A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת אורגנואידים שמקורם בחולי מלנומה על ידי תרבית תרחיפים של תאים מנותקים מרקמות מלנומה טרייה. אורגנואידים אלה משחזרים בנאמנות גידולים ספציפיים למטופל במבחנה, ומציעים גישה חדשנית לחקר מנגנוני דיכוי החיסון של הגידול, בדיקות סקר לתרופות, מנגנוני עמידות לתרופות וגישות מעקב אחר סרטן.
עם התפתחות האימונותרפיה, יש צורך מתמשך לפתח מודלים שיכולים לשחזר את המיקרו-סביבה של הגידול של גידולים מקומיים. בעוד מודלים מסורתיים דו-ממדיים ותלת ממדיים יכולים להציע תובנות לגבי התפתחות סרטן והתקדמותו, אלה חסרים היבטים מכריעים המעכבים חיקוי נאמן של גידולים מקומיים. מודל חלופי שזכה לתשומת לב רבה הוא אורגנואיד הנגזר מהמטופל. התפתחותם של אורגנואידים אלה משחזרת את התקשורת הבין-תאית המורכבת, המיקרו-סביבה של הגידול וההיסטוארכיטקטורה של גידולים. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול להקמת מודלים אורגנואידים הנגזרים מחולה מלנומה (MPDO). כדי לאמת את המודלים האלה, הערכנו את הרכב תאי החיסון, כולל רמות הביטוי של סמני הפעלת תאי T, כדי לאשר את ההטרוגניות התאית של האורגנואידים. בנוסף, כדי לתאר את התועלת הפוטנציאלית של MPDOs בטיפולים תאיים, הערכנו את היכולות ציטוטוקסיות של טיפול באורגנואידים עם תאי T γδ. לסיכום, מודלי MPDO מציעים דרכים מבטיחות להבנת מורכבות הגידול, אימות אסטרטגיות טיפוליות וקידום טיפול מותאם אישית.
מודלים קונבנציונליים של תרביות תאים דו-ממדיות הם כלים חיוניים בחקר הסרטן לחקר התקדמות הסרטן והטיפולבו 1. מודלים אלה לא רק מאפשרים תנאי ניסוי מבוקרים כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים והתאיים העומדים בבסיס התפתחות והתקדמות סרטן, אלא גם מספקים תוצאות ניסוי חסכוניות ומהירות יחסית. השימוש בהם, עם זאת, מוגבל בשל המגוון התאי המוגבל במיקרו-סביבה של הגידול (TME), אשר לא ניתן לשחזר בטבע קופלנרי של מודלים מונו-תרבותיים2. בנוסף, מודלים של תרביות תאים מציעים סביבה פשטנית מדי בהשוואה לגוף האדם3. לכן, כדי להבין טוב יותר את התקדמות הסרטן ולפתח טיפולים יעילים, חוקרים פנו למודלים....
רקמות מלנומה אנושית התקבלו מחולים שקיבלו טיפול באוניברסיטת פנסילבניה באמצעות פרוטוקול איסוף רקמות (UPCC08607) שאושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת פנסילבניה. כל המטופלים חתמו על הסכמה מדעת. לאחר כריתה של רקמות המלנומה האנושית, רקמת הגידול ממוקמת בתווך הנשר השונה של דולבקו (DMEM) ונשמרת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לעיבוד (תוך 6 שעות). אורגנואידים שמקורם בחולי מלנומה (MPDOs) נגזרו מגידול טרי כפי שמודגם באיור 1.
1. בידוד תאים מרקמת המלנומה האנושית
הצורה והגודל של MPDOs נוטרו לאורך זמן כדי ללמוד את דינמיקת הצמיחה שלהם. כפי שניתן לראות באיור 2, במהלך תקופת הגידול הראשונית, גודל האורגנואיד גדל באופן משמעותי במהלך 7 הימים המתוארים. בעקבות התצפית על דינמיקת הגדילה של MPDO, תשומת הלב הופנתה להערכת הרכב תאי החי.......
הופעתם של PDOs התייחסה למגבלות מרובות שמציבות שיטות מחקר סרטן אחרות שהוקמו בעבר, תוך הצגת יישומים פוטנציאליים טרנספורמטיביים בתחום. טכנולוגיית אורגנואידים זו הוצעה לראשונה בשנת 2009 על ידי הנס קלברס ועמיתיו, שהצליחו לבסס בהצלחה מערכת תרבית אורגנואידים במעיים על ידי גידול .......
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.
מחקר זה מומן בחלקו על ידי מענקים מהחברות R01(CA258113), SPORE (CA261608) ו-P01 (CA114046). איור 1 הוכן בשנת BioRender.com.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
2 mL Red Cap Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 431420 | |
50 mL Polypropylene Conical Tube | Corning | 352070 | |
100 mm TC-treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
105 mm Polystyrene Forceps Sterile | Caplugs Evergreen | 222-1121-B1I | |
150 cm2 Cell Culture Flask | Corning | CLS430825 | |
A83-01 | Tocris | 2939 | |
Advanced DMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1) | Gibco | 12634-010 | |
B-27 Supplement (50x) | Gibco | 17504-044 | |
Brilliant Violet 510 anti-human Perforin Antibody | BioLegend | 308120 | |
Brilliant Violet 605 anti-human Ki-67 Antibody | BioLegend | 350522 | |
Brilliant Violet 650 anti-human CD366 (Tim-3) Antibody | BioLegend | 345028 | |
Brilliant Violet 711 anti-human CD45 Antibody | BioLegend | 304050 | |
Cell Culture Inserts 0.4 µm, 30 mm Diameter | Millipore Sigma | PIHP03050 | |
Cell Staining Buffer | BioLegend | 420201 | |
Cell Strainer 40 µm Nylon | Corning | 352340 | |
Cell Strainer 70 µm Nylon | Corning | 352350 | |
Collagenase, Type IV, powder | Gibco | 17104019 | |
Cultrex Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
Culture Plate, PS, 48 wells, TC treated with lid, sterile | Max Scientific | 07-6048 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DMEM - high glucose 4.5 mg/mL | Corning | MT10-0130CV | |
Dnase I - Grade II | Millipore Sigma | 10104159001 | |
DPBS, 1% | Corning | 21-031-CV | |
Fetal Bovine Serum, FBS | Corning | MT35-010-CV | |
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences | 556547 | |
Forskolin | Tocris | 1099 | |
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) | ThermoFisher | 10131035 | |
GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
Ham's F12 Nutrient Mix | ThermoFisher | 11765054 | |
HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
Hygromycin B (50 mg/mL) | ThermoFisher | 10687010 | |
L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
L-WRN cell | ATCC | CRL-3276 | |
Matrigel Phenol Free & Growth Fact. Reduced | Corning | 356231 | |
Millex PVDF syringe filter, 0.22 μM | Millipore Sigma | SLGVR33RB | |
N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
Nunc TripleFlask Treated Cell Culture Flask | ThermoFisher | 132867 | |
PE/Cyanine5 anti-human CD8a Antibody | BioLegend | 301010 | |
PE-Cy 7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1) | BD Biosciences | 561272 | |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15-1MG | |
Recombinant Human FGF-acidic | Peprotech | 100-17A | |
Sodium Bicarbonate Solution (NaHCO3) (7.5%) | Quality Biological | 118-085-721 | |
Stainless Steel Surgical Blades no. 22 | Integra | 4-322 | |
TrypLE Express | Gibco | 12604-021 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved