Revelando oportunidades terapêuticas com modelos organoides derivados de pacientes com melanoma

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar organoides derivados de pacientes com melanoma por meio da cultura de suspensões de células dissociadas de tecidos frescos de melanoma. Esses organoides recapitulam fielmente tumores específicos do paciente in vitro, oferecendo uma abordagem inovadora para explorar mecanismos imunossupressores tumorais, triagem de drogas, mecanismos de resistência a drogas e abordagens de vigilância do câncer.

Resumo

Com o desenvolvimento da imunoterapia, há uma necessidade contínua de desenvolver modelos que possam recapitular o microambiente tumoral de tumores nativos. Embora os modelos bidimensionais e tridimensionais tradicionais possam oferecer insights sobre o desenvolvimento e a progressão do câncer, eles carecem de aspectos cruciais que impeçam uma imitação fiel dos tumores nativos. Um modelo alternativo que ganhou muita atenção é o organoide derivado do paciente. O desenvolvimento desses organoides recapitula a complexa comunicação intercelular, o microambiente tumoral e a histoarquitetura dos tumores. Este artigo descreve o protocolo para estabelecer modelos de organoides derivados de pacientes com melanoma (MPDO). Para validar esses modelos, avaliamos a composição das células imunes, incluindo os níveis de expressão de marcadores de ativação de células T, para confirmar a heterogeneidade celular dos organoides. Além disso, para descrever a utilidade potencial dos MPDOs em terapias celulares, avaliamos as capacidades citotóxicas do tratamento dos organoides com células T γδ. Em conclusão, os modelos MPDO oferecem caminhos promissores para entender a complexidade do tumor, validar estratégias terapêuticas e potencialmente avançar no tratamento personalizado.

Introdução

Modelos convencionais de cultura de células 2-D são ferramentas essenciais na pesquisa do câncer para estudar a progressão e a terapia do câncer¹. Esses modelos não apenas permitem condições experimentais controladas para investigar os mecanismos moleculares e celulares subjacentes ao desenvolvimento e progressão do câncer, mas também fornecem resultados experimentais econômicos e relativamente rápidos. Seu uso, no entanto, é restrito devido à limitada diversidade celular no microambiente tumoral (TME), que não pode ser recapitulada em uma natureza coplanar de modelos de monocultura². Além disso, os modelos de cultura de células oferecem um ambiente simplificado em comparação com o corpo humano³. Assim, para entender melhor a progressão do câncer e desenvolver tratamentos eficazes, os pesquisadores recorreram a modelos inovadores que visam recapitular o TME na natureza de perto. Consequentemente, manter a fidelidade aos tumores nativos é fundamental nesses modelos. Dada a natureza intrincada do câncer, qualquer desvio significativo do tumor original pode introduzir variáveis imprevistas que podem confundir conclusões significativas sobre o comportamento do tumor.

Embora os xenoenxertos derivados de pacientes (PDX) tenham surgido como um sistema modelo que permite o monitoramento da progressão do tumor in vivo, algumas limitações questionam o quão bem o tumor desenvolvido recapitula a biologia do câncer humano⁴. Por exemplo, o melanoma TME contém células imunes infiltrantes de tumor e células estromais. Quando passadas como xenoenxerto, as células não cancerígenas do paciente serão gradualmente perdidas, o que pode selecionar adaptações diferentes daquelas nos tumores do paciente. Embora essas limitações possam ser mitigadas pela realização de passagens limitadas do PDX in vivo, as diferenças entre as espécies ainda podem representar um risco de alterações genéticas no PDX que se desviam do tumor nativo⁵. Além disso, os modelos PDX são normalmente estabelecidos em camundongos imunocomprometidos para evitar a rejeição de tecidos humanos. Isso limita a capacidade de estudar o papel do sistema imunológico do hospedeiro no câncer, especialmente em estudos imunoterapêuticos⁶. Nós e outros enxertamos PDXs em camundongos "humanizados" ^7,8. No entanto, estabelecer modelos PDX em camundongos humanizados é demorado e caro. Pode levar de vários meses a anos para desenvolver um único modelo PDX a partir da amostra de tumor de um paciente, limitando assim a velocidade e a escala da pesquisa. Apesar dessas limitações, os modelos PDX demonstraram representar com precisão a biologia do TME, tendo sido amplamente utilizados para o desenvolvimento de terapias contra o câncer, medicina personalizada e imunoterapia, entre outros⁹.

Uma técnica alternativa de cultura 3D que surgiu é o organoide derivado do paciente (PDO), onde um tumor de paciente recém-ressecado é cultivado para criar modelos que mantêm a heterogeneidade fenotípica, histoarquitetura e comunicações intercelulares¹⁰. Sua capacidade de se assemelhar a tumores nativos foi demonstrada anteriormente, onde organoides cultivados de câncer de bexiga não invasivo muscular (NMIBC) e músculo-invasivo (MIBC) recapitularam com sucesso aspectos-chave dos tumores parentais¹¹. Devido ao seu potencial e vantagens sobre outros modelos, os PDOs oferecem uma ampla variedade de aplicações personalizadas que outros modelos não possuem, incluindo, mas não se limitando ao estudo e desenvolvimento de inibidores de checkpoint imunológico junto com terapias celulares e direcionadas. Por exemplo, já usamos organoides derivados de pacientes com melanoma (MPDOs) para estudar a capacidade dos linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) de serem expandidos por anticorpos IL-2 e anti-PD1 (αPD-1). Os resultados mostraram que os TILs expandidos por IL-2 e αPD-1 não apenas tiveram um número maior, mas também puderam se infiltrar com sucesso nos MPDOs e matar células de melanoma com maior eficiência do que os TILs expandidos usando outros métodos¹². Outros grupos mostraram resultados semelhantes onde o uso de anti-PD-1 e/ou anti-PD-L1 leva a TILs permanecendo funcionais em PDOs, o que subsequentemente leva à morte do tumor¹³. Além disso, nosso grupo também usou MPDOs para avaliar a infiltração de células T γδ e a capacidade de matar¹⁴. A aplicabilidade dos PDOs abrange uma ampla gama de áreas, incluindo expansão TIL, estudos de citotoxicidade e triagem de pequenas moléculas. Todas essas aplicações destacam o potencial e a usabilidade que esse modelo confere. Como tal, descrevemos o protocolo detalhado para a cultura de MPDOs.

Protocolo

Os tecidos de melanoma humano foram obtidos de pacientes em tratamento na Universidade da Pensilvânia usando o protocolo de coleta de tecidos (UPCC08607) aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade da Pensilvânia. Todos os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. Após a ressecção dos tecidos do melanoma humano, o tecido tumoral é colocado no meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) e mantido a 4 °C até o processamento (dentro de 6 h). Os organoides derivados de pacientes com melanoma (MPDOs) foram derivados de um tumor recente, conforme ilustrado na Figura 1.

1. Isolamento de células do tecido de melanoma humano

1. Preparativos antes do início do procedimento
   NOTA: Dois métodos de cultura (Matrigel e gel de colágeno) podem ser usados para cultivar tecido de melanoma dissociado:
   1. Para o método Matrigel: Prepare uma solução de revestimento de Matriz de Membrana Basal com Fator de Crescimento Reduzido (TFG) diluindo a Matriz de Membrana Basal TFG com meio de cultura organoide (consulte a Tabela 1) na proporção de 1:2. Adicione aproximadamente 115 μL da solução descongelada a cada um dos vários poços de uma placa de 48 poços e deixe-a solidificar por 30 min a 37 ° C em uma incubadora umidificada.
   2. Para o método do gel de colágeno: Adicione 1 mL de gel de colágeno (consulte a Tabela 1) a uma inserção de membrana interna de 30 mm. Deixe o gel solidificar por 30 min a 37 °C em uma incubadora umidificada.
2. Preparar o meio condicionado L-WRN¹⁵. O meio condicionado L-WRN é produzido a partir de uma linha celular L-WRN projetada para secretar Wnt3a, R-spondin 3 e Noggin em um único meio condicionado que é amplamente utilizado para cultura de células.
   1. Descongelar um criotubo de células L-WRN no banho-maria a 37 °C. Adicionar 5 ml de meio de células L (ver quadro 1) e a suspensão de células L-WRN a um tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 120 × g durante 5 min a 4 °C. Aspire o sobrenadante, garantindo que ~ 500 μL sejam deixados no fundo para ressuspender o pellet de células.
   2. Transfira o pellet celular no sobrenadante para 30 mL de meio de célula L em gelo e adicione 150 μL de higromicina (500 μg / mL) e 300 μL de G418 (500 μg / mL). Semeie as células a uma densidade de 3 × 10⁶ em um frasco T-150 e incube a 37 ° C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂ até ~ 90% confluente.
   3. Uma vez que as células estejam ~ 90% confluentes, divida as células em cinco frascos T-150 lavando com 20 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS), aspirando e digerindo com 3 mL de substituto de tripsina. Após 5 min, neutralizar com 9 ml de meio de células L, seguido de centrifugação durante 5 min a 120 × g a 4 °C. Quando ~ 100% confluente, dividir os cinco frascos T-150 em 10 frascos T-175 de 3 camadas.
   4. Uma vez confluentes, lave as células com 2 x 50 mL de PBS e depois com 25 mL de meio de lavagem (ver Tabela 1).
   5. Adicionar 75 ml de meio de cultura primário a cada balão de 3 camadas T-175 e incubar durante 3 dias a 37 °C numa incubadora humidificada com 5% de CO₂ (ver quadro 1).
   6. Após 3 dias, colher o meio condicionado em um cônico de 50 mL e girar a 1.100 × g por 5 min a 4 ° C. Colete o sobrenadante (meio condicionado), garantindo que 5 mL sejam deixados para trás.
   7. Adicione 75 ml de meio de cultura de células primárias a cada balão de 3 camadas T-175 e incube durante mais 3 dias para recolher o meio condicionado adicional.
   8. Ao meio condicionado coletado, adicione um volume igual de meio de cultura de células primárias (50% do volume) e filtre a vácuo o conteúdo usando um filtro de 0,22 μm. Armazene as alíquotas em tubos de 50 mL e armazene a -20 ° C para uso prolongado ou 4 ° C por até 2-3 semanas. Use este meio para complementar os meios de cultura organoides (consulte a Tabela 1).
      NOTA: Descongele as alíquotas a 4 °C durante a noite antes de usar.
3. Colhendo a mistura celular do tecido fresco do melanoma
   1. Lave o tecido de melanoma recém-ressecado em uma placa de Petri de 10 mL contendo meio de lavagem. Após o primeiro enxágue, use uma pinça estéril para transferir o tumor para uma segunda placa de Petri para posterior lavagem e repita esse processo 3x no gelo para preservar a integridade e a viabilidade do tumor. Ao longo desses ciclos de enxágue, use uma tesoura estéril e uma lâmina para remover o excesso de tecido conjuntivo, gordura e sangue residual. Após as três lavagens, coloque o tumor em uma placa de Petri vazia e use lâminas estéreis para picá-lo finamente.
      NOTA: Após a picagem, o tumor deve exibir uma consistência semelhante a um gel. Quanto mais fina for a picagem do tumor, maior será o rendimento celular. Isso ocorre porque aglomerados maiores do tumor serão mais difíceis de digerir e podem não passar pelo filtro de células de nylon de 70 μm na etapa subsequente.
   2. Uma vez que o tecido tumoral tenha sido completamente lavado e picado, transfira-o para um tubo cônico de 50 mL contendo 10 mL do meio de digestão preparado (ver Tabela 1). Coloque o cônico em banho-maria a 37 °C, garantindo que o conteúdo seja agitado a cada 5 min.
   3. Após 25 min, adicione 30 mL do meio ADMEM / F12 contendo 10% de FBS para interromper a digestão.
      NOTA: Essas quantidades especificadas destinam-se a tumores com peso não superior a 0,2 g.
   4. Filtre a suspensão celular digerida através de um filtro de células de nylon de 70 μm e, em seguida, enxágue o filtro com ADMEM / F12 (1x) Meio de soro reduzido (1: 1) contendo 10% de FBS. Após a etapa de lavagem, use uma pipeta para recuperar qualquer mídia restante na parte inferior do filtro para garantir que o maior número possível de células seja recuperado. Em seguida, centrifugue a 300 × g durante 7 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em meio de cultura organoide (ver quadro 1).
   5. Cultive a suspensão unicelular de melanoma em sistemas de cultura Matrigel ou colágeno:
      1. Matrigel: Conte a suspensão unicelular para garantir que aproximadamente 2 × 10⁵ células sejam semeadas nos poços revestidos de Matrigel pré-aquecidos suplementados com 200 μL de meio de cultura organoide.
         NOTA: Os organoides à base de matrigel são usados para estudar a fisiopatologia, rastrear a eficácia do medicamento e testar a toxicidade do medicamento¹⁶.
      2. Gel de colágeno: Conte a suspensão unicelular para garantir que aproximadamente 10⁶ células sejam misturadas com 1 mL de gel de colágeno. Adicione a mistura às inserções de membrana de gel de colágeno pré-solidificadas e coloque-as em uma placa de 6 poços. Adicione meio de cultura organoide suficiente para submergir as inserções contendo as células e o gel de colágeno.
         NOTA: Os organoides de gel de colágeno são usados para medir a migração de células T e estudar o desenvolvimento do tecido¹⁶.
   6. Deixe os organoides crescerem, garantindo que o meio fresco seja adicionado a cada 3 dias.
   7. Passe os organoides quando atingirem 150-200 μm de tamanho ou criopreserve-os até uso posterior.
      1. Para a passagem de organoides, transfira os organoides para um cônico de 15 mL e lave com 1x DPSB. Centrifugar a mistura a 300 × g durante 7 min a 4 °C. Remova o sobrenadante e adicione substituto de tripsina (50-100 μL por organoide) por 10 min em banho-maria a 37 °C, garantindo que o conteúdo seja vórtice a cada 3 min.
      2. Pare a digestão usando ADMEM/F12 (1x) Meio de Soro Reduzido (1:1) contendo 10% de FBS. Centrifugar a mistura a 300 × g durante 7 min e ressuspender em meio de cultura organoide.
      3. Semeie a suspensão unicelular em um novo poço revestido de Matrigel/colágeno com a mesma densidade de semeadura inicial (2 × 10⁵ células em 200 μL de meio de cultura organoide para poços revestidos com Matrigel em uma placa de 48 poços ou 10⁶ células em 1 mL de meio de cultura organoide para inserção de membrana interna de 30 mm revestida com colágeno).
      4. Para criopreservação, digerir MPDOs usando o substituto de tripsina em suspensões unicelulares seguidas de ressuspensão de 10⁶ células em 1 mL de meio de congelamento (ver Tabela 1).

Resultados

A forma e o tamanho dos MPDOs foram monitorados ao longo do tempo para estudar sua dinâmica de crescimento. Como visto na Figura 2, durante o período inicial de crescimento, o tamanho do organoide aumentou substancialmente ao longo dos 7 dias representados. Após a observação da dinâmica de crescimento do MPDO, a atenção voltou-se para a avaliação da composição das células imunes para verificar a recapitulação fiel dos organoides aos tumores or...

Discussão

O surgimento de PDOs abordou várias limitações impostas por outros métodos de pesquisa de câncer previamente estabelecidos, ao mesmo tempo em que introduziu aplicações potenciais transformadoras no campo. Essa tecnologia organoide foi inicialmente proposta em 2009 por Hans Clevers e colegas, que conseguiram estabelecer com sucesso um sistema de cultura organoide intestinal cultivando células-tronco Lgr5⁺ derivadas do intestino de camundongos em um gel de matriz 3D cont...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Red Cap Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial	Corning	431420
50 mL Polypropylene Conical Tube	Corning	352070
100 mm TC-treated Cell Culture Dish	Corning	353003
105 mm Polystyrene Forceps Sterile	Caplugs Evergreen	222-1121-B1I
150 cm2 Cell Culture Flask	Corning	CLS430825
A83-01	Tocris	2939
Advanced DMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1)	Gibco	12634-010
B-27 Supplement (50x)	Gibco	17504-044
Brilliant Violet 510 anti-human Perforin Antibody	BioLegend	308120
Brilliant Violet 605 anti-human Ki-67 Antibody	BioLegend	350522
Brilliant Violet 650 anti-human CD366 (Tim-3) Antibody	BioLegend	345028
Brilliant Violet 711 anti-human CD45 Antibody	BioLegend	304050
Cell Culture Inserts 0.4 µm, 30 mm Diameter	Millipore Sigma	PIHP03050
Cell Staining Buffer	BioLegend	420201
Cell Strainer 40 µm Nylon	Corning	352340
Cell Strainer 70 µm Nylon	Corning	352350
Collagenase, Type IV, powder	Gibco	17104019
Cultrex Rat Collagen I	Trevigen	3440-100-01
Culture Plate, PS, 48 wells, TC treated with lid, sterile	Max Scientific	07-6048
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM - high glucose 4.5 mg/mL	Corning	MT10-0130CV
Dnase I - Grade II	Millipore Sigma	10104159001
DPBS, 1%	Corning	21-031-CV
Fetal Bovine Serum, FBS	Corning	MT35-010-CV
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I	BD Biosciences	556547
Forskolin	Tocris	1099
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)	ThermoFisher	10131035
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher	35050061
Ham's F12 Nutrient Mix	ThermoFisher	11765054
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Hygromycin B (50 mg/mL)	ThermoFisher	10687010
L-Glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-081
L-WRN cell	ATCC	CRL-3276
Matrigel Phenol Free & Growth Fact. Reduced	Corning	356231
Millex PVDF syringe filter, 0.22 μM	Millipore Sigma	SLGVR33RB
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-100G
Nunc TripleFlask Treated Cell Culture Flask	ThermoFisher	132867
PE/Cyanine5 anti-human CD8a Antibody	BioLegend	301010
PE-Cy 7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)	BD Biosciences	561272
Pen Strep	Gibco	15140-122
Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15-1MG
Recombinant Human FGF-acidic	Peprotech	100-17A
Sodium Bicarbonate Solution (NaHCO3) (7.5%)	Quality Biological	118-085-721
Stainless Steel Surgical Blades no. 22	Integra	4-322
TrypLE Express	Gibco	12604-021