흑색종 환자 유래 오가노이드 모델을 통한 치료 기회 발굴

요약

여기에서는 신선한 흑색종 조직에서 분리된 세포 현탁액을 배양하여 흑색종 환자 유래 오가노이드를 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 오가노이드는 in vitro 에서 환자 특이적 종양을 충실하게 재현하여 종양 면역억제 메커니즘, 약물 스크리닝, 약물 내성 메커니즘 및 암 감시 접근법을 탐구하기 위한 혁신적인 접근 방식을 제공합니다.

초록

면역 요법이 개발됨에 따라 자연 종양의 종양 미세환경을 재현할 수 있는 모델을 개발해야 할 필요성이 지속적으로 증가하고 있습니다. 기존의 2차원 및 3차원 모델은 암의 발병 및 진행에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 이러한 모델은 토착 종양의 충실한 모방을 방해하는 중요한 측면이 부족합니다. 많은 주목을 받고 있는 대안 모델은 환자 유래 오가노이드(Patient-derived organoid)입니다. 이러한 오가노이드의 개발은 종양의 복잡한 세포 간 통신, 종양 미세환경 및 조직 구조를 요약합니다. 이 논문은 흑색종 환자 유래 오가노이드(MPDO) 모델을 확립하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이러한 모델을 검증하기 위해 T 세포 활성화 마커의 발현 수준을 포함한 면역 세포 구성을 평가하여 오가노이드의 세포 이질성을 확인했습니다. 또한 세포 치료에서 MPDO의 잠재적 유용성을 설명하기 위해 γδ T 세포로 오가노이드를 처리하는 세포독성 능력을 평가했습니다. 결론적으로, MPDO 모델은 종양의 복잡성을 이해하고, 치료 전략을 검증하며, 잠재적으로 개인화된 치료를 발전시킬 수 있는 유망한 방법을 제공합니다.

서문

기존의 2-D 세포 배양 모델은 암 진행 및 치료를 연구하기 위한 암 연구에서 필수적인 도구입니다¹. 이러한 모델은 암 발병 및 진행의 기저에 있는 분자 및 세포 메커니즘을 조사하기 위해 통제된 실험 조건을 허용할 뿐만 아니라 비용 효율적이고 상대적으로 빠른 실험 결과를 제공합니다. 그러나 종양 미세환경(TME)의 제한된 세포 다양성으로 인해 사용이 제한되며, 이는 단일 배양 모델²의 동일 평면적 특성으로 요약할 수 없습니다. 또한, 세포 배양 모델은 인체에 비해 지나치게 단순화된 환경을 제공한다³. 따라서 암의 진행을 더 잘 이해하고 효과적인 치료법을 개발하기 위해 연구자들은 자연에서 TME를 면밀히 재현하는 것을 목표로 하는 혁신적인 모델로 눈을 돌렸습니다. 결과적으로, 이러한 모델에서는 토착 종양에 대한 충실도를 유지하는 것이 가장 중요합니다. 암의 복잡한 특성을 감안할 때, 원래 종양에서 크게 벗어나면 종양 행동에 대한 의미 있는 결론을 혼란스럽게 할 수 있는 예상치 못한 변수가 발생할 수 있습니다.

환자 유래 이종이식(PDX)은 생체 내에서 종양 진행을 모니터링할 수 있는 모델 시스템으로 부상했지만, 개발된 종양이 인간의 암 생물학을 얼마나 잘 재현하는지에 의문을 제기하는 한계가 있다⁴. 예를 들어, 흑색종 TME에는 종양 침윤 면역 세포와 기질 세포가 포함되어 있습니다. 이종이식으로 통과하면 환자의 비암 세포가 점차 소실되어 환자 종양의 적응과 다른 적응을 선택할 수 있습니다. 이러한 제한은 in vivo PDX의 제한된 통로를 수행함으로써 완화될 수 있지만, 종 간의 차이는 여전히 PDX에 대한 유전적 변화가 본래 종양의 그것에서 벗어나는 유전적 변화의 위험을 제기할 수 있다⁵. 또한, PDX 모델은 일반적으로 인체 조직의 거부 반응을 방지하기 위해 면역력이 저하된 마우스에서 확립됩니다. 이는 암에서 숙주 면역 체계의 역할을 연구하는 능력을 제한하며, 특히 면역 치료 연구에서 그렇다⁶. 우리와 다른 연구자들은 PDX를 "인간화된" 마우스에 생착시켰다 ^7,8. 그러나 인간화된 마우스에서 PDX 모델을 구축하는 것은 시간과 비용이 많이 듭니다. 환자의 종양 표본에서 단일 PDX 모델을 개발하는 데 몇 개월에서 몇 년이 걸릴 수 있으므로 연구의 속도와 규모가 제한될 수 있습니다. 이러한 한계에도 불구하고 PDX 모델은 TME의 생물학을 정확하게 나타내는 것으로 나타났으며, 따라서 암 치료제, 맞춤형 의학 및 면역 요법 등의 개발에 광범위하게 사용되어 왔다⁹.

현재 부상한 대안적인 3D 배양 기법은 환자 유래 오가노이드(PDO)로, 갓 절제된 환자 종양을 배양하여 표현형 이질성, 조직구조 및 세포 간 통신을 유지하는 모델을 생성한다¹⁰. 비근육 침습성(NMIBC) 및 근육 침습성 방광암(MIBC)의 배양 오가노이드가 모체 종양의 주요 측면을 성공적으로 재현한 경우 토착 종양과 매우 유사할 수 있는 능력이 이전에 입증되었습니다¹¹. 다른 모델에 비해 잠재력과 장점으로 인해 PDO는 세포 및 표적 치료제와 함께 면역 관문 억제제의 연구 및 개발을 포함하되 이에 국한되지 않고 다른 모델에는 없는 다양한 맞춤형 응용 프로그램을 제공합니다. 예를 들어, 이전에 흑색종 환자 유래 오가노이드(MPDO)를 사용하여 종양 침윤 림프구(TIL)가 IL-2 및 항 PD1 항체(αPD-1)에 의해 확장되는 능력을 연구했습니다. 그 결과, IL-2 및 αPD-1에 의해 증식된 TIL은 그 수가 더 많았을 뿐만 아니라 다른 방법을 사용하여 증식된 TIL보다 더 높은 효율로 MPDO에 성공적으로 침투하여 흑색종 세포를 죽일 수 있는 것으로 나타났다¹². 다른 그룹에서도 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1의 사용이 TIL이 PDO에서 기능을 유지하여 종양 사멸로 이어지는 유사한 결과를 보였다¹³. 또한, 우리 그룹은 MPDO를 사용하여 γδ T 세포 침투 및 사멸 능력을 평가했습니다¹⁴. PDO의 적용 가능성은 TIL 확장, 세포 독성 연구 및 저분자 스크리닝을 포함한 광범위한 영역에 걸쳐 있습니다. 이러한 모든 응용 프로그램은 이 모델이 제공하는 잠재력과 유용성을 강조합니다. 따라서 MPDO 문화에 대한 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다.

프로토콜

인간 흑색종 조직은 펜실베니아 대학의 기관 검토 위원회(Institutional Review Board)에서 승인한 조직 수집 프로토콜(UPCC08607)을 사용하여 펜실베니아 대학에서 치료를 받는 환자로부터 얻었습니다. 모든 환자는 정보에 입각한 동의서에 서명했습니다. 인간 흑색종 조직을 절제한 후 종양 조직을 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)에 넣고 처리할 때까지(6시간 이내) 4°C에서 유지합니다. 흑색종 환자 유래 오가노이드(MPDO)는 그림 1과 같이 새로운 종양에서 파생되었습니다.

1. 인간 흑색종 조직에서 세포의 분리

1. 수속 시작 전의 준비 사항
   참고: 두 가지 배양 방법(Matrigel 및 콜라겐 겔)을 사용하여 해리된 흑색종 조직을 배양할 수 있습니다.
   1. Matrigel 방법의 경우: GFR Basement Membrane Matrix를 오가노이드 배양 배지( 표 1 참조)로 1:2 비율로 희석하여 GFR(Growth Factor Reduction) Basement Membrane Matrix의 코팅 용액을 제조합니다. 약 115μL의 해동된 용액을 48웰 플레이트의 여러 웰 각각에 추가하고 가습 인큐베이터에서 37°C에서 30분 동안 응고되도록 둡니다.
   2. 콜라겐 겔 방법의 경우: 1mL의 콜라겐 겔( 표 1 참조)을 30mm 내부 멤브레인 삽입물에 추가합니다. 겔을 가습 인큐베이터에서 37°C에서 30분 동안 응고시킵니다.
2. L-WRN 컨디셔닝 매체¹⁵를 준비합니다. L-WRN 컨디셔닝 배지는 Wnt3a, R-spondin 3 및 Noggin을 세포 배양에 널리 사용되는 단일 컨디셔닝 배지로 분비하도록 설계된 L-WRN 세포주에서 생산됩니다.
   1. L-WRN 세포의 극저온관을 37°C 수조에서 해동합니다. 5mL의 L-cell 배지( 표 1 참조)와 L-WRN cell suspension을 15mL 코니컬 튜브에 넣고 120× g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하여 세포의 펠릿을 재현탁시키기 위해 ~500μL가 바닥에 남아 있도록 합니다.
   2. 상층액의 세포 펠릿을 얼음 위의 L-세포 배지 30mL에 옮기고 150μL의 하이그로마이신(500μg/mL)과 300μL의 G418(500μg/mL)을 추가합니다. T-150 플라스크에 3 × 10⁶ 밀도로 세포를 파종하고 37 ° C에서 5 % CO₂ 가 있는 가습 인큐베이터에서 ~ 90 % 합류 할 때까지 배양합니다.
   3. 세포가 ~90% 합류하면 20mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척하고 흡인하고 3mL의 트립신 대체품으로 분해하여 세포를 5개의 T-150 플라스크로 분할합니다. 5분 후 9mL의 L-세포 배지로 중화한 후 4°C에서 120× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. ~100% 합류하면 5개의 T-150 플라스크를 10개의 T-175 3층 플라스크로 나눕니다.
   4. 합류하면 2 x 50mL의 PBS로 세포를 세척한 다음 25mL의 세척 매체로 세척합니다( 표 1 참조).
   5. 각 T-175 3층 플라스크에 75mL의 1차 배양 배지를 추가하고 5%_CO2 가 있는 가습 인큐베이터에서 37°C에서 3일 동안 배양합니다( 표 1 참조).
   6. 3일 후 조절된 배지를 50mL 원뿔형으로 수확하고 1,100× g 에서 4°C에서 5분 동안 회전시킵니다. 상층액(조절된 배지)을 수집하여 5mL가 남았는지 확인합니다.
   7. 각 T-175 3층 플라스크에 새로운 75mL의 1차 세포 배양 배지를 추가하고 추가로 3일 동안 배양하여 추가 조절 배지를 수집합니다.
   8. 수집된 컨디셔닝된 배지에 동일한 부피의 1차 세포 배양 배지(50% 부피)를 추가하고 0.22μm 필터를 사용하여 내용물을 진공 여과합니다. 부분 표본을 50mL 튜브에 보관하고 -20°C에서 장기간 사용하거나 4°C에서 최대 2-3주 동안 보관합니다. 이 배지를 사용하여 오가노이드 배양 배지를 보완합니다( 표 1 참조).
      참고: 사용하기 전에 4°C에서 밤새 부분 표본을 해동하십시오.
3. 신선한 흑색종 조직에서 세포 혼합물 채취
   1. 세척제가 들어있는 10mL 페트리 접시에 갓 절제 된 흑색종 조직을 세척하십시오. 첫 번째 헹굼 후 멸균 핀셋을 사용하여 종양을 두 번째 페트리 접시로 옮겨 추가 세척을 위해 하고 이 과정을 얼음에서 3번 반복하여 종양 무결성과 생존력을 보존합니다. 이 헹굼 주기 동안 멸균 가위와 칼날을 사용하여 과도한 결합 조직, 지방 및 잔류 혈액을 제거하십시오. 세 번 씻은 후 종양을 빈 페트리 접시에 넣고 멸균 칼날을 사용하여 잘게 다집니다.
      참고: 다진 후 종양은 젤과 같은 농도를 보여야 합니다. 종양의 잘게 잘게 잘릴수록 세포 수율이 높아집니다. 이는 종양의 큰 덩어리가 소화하기가 더 어렵고 후속 단계에서 70μm 나일론 세포 여과기를 통과하지 못할 수 있기 때문입니다.
   2. 종양 조직을 철저히 세척하고 다진 후에는 준비된 분해 배지 10mL가 들어 있는 50mL 원추형 튜브에 넣습니다( 표 1 참조). 원뿔형을 37°C의 수조에 넣고 내용물이 5분마다 소용돌이치도록 합니다.
   3. 25분 후 10% FBS가 함유된 ADMEM/F12 배지 30mL를 추가하여 분해를 중지합니다.
      참고: 이 지정된 수량은 무게가 0.2g 이하인 종양을 위한 것입니다.
   4. 70μm 나일론 세포 여과기를 통해 분해된 세포 현탁액을 여과한 다음 10% FBS를 함유한 ADMEM/F12(1x) Reduced Serum Medium(1:1)으로 여과기를 헹굽니다. 세척 단계에 따라 피펫을 사용하여 필터 바닥에 남아 있는 매체를 회수하여 가능한 가장 많은 수의 세포를 회수할 수 있도록 합니다. 그런 다음 300× g 에서 4°C에서 7분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 펠릿을 오가노이드 배양 배지에 재현탁시킵니다( 표 1 참조).
   5. Matrigel 또는 콜라겐 배양 시스템에서 흑색종 단세포 현탁액을 배양합니다.
      1. Matrigel: 단일 세포 현탁액을 계산하여 약 2 × 10⁵ 세포가 200μL의 오가노이드 배양 배지가 보충된 예열된 Matrigel 코팅 웰에 파종되도록 합니다.
         참고: Matrigel 기반 오가노이드는 병태생리학을 연구하고, 약물 효능을 스크리닝하고, 약물 독성을 테스트하는 데 사용됩니다¹⁶.
      2. 콜라겐 겔: 단일 세포 현탁액을 계산하여 약 10⁶ 개의 세포가 1mL의 콜라겐 젤과 혼합되도록 합니다. 혼합물을 사전 응고된 콜라겐 겔 멤브레인 인서트에 추가하고 6웰 플레이트에 넣습니다. 세포와 콜라겐 겔이 들어있는 삽입물을 잠길 수 있을 만큼 충분한 오가노이드 배양 배지를 추가합니다.
         참고: 콜라겐 젤 오가노이드는 T 세포 이동을 측정하고 조직 발달을 연구하는 데 사용됩니다¹⁶.
   6. 오가노이드가 자라도록 하면서 3일마다 새로운 배지가 추가되도록 합니다.
   7. 크기가 150-200 μm에 도달하면 오가노이드를 통과시키거나 나중에 사용할 때까지 냉동 보존합니다.
      1. 오가노이드를 통과시키기 위해 오가노이드를 15mL 원뿔형으로 옮기고 1x DPSB로 세척합니다. 혼합물을 300× g 에서 4°C에서 7분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 트립신 대체품(오가노이드당 50-100μL)을 37°C 수조에서 10분 동안 추가하여 내용물이 3분마다 소용돌이치도록 합니다.
      2. 10% FBS를 함유한 ADMEM/F12(1x) Reduced Serum Medium(1:1) 배지를 사용하여 소화를 중단합니다. 혼합물을 300 × g 에서 7분 동안 원심분리하고 오가노이드 배양 배지에 재현탁합니다.
      3. 단일 세포 현탁액을 동일한 초기 파종 밀도(48 웰 플레이트의 Matrigel 코팅 웰의 경우 200 μL의 오가노이드 배양 배지에 2 × 10,⁵ 개의 세포 또는 콜라겐 코팅된 30mm 내부 멤브레인 인서트의 경우 1mL의 오가노이드 배양 배지에 10⁶ 개의 세포)로 파종합니다.
      4. 동결 보존을 위해 트립신 대체물을 사용하여 MPDO를 단일 세포 현탁액으로 분해한 후 10⁶ 개 세포를 1mL의 동결 배지에 재현탁시킵니다( 표 1 참조).

결과

MPDO의 모양과 크기는 성장 역학을 연구하기 위해 시간이 지남에 따라 모니터링되었습니다. 그림 2에서 볼 수 있듯이 초기 성장 기간 동안 오가노이드 크기는 표시된 7일 동안 크게 증가했습니다. MPDO 성장 역학을 관찰한 후, 오가노이드가 원래 종양에 충실하게 재현되어 있는지 확인하기 위해 면역 세포 구성을 평가하는 데 관심이 쏠렸습니다. 주로 ?...

토론

PDO의 출현은 이전에 확립된 다른 암 연구 방법으로 인해 제기된 여러 가지 한계를 해결하는 동시에 이 분야에서 혁신적인 잠재적 응용 프로그램을 도입했습니다. 이 오가노이드 기술은 2009년 한스 클레버스(Hans Clevers)와 동료들에 의해 처음 제안되었으며, R-스폰신, EGF 및 Noggin 인자²⁰을 포함하는 3D 매트릭스 겔에서 마우스의 장에서 유래한 Lgr5⁺ ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Red Cap Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial	Corning	431420
50 mL Polypropylene Conical Tube	Corning	352070
100 mm TC-treated Cell Culture Dish	Corning	353003
105 mm Polystyrene Forceps Sterile	Caplugs Evergreen	222-1121-B1I
150 cm2 Cell Culture Flask	Corning	CLS430825
A83-01	Tocris	2939
Advanced DMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1)	Gibco	12634-010
B-27 Supplement (50x)	Gibco	17504-044
Brilliant Violet 510 anti-human Perforin Antibody	BioLegend	308120
Brilliant Violet 605 anti-human Ki-67 Antibody	BioLegend	350522
Brilliant Violet 650 anti-human CD366 (Tim-3) Antibody	BioLegend	345028
Brilliant Violet 711 anti-human CD45 Antibody	BioLegend	304050
Cell Culture Inserts 0.4 µm, 30 mm Diameter	Millipore Sigma	PIHP03050
Cell Staining Buffer	BioLegend	420201
Cell Strainer 40 µm Nylon	Corning	352340
Cell Strainer 70 µm Nylon	Corning	352350
Collagenase, Type IV, powder	Gibco	17104019
Cultrex Rat Collagen I	Trevigen	3440-100-01
Culture Plate, PS, 48 wells, TC treated with lid, sterile	Max Scientific	07-6048
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM - high glucose 4.5 mg/mL	Corning	MT10-0130CV
Dnase I - Grade II	Millipore Sigma	10104159001
DPBS, 1%	Corning	21-031-CV
Fetal Bovine Serum, FBS	Corning	MT35-010-CV
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I	BD Biosciences	556547
Forskolin	Tocris	1099
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)	ThermoFisher	10131035
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher	35050061
Ham's F12 Nutrient Mix	ThermoFisher	11765054
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Hygromycin B (50 mg/mL)	ThermoFisher	10687010
L-Glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-081
L-WRN cell	ATCC	CRL-3276
Matrigel Phenol Free & Growth Fact. Reduced	Corning	356231
Millex PVDF syringe filter, 0.22 μM	Millipore Sigma	SLGVR33RB
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-100G
Nunc TripleFlask Treated Cell Culture Flask	ThermoFisher	132867
PE/Cyanine5 anti-human CD8a Antibody	BioLegend	301010
PE-Cy 7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)	BD Biosciences	561272
Pen Strep	Gibco	15140-122
Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15-1MG
Recombinant Human FGF-acidic	Peprotech	100-17A
Sodium Bicarbonate Solution (NaHCO3) (7.5%)	Quality Biological	118-085-721
Stainless Steel Surgical Blades no. 22	Integra	4-322
TrypLE Express	Gibco	12604-021