de résistance aux médicaments et les approches de surveillance du cancer.

Résumé

Avec le développement de l’immunothérapie, il est nécessaire de développer des modèles capables de récapituler le microenvironnement tumoral des tumeurs natives. Alors que les modèles bidimensionnels et tridimensionnels traditionnels peuvent offrir des informations sur le développement et la progression du cancer, ceux-ci manquent d’aspects cruciaux qui entravent une imitation fidèle des tumeurs natives. Un modèle alternatif qui a suscité beaucoup d’attention est l’organoïde dérivé du patient. Le développement de ces organoïdes récapitule la communication intercellulaire complexe, le microenvironnement tumoral et l’histoarchitecture des tumeurs. Cet article décrit le protocole d’établissement de modèles d’organoïdes dérivés de patients atteints de mélanome (MPDO). Pour valider ces modèles, nous avons évalué la composition des cellules immunitaires, y compris les niveaux d’expression des marqueurs d’activation des lymphocytes T, afin de confirmer l’hétérogénéité cellulaire des organoïdes. De plus, pour décrire l’utilité potentielle des MPDO dans les thérapies cellulaires, nous avons évalué les capacités cytotoxiques du traitement des organoïdes avec des lymphocytes T γδ. En conclusion, les modèles MPDO offrent des pistes prometteuses pour comprendre la complexité tumorale, valider les stratégies thérapeutiques et potentiellement faire progresser le traitement personnalisé.

Introduction

Les modèles de culture cellulaire 2D conventionnels sont des outils essentiels dans la recherche sur le cancer pour étudier la progression et le traitement du cancer¹. Ces modèles permettent non seulement d’établir des conditions expérimentales contrôlées pour étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents au développement et à la progression du cancer, mais fournissent également des résultats expérimentaux rentables et relativement rapides. Leur utilisation est toutefois limitée en raison de la diversité cellulaire limitée dans le microenvironnement tumoral (TME), qui ne peut pas être récapitulée dans une nature coplanaire des modèles de monoculture². De plus, les modèles de culture cellulaire offrent un environnement trop simplifié par rapport au corps humain³. Ainsi, pour mieux comprendre la progression du cancer et développer des traitements efficaces, les chercheurs se sont tournés vers des modèles innovants qui visent à récapituler de près l’EUT dans la nature. Par conséquent, le maintien de la fidélité aux tumeurs natives est primordial dans ces modèles. Étant donné la nature complexe du cancer, tout écart significatif par rapport à la tumeur d’origine pourrait introduire des variables imprévues qui pourraient confondre des conclusions significatives sur le comportement de la tumeur.

Alors que les xénogreffes dérivées de patients (PDX) sont apparues comme un système modèle permettant de surveiller la progression tumorale in vivo, certaines limites remettent en question la capacité de la tumeur développée à récapituler la biologie du cancer humain⁴. Par exemple, le mélanome TME contient des cellules immunitaires infiltrant la tumeur et des cellules stromales. Lorsqu’elles sont passées sous forme de xénogreffe, les cellules non cancéreuses du patient seront progressivement perdues, ce qui peut sélectionner des adaptations différentes de celles des tumeurs du patient. Bien que ces limitations puissent être atténuées en effectuant des passages limités de la PDX in vivo, les différences entre les espèces peuvent toujours présenter un risque de modifications génétiques de la PDX qui s’écartent de celle de la tumeur native⁵. De plus, les modèles PDX sont généralement établis chez les souris immunodéprimées pour empêcher le rejet des tissus humains. Cela limite la capacité d’étudier le rôle du système immunitaire de l’hôte dans le cancer, en particulier dans les études immunothérapeutiques⁶. Nous et d’autres avons greffé des PDX dans des souris « humanisées » ^7,8. Cependant, l’établissement de modèles PDX chez des souris humanisées prend du temps et coûte cher. Le développement d’un seul modèle PDX à partir d’un échantillon de tumeur d’un patient peut prendre plusieurs mois, voire plusieurs années, ce qui limite la vitesse et l’ampleur de la recherche. Malgré ces limites, il a été démontré que les modèles PDX représentent avec précision la biologie de l’EUT, ayant ainsi été largement utilisés pour le développement de thérapies contre le cancer, la médecine personnalisée et l’immunothérapie, entre autres⁹.

Une technique de culture 3D alternative qui a émergé est l’organoïde dérivé du patient (PDO), où une tumeur de patient fraîchement réséquée est cultivée pour créer des modèles qui maintiennent l’hétérogénéité phénotypique, l’histoarchitecture et les communications intercellulaires¹⁰. Sa capacité à ressembler étroitement aux tumeurs natives a déjà été démontrée lorsque des organoïdes cultivés de cancer de la vessie non invasif sur le plan musculaire (NMIBC) et invasif sur le plan musculaire (MIBC) ont réussi à récapituler des aspects clés des tumeurs parentales¹¹. En raison de leur potentiel et de leurs avantages par rapport à d’autres modèles, les AOP offrent une grande variété d’applications sur mesure qui font défaut aux autres modèles, y compris, mais sans s’y limiter, l’étude et le développement d’inhibiteurs de points de contrôle immunitaires ainsi que des thérapies cellulaires et ciblées. Par exemple, nous avons précédemment utilisé des organoïdes dérivés de patients atteints de mélanome (MPDO) pour étudier la capacité des lymphocytes infiltrant la tumeur (TIL) à être élargis par l’IL-2 et les anticorps anti-PD1 (αPD-1). Les résultats ont montré que les TIL développés par l’IL-2 et l’αPD-1 avaient non seulement un nombre plus élevé, mais pouvaient également infiltrer avec succès les MPDO et tuer les cellules de mélanome avec une efficacité plus élevée que les TIL développés à l’aide d’autres méthodes¹². D’autres groupes ont montré des résultats similaires où l’utilisation d’anti--1 et/ou d’anti--L1 conduit à ce que les TIL restent fonctionnels dans les HO, ce qui conduit ensuite à la destruction de tumeurs¹³. De plus, notre groupe a également utilisé les MPDO pour évaluer l’infiltration et la capacité de destruction des lymphocytes T^{γδ 14}. L’applicabilité des AOP couvre un large éventail de domaines, notamment l’expansion des TIL, les études de cytotoxicité et le criblage de petites molécules. Toutes ces applications mettent en évidence le potentiel et la facilité d’utilisation que confère ce modèle. À ce titre, nous décrivons le protocole détaillé pour la culture des MPDO.

Protocole

Des tissus de mélanome humain ont été obtenus chez des patients recevant un traitement à l’Université de Pennsylvanie en utilisant le protocole de collecte de tissus (UPCC08607) approuvé par le Conseil d’examen institutionnel de l’Université de Pennsylvanie. Tous les patients ont signé un consentement éclairé. Après la résection des tissus de mélanome humain, le tissu tumoral est placé dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) et maintenu à 4 °C jusqu’au traitement (dans les 6 heures). Les organoïdes dérivés de patients atteints de mélanome (MPDO) ont été dérivés d’une tumeur récente, comme illustré à la figure 1.

1. Isolement de cellules à partir de tissu de mélanome humain

1. Préparatifs avant le début de l’intervention
   REMARQUE : Deux méthodes de culture (Matrigel et gel de collagène) peuvent être utilisées pour cultiver du tissu de mélanome dissocié :
   1. Pour la méthode Matrigel : Préparez une solution d’enrobage de la matrice de membrane basale à facteur de croissance réduit (DFG) en diluant la matrice de la membrane basale DFG avec un milieu de culture organoïde (voir le tableau 1) dans un rapport de 1:2. Ajouter environ 115 μL de la solution décongelée dans chacun des nombreux puits d’une plaque de 48 puits et laisser se solidifier pendant 30 minutes à 37 °C dans un incubateur humidifié.
   2. Pour la méthode du gel de collagène : Ajouter 1 mL de gel de collagène (voir tableau 1) dans un insert de membrane intérieure de 30 mm. Laisser le gel se solidifier pendant 30 min à 37 °C dans un incubateur humidifié.
2. Préparez le milieu conditionné L-WRN¹⁵. Le milieu conditionné L-WRN est produit à partir d’une lignée cellulaire L-WRN conçue pour sécréter Wnt3a, R-spondine 3 et Noggin dans un seul milieu conditionné largement utilisé pour la culture cellulaire.
   1. Décongeler un cryotube de cellules L-WRN dans le bain-marie à 37 °C. Ajouter 5 mL de milieu à cellules L (voir le tableau 1) et la suspension de cellules L-WRN dans un tube conique de 15 mL, et centrifuger à 120 × g pendant 5 min à 4 °C. Aspirez le surnageant, en veillant à ce que ~500 μL soient laissés au fond pour remettre en suspension la pastille des cellules.
   2. Transvaser la pastille de cellules dans le surnageant dans 30 mL de milieu cellulaire L sur de la glace et ajouter 150 μL d’hygromycine (500 μg/mL) et 300 μL de G418 (500 μg/mL). Ensemencer les cellules à une densité de 3 × 10⁶ sur une fiole T-150 et incuber à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO₂ jusqu’à ~90% de confluent.
   3. Une fois que les cellules sont confluentes à ~90 %, divisez les cellules en cinq flacons T-150 en les lavant avec 20 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), en aspirant et en digérant avec 3 ml de substitut de trypsine. Après 5 min, neutraliser avec 9 mL de milieu à cellules L suivi d’une centrifugation pendant 5 min à 120 × g à 4 °C. Lorsqu’ils sont à ~100% confluents, divisez les cinq flacons T-150 en 10 flacons T-175 à 3 couches.
   4. Une fois confluentes, laver les cellules avec 2 x 50 mL de PBS, puis avec 25 mL de produit de lavage (voir le tableau 1).
   5. Ajouter 75 mL de milieu de culture primaire dans chaque fiole T-175 à 3 couches et incuber pendant 3 jours à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO₂ (voir le tableau 1).
   6. Après 3 jours, récoltez le milieu conditionné en un cône de 50 ml et essorez-le à 1 100 × g pendant 5 minutes à 4 °C. Prélever le surnageant (milieu conditionné) en veillant à ce qu’il en reste 5 ml.
   7. Ajouter 75 mL de milieu de culture cellulaire primaire frais dans chaque fiole T-175 à 3 couches et incuber pendant 3 jours supplémentaires pour recueillir du milieu conditionné supplémentaire.
   8. Au milieu conditionné collecté, ajoutez un volume égal de milieu de culture cellulaire primaire (50 % du volume) et filtrez le contenu sous vide à l’aide d’un filtre de 0,22 μm. Conservez les aliquotes dans des tubes de 50 mL et à -20 °C pour une utilisation à long terme ou à 4 °C jusqu’à 2-3 semaines. Utilisez ce milieu pour compléter le milieu de culture organoïde (voir le tableau 1).
      REMARQUE : Décongeler les aliquotes à 4 °C pendant la nuit avant utilisation.
3. Récolte du mélange cellulaire à partir de tissu de mélanome frais
   1. Lavez le tissu de mélanome fraîchement réséqué dans une boîte de Pétri de 10 ml contenant du produit de lavage. Après le premier rinçage, utilisez une pince à épiler stérile pour transférer la tumeur dans une deuxième boîte de Pétri pour un lavage ultérieur et répétez ce processus 3 fois sur de la glace pour préserver l’intégrité et la viabilité de la tumeur. Tout au long de ces cycles de rinçage, utilisez des ciseaux stériles et une lame pour éliminer l’excès de tissu conjonctif, la graisse et le sang résiduel. Après les trois lavages, placez la tumeur dans une boîte de Pétri vide et utilisez des lames stériles pour la hacher finement.
      REMARQUE : Après le hachage, la tumeur doit présenter une consistance semblable à celle d’un gel. Plus le hachage de la tumeur est fin, plus le rendement cellulaire sera élevé. En effet, les amas plus gros de la tumeur seront plus difficiles à digérer et peuvent ne pas passer à travers la crépine de cellules en nylon de 70 μm lors de l’étape suivante.
   2. Une fois que le tissu tumoral a été soigneusement lavé et haché, transférez-le dans un tube conique de 50 ml contenant 10 ml du milieu de digestion préparé (voir tableau 1). Placez le cône dans un bain-marie à 37 °C, en veillant à ce que le contenu soit tourbillonné toutes les 5 minutes.
   3. Après 25 min, ajouter 30 mL de milieu ADMEM/F12 contenant 10 % de FBS pour arrêter la digestion.
      REMARQUE : Ces quantités spécifiées sont destinées aux tumeurs ne pesant pas plus de 0,2 g.
   4. Filtrez la suspension cellulaire digérée à travers une passoire cellulaire en nylon de 70 μm, puis rincez la crépine avec un milieu sérique réduit ADMEM/F12 (1x) (1:1) contenant 10 % de FBS. Après l’étape de lavage, à l’aide d’une pipette, récupérez tout média restant au bas du filtre afin de vous assurer que le plus grand nombre possible de cellules est récupéré. Ensuite, centrifuger à 300 × g pendant 7 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans un milieu de culture organoïde (voir tableau 1).
   5. Cultivez la suspension unicellulaire de mélanome dans des systèmes de culture Matrigel ou de collagène :
      1. Matrigel : Compter la suspension unicellulaire pour s’assurer qu’environ 2 × 10⁵ cellules sont ensemencées dans les puits préchauffés enrobés de Matrigel, complétés par 200 μL de milieu de culture organoïde.
         REMARQUE : Les organoïdes à base de matrigel sont utilisés pour étudier la physiopathologie, dépister l’efficacité des médicaments et tester la toxicité des médicaments¹⁶.
      2. Gel de collagène : Comptez la suspension unicellulaire pour vous assurer qu’environ 10⁶ cellules sont mélangées à 1 ml de gel de collagène. Ajoutez le mélange aux inserts de membrane de gel de collagène pré-solidifiés et placez-les dans une plaque à 6 puits. Ajoutez suffisamment de milieu de culture organoïde pour immerger les inserts contenant les cellules et le gel de collagène.
         REMARQUE : Les organoïdes en gel de collagène sont utilisés pour mesurer la migration des lymphocytes T et étudier le développement des tissus¹⁶.
   6. Laissez les organoïdes pousser tout en veillant à ce que du milieu frais soit ajouté tous les 3 jours.
   7. Passez les organoïdes une fois qu’ils atteignent une taille de 150 à 200 μm ou cryoconservez-les jusqu’à nouvel ordre.
      1. Pour le passage des organoïdes, transvaser les organoïdes dans un cône de 15 mL et laver avec 1x DPSB. Centrifuger le mélange à 300 × g pendant 7 min à 4 °C. Retirer le surnageant et ajouter le substitut de trypsine (50-100 μL par organoïde) pendant 10 min dans un bain-marie à 37 °C, en veillant à ce que le contenu soit tourbillonné toutes les 3 min.
      2. Arrêtez la digestion à l’aide du milieu sérique réduit ADMEM/F12 (1x) (1:1) contenant 10% de FBS. Centrifuger le mélange à 300 × g pendant 7 min et le remettre en suspension dans un milieu de culture organoïde.
      3. Ensemencer la suspension unicellulaire dans un nouveau puits enrobé de Matrigel/collagène à la même densité d’ensemencement initiale (2 × 10⁵ cellules dans 200 μL de milieu de culture organoïde pour les puits enrobés de Matrigel dans une plaque de 48 puits ou 10^{6 cellules} dans 1 mL de milieu de culture organoïde pour insert de membrane intérieure de 30 mm recouvert de collagène).
      4. Pour la cryoconservation, digérer les MPDO à l’aide du substitut de trypsine dans des suspensions unicellulaires, puis remettre en suspension 10 à⁶ cellules dans 1 mL de milieu de congélation (voir le tableau 1).

Résultats

La forme et la taille des ODPM ont été surveillées au fil du temps afin d’étudier leur dynamique de croissance. Comme le montre la figure 2, au cours de la période de croissance initiale, la taille de l’organoïde a considérablement augmenté tout au long des 7 jours représentés. Suite à l’observation de la dynamique de croissance du MPDO, l’attention s’est portée sur l’évaluation de la composition des cellules immunitaires afin de vé...

Discussion

L’émergence des AOP a permis de remédier à de multiples limites posées par d’autres méthodes de recherche sur le cancer précédemment établies, tout en introduisant des applications potentielles transformatrices dans le domaine. Cette technologie d’organoïde a été initialement proposée en 2009 par Hans Clevers et ses collègues, qui ont réussi à établir un système de culture d’organoïdes intestinaux en cultivant des cellules souches ^Lgr5+ dérivées de ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Red Cap Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial	Corning	431420
50 mL Polypropylene Conical Tube	Corning	352070
100 mm TC-treated Cell Culture Dish	Corning	353003
105 mm Polystyrene Forceps Sterile	Caplugs Evergreen	222-1121-B1I
150 cm2 Cell Culture Flask	Corning	CLS430825
A83-01	Tocris	2939
Advanced DMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1)	Gibco	12634-010
B-27 Supplement (50x)	Gibco	17504-044
Brilliant Violet 510 anti-human Perforin Antibody	BioLegend	308120
Brilliant Violet 605 anti-human Ki-67 Antibody	BioLegend	350522
Brilliant Violet 650 anti-human CD366 (Tim-3) Antibody	BioLegend	345028
Brilliant Violet 711 anti-human CD45 Antibody	BioLegend	304050
Cell Culture Inserts 0.4 µm, 30 mm Diameter	Millipore Sigma	PIHP03050
Cell Staining Buffer	BioLegend	420201
Cell Strainer 40 µm Nylon	Corning	352340
Cell Strainer 70 µm Nylon	Corning	352350
Collagenase, Type IV, powder	Gibco	17104019
Cultrex Rat Collagen I	Trevigen	3440-100-01
Culture Plate, PS, 48 wells, TC treated with lid, sterile	Max Scientific	07-6048
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM - high glucose 4.5 mg/mL	Corning	MT10-0130CV
Dnase I - Grade II	Millipore Sigma	10104159001
DPBS, 1%	Corning	21-031-CV
Fetal Bovine Serum, FBS	Corning	MT35-010-CV
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I	BD Biosciences	556547
Forskolin	Tocris	1099
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)	ThermoFisher	10131035
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher	35050061
Ham's F12 Nutrient Mix	ThermoFisher	11765054
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Hygromycin B (50 mg/mL)	ThermoFisher	10687010
L-Glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-081
L-WRN cell	ATCC	CRL-3276
Matrigel Phenol Free & Growth Fact. Reduced	Corning	356231
Millex PVDF syringe filter, 0.22 μM	Millipore Sigma	SLGVR33RB
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-100G
Nunc TripleFlask Treated Cell Culture Flask	ThermoFisher	132867
PE/Cyanine5 anti-human CD8a Antibody	BioLegend	301010
PE-Cy 7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)	BD Biosciences	561272
Pen Strep	Gibco	15140-122
Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15-1MG
Recombinant Human FGF-acidic	Peprotech	100-17A
Sodium Bicarbonate Solution (NaHCO3) (7.5%)	Quality Biological	118-085-721
Stainless Steel Surgical Blades no. 22	Integra	4-322
TrypLE Express	Gibco	12604-021