Svelare le opportunità terapeutiche con i modelli di organoidi derivati dai pazienti con melanoma

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per generare organoidi derivati da pazienti affetti da melanoma coltivando sospensioni cellulari dissociate da tessuti freschi di melanoma. Questi organoidi ricapitolano fedelmente i tumori paziente-specifici in vitro, offrendo un approccio innovativo all'esplorazione dei meccanismi immunosoppressivi dei tumori, allo screening dei farmaci, ai meccanismi di resistenza ai farmaci e agli approcci di sorveglianza del cancro.

Abstract

Con lo sviluppo dell'immunoterapia, c'è una continua necessità di sviluppare modelli in grado di ricapitolare il microambiente tumorale dei tumori nativi. Mentre i modelli tradizionali bidimensionali e tridimensionali possono offrire informazioni sullo sviluppo e la progressione del cancro, questi mancano di aspetti cruciali che ostacolano una fedele imitazione dei tumori nativi. Un modello alternativo che ha guadagnato molta attenzione è l'organoide derivato dal paziente. Lo sviluppo di questi organoidi ricapitola la complessa comunicazione intercellulare, il microambiente tumorale e l'istoarchitettura dei tumori. Questo articolo descrive il protocollo per la creazione di modelli di organoidi derivati da pazienti con melanoma (MPDO). Per convalidare questi modelli, abbiamo valutato la composizione delle cellule immunitarie, compresi i livelli di espressione dei marcatori di attivazione delle cellule T, per confermare l'eterogeneità cellulare degli organoidi. Inoltre, per descrivere la potenziale utilità delle MPDO nelle terapie cellulari, abbiamo valutato le capacità citotossiche del trattamento degli organoidi con cellule T γδ. In conclusione, i modelli MPDO offrono strade promettenti per comprendere la complessità del tumore, convalidare le strategie terapeutiche e potenzialmente far progredire il trattamento personalizzato.

Introduzione

I modelli convenzionali di coltura cellulare 2D sono strumenti essenziali nella ricerca sul cancro per studiare la progressione e la terapia del cancro¹. Questi modelli non solo consentono condizioni sperimentali controllate per studiare i meccanismi molecolari e cellulari alla base dello sviluppo e della progressione del cancro, ma forniscono anche risultati sperimentali economici e relativamente rapidi. Il loro utilizzo, tuttavia, è limitato a causa della limitata diversità cellulare nel microambiente tumorale (TME), che non può essere riassunta in una natura complanare dei modelli monocolturali². Inoltre, i modelli di coltura cellulare offrono un ambiente eccessivamente semplificato rispetto al corpo umano³. Pertanto, per comprendere meglio la progressione del cancro e sviluppare trattamenti efficaci, i ricercatori si sono rivolti a modelli innovativi che mirano a ricapitolare da vicino il TME in natura. Di conseguenza, mantenere la fedeltà ai tumori nativi è fondamentale in questi modelli. Data la natura intricata del cancro, qualsiasi deviazione significativa dal tumore originale potrebbe introdurre variabili impreviste che potrebbero confondere conclusioni significative sul comportamento del tumore.

Mentre gli xenotrapianti derivati da pazienti (PDX) sono emersi come un sistema modello che consente il monitoraggio della progressione del tumore in vivo, alcune limitazioni mettono in dubbio la capacità del tumore sviluppato di ricapitolare la biologia del cancro umano⁴. Ad esempio, il melanoma TME contiene cellule immunitarie infiltranti il tumore e cellule stromali. Quando viene fatto passare come xenotrapianto, le cellule non tumorali del paziente andranno gradualmente perse, il che può selezionare adattamenti diversi da quelli dei tumori dei pazienti. Sebbene queste limitazioni possano essere mitigate eseguendo passaggi limitati della PDX in vivo, le differenze tra le specie possono comunque rappresentare un rischio di cambiamenti genetici della PDX che si discostano da quelli del tumore nativo⁵. Inoltre, i modelli PDX sono tipicamente stabiliti nei topi immunocompromessi per prevenire il rigetto dei tessuti umani. Ciò limita la capacità di studiare il ruolo del sistema immunitario dell'ospite nel cancro, specialmente negli studi immunoterapeutici⁶. Noi e altri abbiamo innestato PDX in topi "umanizzati" ^7,8. Tuttavia, la creazione di modelli PDX nei topi umanizzati richiede tempo e denaro. Lo sviluppo di un singolo modello PDX a partire dal campione tumorale di un paziente può richiedere da diversi mesi ad anni, limitando così la velocità e la scala della ricerca. Nonostante queste limitazioni, è stato dimostrato che i modelli PDX rappresentano accuratamente la biologia del TME, essendo stati quindi ampiamente utilizzati per lo sviluppo di terapie oncologiche, medicina personalizzata e immunoterapia, tra gli altri⁹.

Una tecnica di coltura 3D alternativa che è emersa è l'organoide derivato dal paziente (PDO), in cui un tumore paziente appena resecato viene coltivato per creare modelli che mantengano l'eterogeneità fenotipica, l'istoarchitettura e le comunicazioni intercellulari¹⁰. La sua capacità di assomigliare molto ai tumori nativi è stata precedentemente dimostrata in cui organoidi in coltura provenienti da carcinoma della vescica non muscolo-invasivo (NMIBC) e muscolo-invasivo (MIBC) hanno riassunto con successo aspetti chiave dei tumori parentali¹¹. Grazie al loro potenziale e ai loro vantaggi rispetto ad altri modelli, i PDO offrono un'ampia varietà di applicazioni su misura che mancano ad altri modelli, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, lo studio e lo sviluppo di inibitori del checkpoint immunitario insieme a terapie cellulari e mirate. Ad esempio, abbiamo precedentemente utilizzato organoidi derivati da pazienti con melanoma (MPDO) per studiare la capacità dei linfociti infiltranti il tumore (TIL) di essere espansi da IL-2 e anticorpi anti-PD1 (αPD-1). I risultati hanno mostrato che i TIL espansi da IL-2 e αPD-1 non solo avevano un numero più elevato, ma potevano anche infiltrarsi con successo nelle MPDO e uccidere le cellule di melanoma con maggiore efficienza rispetto alle TIL espanse utilizzando^{altri metodi.} Altri gruppi hanno mostrato risultati simili in cui l'uso di anti-PD-1 e/o anti-PD-L1 porta a mantenere i TIL funzionali nei PDO, il che successivamente porta all'uccisione del tumore¹³. Inoltre, il nostro gruppo ha anche utilizzato gli MPDO per valutare l'infiltrazione e la capacità di uccidere le cellule T γδ¹⁴. L'applicabilità delle DOP abbraccia un'ampia gamma di aree, tra cui l'espansione del TIL, gli studi di citotossicità e lo screening di piccole molecole. Tutte queste applicazioni evidenziano le potenzialità e l'usabilità che questo modello conferisce. Pertanto, descriviamo il protocollo dettagliato per la coltura delle MPDO.

Protocollo

I tessuti del melanoma umano sono stati ottenuti da pazienti in trattamento presso l'Università della Pennsylvania utilizzando il protocollo di raccolta dei tessuti (UPCC08607) approvato dall'Institutional Review Board dell'Università della Pennsylvania. Tutti i pazienti hanno firmato il consenso informato. Dopo la resezione dei tessuti del melanoma umano, il tessuto tumorale viene posto nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco e mantenuto a 4 °C fino al trattamento (entro 6 ore). Gli organoidi derivati da pazienti affetti da melanoma (MPDO) sono stati derivati da un tumore fresco, come illustrato nella Figura 1.

1. Isolamento di cellule da tessuto di melanoma umano

1. Preparativi prima dell'inizio della procedura
   NOTA: Due metodi di coltura (Matrigel e gel di collagene) possono essere utilizzati per coltivare il tessuto dissociato del melanoma:
   1. Per il metodo Matrigel: Preparare una soluzione di rivestimento della matrice della membrana basale a fattore di crescita ridotto (GFR) diluendo la matrice della membrana basale GFR con terreno di coltura di organoidi (vedi Tabella 1) in un rapporto 1:2. Aggiungere circa 115 μl della soluzione scongelata a ciascuno dei diversi pozzetti di una piastra a 48 pozzetti e lasciarla solidificare per 30 minuti a 37 °C in un incubatore umidificato.
   2. Per il metodo del gel di collagene: Aggiungere 1 mL di gel di collagene (vedere Tabella 1) a un inserto interno della membrana da 30 mm. Lasciare solidificare il gel per 30 minuti a 37 °C in un'incubatrice umidificata.
2. Preparare il terreno condizionato L-WRN¹⁵. Il terreno condizionato con L-WRN è prodotto da una linea cellulare L-WRN ingegnerizzata per secernere Wnt3a, R-spondina 3 e Noggin in un unico terreno condizionato ampiamente utilizzato per la coltura cellulare.
   1. Scongelare un criotubo di cellule L-WRN nel bagno d'acqua a 37 °C. Aggiungere 5 mL di terreno L-cell (vedere Tabella 1) e la sospensione cellulare L-WRN in una provetta conica da 15 mL e centrifugare a 120 × g per 5 min a 4 °C. Aspirare il surnatante, assicurandosi che rimangano ~500 μl sul fondo per risospendere il pellet di cellule.
   2. Trasferire il pellet cellulare nel surnatante in 30 mL di terreno L-cell su ghiaccio e aggiungere 150 μL di igromicina (500 μg/mL) e 300 μL di G418 (500 μg/mL). Seminare le cellule a una densità di 3 × 10⁶ su un pallone T-150 e incubare a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO₂ fino a ~90% confluente.
   3. Una volta che le cellule sono confluenti al ~90%, dividere le cellule in cinque fiasche T-150 lavandole con 20 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), aspirando e digerendo con 3 mL di sostituto della tripsina. Dopo 5 minuti, neutralizzare con 9 mL di terreno L-cell seguito da centrifugazione per 5 minuti a 120 × g a 4 °C. Quando ~100% confluente, dividere i cinque palloni T-150 in 10 palloni T-175 a 3 strati.
   4. Una volta confluenti, lavare le celle con 2 x 50 mL di PBS e poi con 25 mL di terreno di lavaggio (vedere Tabella 1).
   5. Aggiungere 75 mL di terreno di coltura primaria a ciascun pallone a 3 strati di T-175 e incubare per 3 giorni a 37 °C in un incubatore umidificato con CO₂ al 5% (vedere Tabella 1).
   6. Dopo 3 giorni, raccogliere il terreno condizionato in una conica da 50 mL e centrifugare a 1.100 × g per 5 minuti a 4 °C. Raccogliere il surnatante (terreno condizionato), assicurandosi che rimangano 5 mL.
   7. Aggiungere 75 mL freschi di terreno di coltura cellulare primaria a ciascun pallone a 3 strati T-175 e incubare per altri 3 giorni per raccogliere ulteriore terreno condizionato.
   8. Al terreno condizionato raccolto, aggiungere un volume uguale di terreno di coltura cellulare primaria (50% del volume) e filtrare sotto vuoto il contenuto utilizzando un filtro da 0,22 μm. Conservare le aliquote in provette da 50 mL e conservare a -20 °C per un uso a lungo termine o a 4 °C per un massimo di 2-3 settimane. Utilizzare questo terreno per integrare i terreni di coltura degli organoidi (vedere la Tabella 1).
      NOTA: Scongelare le aliquote a 4 °C durante la notte prima dell'uso.
3. Raccolta della miscela cellulare da tessuto fresco di melanoma
   1. Lavare il tessuto del melanoma appena resecato in una piastra di Petri da 10 ml contenente terreno di lavaggio. Dopo il primo risciacquo, utilizzare una pinzetta sterile per trasferire il tumore in una seconda piastra di Petri per un ulteriore lavaggio e ripetere questo processo 3 volte su ghiaccio per preservare l'integrità e la vitalità del tumore. Durante questi cicli di risciacquo, utilizzare forbici sterili e una lama per rimuovere il tessuto connettivo in eccesso, il grasso e il sangue residuo. Dopo i tre lavaggi, posizionare il tumore in una capsula di Petri vuota e utilizzare lame sterili per tritarlo finemente.
      NOTA: Dopo la macinazione, il tumore dovrebbe mostrare una consistenza gelatinosa. Più fine è la macinazione del tumore, maggiore sarà la resa cellulare. Questo perché i grumi più grandi del tumore saranno più difficili da digerire e potrebbero non passare attraverso il filtro cellulare in nylon da 70 μm nella fase successiva.
   2. Una volta che il tessuto tumorale è stato accuratamente lavato e tritato, trasferirlo in una provetta conica da 50 mL contenente 10 mL del mezzo di digestione preparato (vedere Tabella 1). Mettere il conico a bagnomaria a 37 °C, assicurandosi che il contenuto venga agitato ogni 5 minuti.
   3. Dopo 25 minuti, aggiungere 30 ml di terreno ADMEM/F12 contenente il 10% di FBS per arrestare la digestione.
      NOTA: Queste quantità specificate sono destinate a tumori di peso non superiore a 0,2 g.
   4. Filtrare la sospensione cellulare digerita attraverso un colino cellulare in nylon da 70 μm, quindi sciacquare il filtro con ADMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1) contenente il 10% di FBS. Dopo la fase di lavaggio, utilizzare una pipetta per recuperare il terreno rimanente sul fondo del filtro per garantire che venga recuperato il maggior numero possibile di cellule. Quindi, centrifugare a 300 × g per 7 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere il pellet nel terreno di coltura dell'organoide (vedi Tabella 1).
   5. Coltura della sospensione unicellulare di melanoma in sistemi di coltura Matrigel o collagene:
      1. Matrigel: Contare la sospensione unicellulare per assicurarsi che circa 2 × 10⁵ cellule vengano seminate nei pozzetti preriscaldati rivestiti di Matrigel integrati con 200 μL di terreno di coltura di organoidi.
         NOTA: Gli organoidi a base di Matrigel sono utilizzati per studiare la fisiopatologia, lo screening dell'efficacia dei farmaci e la tossicità dei farmaci¹⁶.
      2. Gel di collagene: Contare la sospensione unicellulare per assicurarsi che circa 10-6 cellule vengano miscelate con 1 ml di gel di collagene. Aggiungere la miscela agli inserti della membrana in gel di collagene pre-solidificato e metterli in una piastra a 6 pozzetti. Aggiungere una quantità sufficiente di terreno di coltura di organoidi per immergere gli inserti contenenti le cellule e il gel di collagene.
         NOTA: Gli organoidi in gel di collagene vengono utilizzati per misurare la migrazione delle cellule T e studiare lo sviluppo dei tessuti¹⁶.
   6. Lasciare crescere gli organoidi assicurandosi che venga aggiunto un terreno fresco ogni 3 giorni.
   7. Passare gli organoidi una volta che raggiungono le dimensioni di 150-200 μm o crioconservarli fino a nuovo utilizzo.
      1. Per il passaggio degli organoidi, trasferire gli organoidi in un conico da 15 mL e lavare con 1x DPSB. Centrifugare la miscela a 300 × g per 7 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante e aggiungere il sostituto della tripsina (50-100 μl per organoide) per 10 minuti a bagnomaria a 37 °C, assicurandosi che il contenuto venga agitato ogni 3 minuti.
      2. Arrestare la digestione utilizzando il terreno di base a siero ridotto ADMEM/F12 (1x) (1:1) contenente il 10% di FBS. Centrifugare la miscela a 300 × g per 7 minuti e risospendere in terreno di coltura di organoidi.
      3. Seminare la sospensione a singola cellula in un nuovo pozzetto rivestito di Matrigel/Collagene alla stessa densità di semina iniziale (2 × 10⁵ cellule in 200 μL di terreno di coltura per organoidi per pozzetti rivestiti di Matrigel in una piastra da 48 pozzetti o 10⁶ cellule in 1 mL di terreno di coltura per organoidi per inserto di membrana interna da 30 mm rivestito di collagene).
      4. Per la crioconservazione, digerire le MPDO utilizzando il sostituto della tripsina in sospensioni unicellulari seguite dalla risospensione di^10-6 cellule in 1 mL di terreno di congelamento (vedere Tabella 1).

Risultati

La forma e le dimensioni delle MPDO sono state monitorate nel tempo per studiarne le dinamiche di crescita. Come si vede nella Figura 2, durante il periodo di crescita iniziale, la dimensione dell'organoide è aumentata sostanzialmente durante i 7 giorni raffigurati. A seguito dell'osservazione delle dinamiche di crescita dell'MPDO, l'attenzione si è rivolta alla valutazione della composizione delle cellule immunitarie per verificare la fedele ricapitolazio...

Discussione

L'emergere delle PDO ha affrontato molteplici limitazioni poste da altri metodi di ricerca sul cancro precedentemente stabiliti, introducendo al contempo potenziali applicazioni trasformative nel campo. Questa tecnologia di organoidi è stata inizialmente proposta nel 2009 da Hans Clevers e colleghi, che sono stati in grado di stabilire con successo un sistema di coltura di organoidi intestinali coltivando cellule staminali Lgr5⁺ derivate dall'intestino di topi in un gel matri...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Red Cap Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial	Corning	431420
50 mL Polypropylene Conical Tube	Corning	352070
100 mm TC-treated Cell Culture Dish	Corning	353003
105 mm Polystyrene Forceps Sterile	Caplugs Evergreen	222-1121-B1I
150 cm2 Cell Culture Flask	Corning	CLS430825
A83-01	Tocris	2939
Advanced DMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1)	Gibco	12634-010
B-27 Supplement (50x)	Gibco	17504-044
Brilliant Violet 510 anti-human Perforin Antibody	BioLegend	308120
Brilliant Violet 605 anti-human Ki-67 Antibody	BioLegend	350522
Brilliant Violet 650 anti-human CD366 (Tim-3) Antibody	BioLegend	345028
Brilliant Violet 711 anti-human CD45 Antibody	BioLegend	304050
Cell Culture Inserts 0.4 µm, 30 mm Diameter	Millipore Sigma	PIHP03050
Cell Staining Buffer	BioLegend	420201
Cell Strainer 40 µm Nylon	Corning	352340
Cell Strainer 70 µm Nylon	Corning	352350
Collagenase, Type IV, powder	Gibco	17104019
Cultrex Rat Collagen I	Trevigen	3440-100-01
Culture Plate, PS, 48 wells, TC treated with lid, sterile	Max Scientific	07-6048
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM - high glucose 4.5 mg/mL	Corning	MT10-0130CV
Dnase I - Grade II	Millipore Sigma	10104159001
DPBS, 1%	Corning	21-031-CV
Fetal Bovine Serum, FBS	Corning	MT35-010-CV
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I	BD Biosciences	556547
Forskolin	Tocris	1099
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)	ThermoFisher	10131035
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher	35050061
Ham's F12 Nutrient Mix	ThermoFisher	11765054
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Hygromycin B (50 mg/mL)	ThermoFisher	10687010
L-Glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-081
L-WRN cell	ATCC	CRL-3276
Matrigel Phenol Free & Growth Fact. Reduced	Corning	356231
Millex PVDF syringe filter, 0.22 μM	Millipore Sigma	SLGVR33RB
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-100G
Nunc TripleFlask Treated Cell Culture Flask	ThermoFisher	132867
PE/Cyanine5 anti-human CD8a Antibody	BioLegend	301010
PE-Cy 7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)	BD Biosciences	561272
Pen Strep	Gibco	15140-122
Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15-1MG
Recombinant Human FGF-acidic	Peprotech	100-17A
Sodium Bicarbonate Solution (NaHCO3) (7.5%)	Quality Biological	118-085-721
Stainless Steel Surgical Blades no. 22	Integra	4-322
TrypLE Express	Gibco	12604-021