A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת אורגנואידים שמקורם בחולי מלנומה על ידי תרבית תרחיפים של תאים מנותקים מרקמות מלנומה טרייה. אורגנואידים אלה משחזרים בנאמנות גידולים ספציפיים למטופל במבחנה, ומציעים גישה חדשנית לחקר מנגנוני דיכוי החיסון של הגידול, בדיקות סקר לתרופות, מנגנוני עמידות לתרופות וגישות מעקב אחר סרטן.

Abstract

עם התפתחות האימונותרפיה, יש צורך מתמשך לפתח מודלים שיכולים לשחזר את המיקרו-סביבה של הגידול של גידולים מקומיים. בעוד מודלים מסורתיים דו-ממדיים ותלת ממדיים יכולים להציע תובנות לגבי התפתחות סרטן והתקדמותו, אלה חסרים היבטים מכריעים המעכבים חיקוי נאמן של גידולים מקומיים. מודל חלופי שזכה לתשומת לב רבה הוא אורגנואיד הנגזר מהמטופל. התפתחותם של אורגנואידים אלה משחזרת את התקשורת הבין-תאית המורכבת, המיקרו-סביבה של הגידול וההיסטוארכיטקטורה של גידולים. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול להקמת מודלים אורגנואידים הנגזרים מחולה מלנומה (MPDO). כדי לאמת את המודלים האלה, הערכנו את הרכב תאי החיסון, כולל רמות הביטוי של סמני הפעלת תאי T, כדי לאשר את ההטרוגניות התאית של האורגנואידים. בנוסף, כדי לתאר את התועלת הפוטנציאלית של MPDOs בטיפולים תאיים, הערכנו את היכולות ציטוטוקסיות של טיפול באורגנואידים עם תאי T γδ. לסיכום, מודלי MPDO מציעים דרכים מבטיחות להבנת מורכבות הגידול, אימות אסטרטגיות טיפוליות וקידום טיפול מותאם אישית.

Introduction

מודלים קונבנציונליים של תרביות תאים דו-ממדיות הם כלים חיוניים בחקר הסרטן לחקר התקדמות הסרטן והטיפולבו 1. מודלים אלה לא רק מאפשרים תנאי ניסוי מבוקרים כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים והתאיים העומדים בבסיס התפתחות והתקדמות סרטן, אלא גם מספקים תוצאות ניסוי חסכוניות ומהירות יחסית. השימוש בהם, עם זאת, מוגבל בשל המגוון התאי המוגבל במיקרו-סביבה של הגידול (TME), אשר לא ניתן לשחזר בטבע קופלנרי של מודלים מונו-תרבותיים2. בנוסף, מודלים של תרביות תאים מציעים סביבה פשטנית מדי בהשוואה לגוף האדם3. לכן, כדי להבין טוב יותר את התקדמות הסרטן ולפתח טיפולים יעילים, חוקרים פנו למודלים....

Protocol

רקמות מלנומה אנושית התקבלו מחולים שקיבלו טיפול באוניברסיטת פנסילבניה באמצעות פרוטוקול איסוף רקמות (UPCC08607) שאושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת פנסילבניה. כל המטופלים חתמו על הסכמה מדעת. לאחר כריתה של רקמות המלנומה האנושית, רקמת הגידול ממוקמת בתווך הנשר השונה של דולבקו (DMEM) ונשמרת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לעיבוד (תוך 6 שעות). אורגנואידים שמקורם בחולי מלנומה (MPDOs) נגזרו מגידול טרי כפי שמודגם באיור 1.

1. בידוד תאים מרקמת המלנומה האנושית

  1. הכנות לפני תחילת ההליך
    הערה: ניתן להשתמש בשתי שיטות תרבית (מטריג'ל וג'ל קולגן) לתרבית רקמת....

תוצאות

הצורה והגודל של MPDOs נוטרו לאורך זמן כדי ללמוד את דינמיקת הצמיחה שלהם. כפי שניתן לראות באיור 2, במהלך תקופת הגידול הראשונית, גודל האורגנואיד גדל באופן משמעותי במהלך 7 הימים המתוארים. בעקבות התצפית על דינמיקת הגדילה של MPDO, תשומת הלב הופנתה להערכת הרכב תאי החי.......

Discussion

הופעתם של PDOs התייחסה למגבלות מרובות שמציבות שיטות מחקר סרטן אחרות שהוקמו בעבר, תוך הצגת יישומים פוטנציאליים טרנספורמטיביים בתחום. טכנולוגיית אורגנואידים זו הוצעה לראשונה בשנת 2009 על ידי הנס קלברס ועמיתיו, שהצליחו לבסס בהצלחה מערכת תרבית אורגנואידים במעיים על ידי גידול .......

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgements

מחקר זה מומן בחלקו על ידי מענקים מהחברות R01(CA258113), SPORE (CA261608) ו-P01 (CA114046). איור 1 הוכן בשנת BioRender.com.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2 mL Red Cap Internal Threaded Polypropylene Cryogenic VialCorning431420
50 mL Polypropylene Conical TubeCorning352070
100 mm TC-treated Cell Culture DishCorning353003
105 mm Polystyrene Forceps SterileCaplugs Evergreen 222-1121-B1I
150 cm2 Cell Culture FlaskCorningCLS430825
A83-01Tocris2939
Advanced DMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1)Gibco12634-010
B-27 Supplement (50x)Gibco17504-044
Brilliant Violet 510 anti-human Perforin AntibodyBioLegend308120
Brilliant Violet 605 anti-human Ki-67 AntibodyBioLegend350522
Brilliant Violet 650 anti-human CD366 (Tim-3) AntibodyBioLegend345028
Brilliant Violet 711 anti-human CD45 AntibodyBioLegend304050
Cell Culture Inserts 0.4 µm, 30 mm DiameterMillipore SigmaPIHP03050
Cell Staining BufferBioLegend420201
Cell Strainer 40 µm NylonCorning 352340
Cell Strainer 70 µm NylonCorning 352350
Collagenase, Type IV, powderGibco17104019
Cultrex Rat Collagen ITrevigen3440-100-01
Culture Plate, PS, 48 wells, TC treated with lid, sterileMax Scientific 07-6048
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-MaxSigma-AldrichD2650
DMEM - high glucose 4.5 mg/mLCorningMT10-0130CV
Dnase I - Grade IIMillipore Sigma10104159001
DPBS, 1% Corning21-031-CV
Fetal Bovine Serum, FBSCorningMT35-010-CV
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit IBD Biosciences 556547
ForskolinTocris1099
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)ThermoFisher10131035
GlutaMAX SupplementThermoFisher35050061
Ham's F12 Nutrient MixThermoFisher11765054
HEPES (1 M)Gibco15630-080
Hygromycin B (50 mg/mL)ThermoFisher10687010
L-Glutamine 200 mM (100x)Gibco25030-081
L-WRN cellATCCCRL-3276
Matrigel Phenol Free & Growth Fact. ReducedCorning356231
Millex PVDF syringe filter, 0.22 μMMillipore SigmaSLGVR33RB
N-AcetylcysteineSigma-AldrichA9165-5G
NicotinamideSigma-AldrichN0636-100G
Nunc TripleFlask Treated Cell Culture FlaskThermoFisher132867
PE/Cyanine5 anti-human CD8a AntibodyBioLegend301010
PE-Cy 7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)BD Biosciences 561272
Pen StrepGibco15140-122
Recombinant Human EGFPeprotechAF-100-15-1MG
Recombinant Human FGF-acidicPeprotech100-17A
Sodium Bicarbonate Solution (NaHCO3) (7.5%)Quality Biological 118-085-721
Stainless Steel Surgical Blades no. 22Integra4-322
TrypLE Express Gibco12604-021

References

  1. Mirabelli, P., Coppola, L., Salvatore, M. Cancer Cell Lines Are Useful Model Systems for Medical Research. Cancers (Basel). 11 (8), 1098 (2019).
  2. Shannon, A. E., Boos, C. E., Hummon, A. B. ....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

T

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved