흑색종 환자 유래 오가노이드 모델을 통한 치료 기회 발굴

요약

여기에서는 신선한 흑색종 조직에서 분리된 세포 현탁액을 배양하여 흑색종 환자 유래 오가노이드를 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 오가노이드는 in vitro 에서 환자 특이적 종양을 충실하게 재현하여 종양 면역억제 메커니즘, 약물 스크리닝, 약물 내성 메커니즘 및 암 감시 접근법을 탐구하기 위한 혁신적인 접근 방식을 제공합니다.

초록

면역 요법이 개발됨에 따라 자연 종양의 종양 미세환경을 재현할 수 있는 모델을 개발해야 할 필요성이 지속적으로 증가하고 있습니다. 기존의 2차원 및 3차원 모델은 암의 발병 및 진행에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 이러한 모델은 토착 종양의 충실한 모방을 방해하는 중요한 측면이 부족합니다. 많은 주목을 받고 있는 대안 모델은 환자 유래 오가노이드(Patient-derived organoid)입니다. 이러한 오가노이드의 개발은 종양의 복잡한 세포 간 통신, 종양 미세환경 및 조직 구조를 요약합니다. 이 논문은 흑색종 환자 유래 오가노이드(MPDO) 모델을 확립하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이러한 모델을 검증하기 위해 T 세포 활성화 마커의 발현 수준을 포함한 면역 세포 구성을 평가하여 오가노이드의 세포 이질성을 확인했습니다. 또한 세포 치료에서 MPDO의 잠재적 유용성을 설명하기 위해 γδ T 세포로 오가노이드를 처리하는 세포독성 능력을 평가했습니다. 결론적으로, MPDO 모델은 종양의 복잡성을 이해하고, 치료 전략을 검증하며, 잠재적으로 개인화된 치료를 발전시킬 수 있는 유망한 방법을 제공합니다.

서문

기존의 2-D 세포 배양 모델은 암 진행 및 치료를 연구하기 위한 암 연구에서 필수적인 도구입니다¹. 이러한 모델은 암 발병 및 진행의 기저에 있는 분자 및 세포 메커니즘을 조사하기 위해 통제된 실험 조건을 허용할 뿐만 아니라 비용 효율적이고 상대적으로 빠른 실험 결과를 제공합니다. 그러나 종양 미세환경(TME)의 제한된 세포 다양성으로 인해 사용이 제한되며, 이는 단일 배양 모델²의 동일 평면적 특성으로 요약할 수 없습니다. 또한, 세포 배양 모델은 인체에 비해 지나치게 단순화된 환경을 제공한다³. 따라서 암의 진행을 더 잘 이해하고 효과적인 치료법을 개발하기 위해 연구자들은 자연에서 TME를 면밀히 재현하는 것을 목표로 하는 혁신적인 모델로 눈을 돌렸습니다. 결과적으로, 이러한 모델에서는 토착 종양에 대한 충실도를 유지하는 것이 가장 중요합니다. 암의 복잡한 특성을 감안할 때, 원래 종양에서 크게 벗어나면 종양 행동에 대한 의미 있는 결론을 혼란스럽게 할 수 있는 예상치 못한 변수가 발생할 수 있습니다.

환자 유래 이종이식(PDX)은 생체 내에....

프로토콜

인간 흑색종 조직은 펜실베니아 대학의 기관 검토 위원회(Institutional Review Board)에서 승인한 조직 수집 프로토콜(UPCC08607)을 사용하여 펜실베니아 대학에서 치료를 받는 환자로부터 얻었습니다. 모든 환자는 정보에 입각한 동의서에 서명했습니다. 인간 흑색종 조직을 절제한 후 종양 조직을 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)에 넣고 처리할 때까지(6시간 이내) 4°C에서 유지합니다. 흑색종 환자 유래 오가노이드(MPDO)는 그림 1과 같이 새로운 종양에서 파생되었습니다.

1. 인간 흑색종 조직에서 세포의 분리

1. 수속 시작 전의 준비 사항
   참고: 두 가지 배양 방법(Matrigel 및 콜라겐 겔)을 사용하여 해리된 흑색종 조직을 배양할 수 있습니다.
   1. Matrigel 방법의 경우: GFR Basement Membrane Matrix를 오가노이드 배양 배지( 표 1 참조)로 1:2 비율로 희석하여 GFR(Growth Factor Reduction) Base....

토론

PDO의 출현은 이전에 확립된 다른 암 연구 방법으로 인해 제기된 여러 가지 한계를 해결하는 동시에 이 분야에서 혁신적인 잠재적 응용 프로그램을 도입했습니다. 이 오가노이드 기술은 2009년 한스 클레버스(Hans Clevers)와 동료들에 의해 처음 제안되었으며, R-스폰신, EGF 및 Noggin 인자²⁰을 포함하는 3D 매트릭스 겔에서 마우스의 장에서 유래한 Lgr5⁺ ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Red Cap Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial	Corning	431420
50 mL Polypropylene Conical Tube	Corning	352070
100 mm TC-treated Cell Culture Dish	Corning	353003
105 mm Polystyrene Forceps Sterile	Caplugs Evergreen	222-1121-B1I
150 cm2 Cell Culture Flask	Corning	CLS430825
A83-01	Tocris	2939
Advanced DMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1)	Gibco	12634-010
B-27 Supplement (50x)	Gibco	17504-044
Brilliant Violet 510 anti-human Perforin Antibody	BioLegend	308120
Brilliant Violet 605 anti-human Ki-67 Antibody	BioLegend	350522
Brilliant Violet 650 anti-human CD366 (Tim-3) Antibody	BioLegend	345028
Brilliant Violet 711 anti-human CD45 Antibody	BioLegend	304050
Cell Culture Inserts 0.4 µm, 30 mm Diameter	Millipore Sigma	PIHP03050
Cell Staining Buffer	BioLegend	420201
Cell Strainer 40 µm Nylon	Corning	352340
Cell Strainer 70 µm Nylon	Corning	352350
Collagenase, Type IV, powder	Gibco	17104019
Cultrex Rat Collagen I	Trevigen	3440-100-01
Culture Plate, PS, 48 wells, TC treated with lid, sterile	Max Scientific	07-6048
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM - high glucose 4.5 mg/mL	Corning	MT10-0130CV
Dnase I - Grade II	Millipore Sigma	10104159001
DPBS, 1%	Corning	21-031-CV
Fetal Bovine Serum, FBS	Corning	MT35-010-CV
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I	BD Biosciences	556547
Forskolin	Tocris	1099
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)	ThermoFisher	10131035
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher	35050061
Ham's F12 Nutrient Mix	ThermoFisher	11765054
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Hygromycin B (50 mg/mL)	ThermoFisher	10687010
L-Glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-081
L-WRN cell	ATCC	CRL-3276
Matrigel Phenol Free & Growth Fact. Reduced	Corning	356231
Millex PVDF syringe filter, 0.22 μM	Millipore Sigma	SLGVR33RB
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-100G
Nunc TripleFlask Treated Cell Culture Flask	ThermoFisher	132867
PE/Cyanine5 anti-human CD8a Antibody	BioLegend	301010
PE-Cy 7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)	BD Biosciences	561272
Pen Strep	Gibco	15140-122
Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15-1MG
Recombinant Human FGF-acidic	Peprotech	100-17A
Sodium Bicarbonate Solution (NaHCO3) (7.5%)	Quality Biological	118-085-721
Stainless Steel Surgical Blades no. 22	Integra	4-322
TrypLE Express	Gibco	12604-021