חשיפת הזדמנויות טיפוליות עם מודלים אורגנואידים שמקורם בחולה מלנומה

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת אורגנואידים שמקורם בחולי מלנומה על ידי תרבית תרחיפים של תאים מנותקים מרקמות מלנומה טרייה. אורגנואידים אלה משחזרים בנאמנות גידולים ספציפיים למטופל במבחנה, ומציעים גישה חדשנית לחקר מנגנוני דיכוי החיסון של הגידול, בדיקות סקר לתרופות, מנגנוני עמידות לתרופות וגישות מעקב אחר סרטן.

Abstract

עם התפתחות האימונותרפיה, יש צורך מתמשך לפתח מודלים שיכולים לשחזר את המיקרו-סביבה של הגידול של גידולים מקומיים. בעוד מודלים מסורתיים דו-ממדיים ותלת ממדיים יכולים להציע תובנות לגבי התפתחות סרטן והתקדמותו, אלה חסרים היבטים מכריעים המעכבים חיקוי נאמן של גידולים מקומיים. מודל חלופי שזכה לתשומת לב רבה הוא אורגנואיד הנגזר מהמטופל. התפתחותם של אורגנואידים אלה משחזרת את התקשורת הבין-תאית המורכבת, המיקרו-סביבה של הגידול וההיסטוארכיטקטורה של גידולים. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול להקמת מודלים אורגנואידים הנגזרים מחולה מלנומה (MPDO). כדי לאמת את המודלים האלה, הערכנו את הרכב תאי החיסון, כולל רמות הביטוי של סמני הפעלת תאי T, כדי לאשר את ההטרוגניות התאית של האורגנואידים. בנוסף, כדי לתאר את התועלת הפוטנציאלית של MPDOs בטיפולים תאיים, הערכנו את היכולות ציטוטוקסיות של טיפול באורגנואידים עם תאי T γδ. לסיכום, מודלי MPDO מציעים דרכים מבטיחות להבנת מורכבות הגידול, אימות אסטרטגיות טיפוליות וקידום טיפול מותאם אישית.

Introduction

מודלים קונבנציונליים של תרביות תאים דו-ממדיות הם כלים חיוניים בחקר הסרטן לחקר התקדמות הסרטן והטיפול^{בו 1}. מודלים אלה לא רק מאפשרים תנאי ניסוי מבוקרים כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים והתאיים העומדים בבסיס התפתחות והתקדמות סרטן, אלא גם מספקים תוצאות ניסוי חסכוניות ומהירות יחסית. השימוש בהם, עם זאת, מוגבל בשל המגוון התאי המוגבל במיקרו-סביבה של הגידול (TME), אשר לא ניתן לשחזר בטבע קופלנרי של מודלים מונו-תרבותיים². בנוסף, מודלים של תרביות תאים מציעים סביבה פשטנית מדי בהשוואה לגוף האדם³. לכן, כדי להבין טוב יותר את התקדמות הסרטן ולפתח טיפולים יעילים, חוקרים פנו למודלים....

Protocol

רקמות מלנומה אנושית התקבלו מחולים שקיבלו טיפול באוניברסיטת פנסילבניה באמצעות פרוטוקול איסוף רקמות (UPCC08607) שאושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת פנסילבניה. כל המטופלים חתמו על הסכמה מדעת. לאחר כריתה של רקמות המלנומה האנושית, רקמת הגידול ממוקמת בתווך הנשר השונה של דולבקו (DMEM) ונשמרת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לעיבוד (תוך 6 שעות). אורגנואידים שמקורם בחולי מלנומה (MPDOs) נגזרו מגידול טרי כפי שמודגם באיור 1.

1. בידוד תאים מרקמת המלנומה האנושית

1. הכנות לפני תחילת ההליך
   הערה: ניתן להשתמש בשתי שיטות תרבית (מטריג'ל וג'ל קולגן) לתרבית רקמת....

תוצאות

הצורה והגודל של MPDOs נוטרו לאורך זמן כדי ללמוד את דינמיקת הצמיחה שלהם. כפי שניתן לראות באיור 2, במהלך תקופת הגידול הראשונית, גודל האורגנואיד גדל באופן משמעותי במהלך 7 הימים המתוארים. בעקבות התצפית על דינמיקת הגדילה של MPDO, תשומת הלב הופנתה להערכת הרכב תאי החי.......

Discussion

הופעתם של PDOs התייחסה למגבלות מרובות שמציבות שיטות מחקר סרטן אחרות שהוקמו בעבר, תוך הצגת יישומים פוטנציאליים טרנספורמטיביים בתחום. טכנולוגיית אורגנואידים זו הוצעה לראשונה בשנת 2009 על ידי הנס קלברס ועמיתיו, שהצליחו לבסס בהצלחה מערכת תרבית אורגנואידים במעיים על ידי גידול .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Red Cap Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial	Corning	431420
50 mL Polypropylene Conical Tube	Corning	352070
100 mm TC-treated Cell Culture Dish	Corning	353003
105 mm Polystyrene Forceps Sterile	Caplugs Evergreen	222-1121-B1I
150 cm2 Cell Culture Flask	Corning	CLS430825
A83-01	Tocris	2939
Advanced DMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1)	Gibco	12634-010
B-27 Supplement (50x)	Gibco	17504-044
Brilliant Violet 510 anti-human Perforin Antibody	BioLegend	308120
Brilliant Violet 605 anti-human Ki-67 Antibody	BioLegend	350522
Brilliant Violet 650 anti-human CD366 (Tim-3) Antibody	BioLegend	345028
Brilliant Violet 711 anti-human CD45 Antibody	BioLegend	304050
Cell Culture Inserts 0.4 µm, 30 mm Diameter	Millipore Sigma	PIHP03050
Cell Staining Buffer	BioLegend	420201
Cell Strainer 40 µm Nylon	Corning	352340
Cell Strainer 70 µm Nylon	Corning	352350
Collagenase, Type IV, powder	Gibco	17104019
Cultrex Rat Collagen I	Trevigen	3440-100-01
Culture Plate, PS, 48 wells, TC treated with lid, sterile	Max Scientific	07-6048
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM - high glucose 4.5 mg/mL	Corning	MT10-0130CV
Dnase I - Grade II	Millipore Sigma	10104159001
DPBS, 1%	Corning	21-031-CV
Fetal Bovine Serum, FBS	Corning	MT35-010-CV
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I	BD Biosciences	556547
Forskolin	Tocris	1099
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)	ThermoFisher	10131035
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher	35050061
Ham's F12 Nutrient Mix	ThermoFisher	11765054
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Hygromycin B (50 mg/mL)	ThermoFisher	10687010
L-Glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-081
L-WRN cell	ATCC	CRL-3276
Matrigel Phenol Free & Growth Fact. Reduced	Corning	356231
Millex PVDF syringe filter, 0.22 μM	Millipore Sigma	SLGVR33RB
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-100G
Nunc TripleFlask Treated Cell Culture Flask	ThermoFisher	132867
PE/Cyanine5 anti-human CD8a Antibody	BioLegend	301010
PE-Cy 7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)	BD Biosciences	561272
Pen Strep	Gibco	15140-122
Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15-1MG
Recombinant Human FGF-acidic	Peprotech	100-17A
Sodium Bicarbonate Solution (NaHCO3) (7.5%)	Quality Biological	118-085-721
Stainless Steel Surgical Blades no. 22	Integra	4-322
TrypLE Express	Gibco	12604-021