Presentación de oportunidades terapéuticas con modelos de organoides derivados de pacientes con melanoma

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para generar organoides derivados de pacientes con melanoma mediante el cultivo de suspensiones celulares disociadas de tejidos frescos de melanoma. Estos organoides recapitulan fielmente los tumores específicos del paciente in vitro, lo que ofrece un enfoque innovador para explorar los mecanismos inmunosupresores de tumores, la detección de fármacos, los mecanismos de resistencia a los medicamentos y los enfoques de vigilancia del cáncer.

Resumen

Con el desarrollo de la inmunoterapia, existe una necesidad continua de desarrollar modelos que puedan recapitular el microambiente tumoral de los tumores nativos. Si bien los modelos bidimensionales y tridimensionales tradicionales pueden ofrecer información sobre el desarrollo y la progresión del cáncer, carecen de aspectos cruciales que dificulten una imitación fiel de los tumores nativos. Un modelo alternativo que ha ganado mucha atención es el organoide derivado del paciente. El desarrollo de estos organoides recapitula la compleja comunicación intercelular, el microambiente tumoral y la histoarquitectura de los tumores. En este artículo se describe el protocolo para establecer modelos de organoides derivados de pacientes con melanoma (MPDO). Para validar estos modelos, evaluamos la composición de las células inmunitarias, incluidos los niveles de expresión de los marcadores de activación de las células T, para confirmar la heterogeneidad celular de los organoides. Además, para describir la utilidad potencial de los MPDOs en terapias celulares, evaluamos las capacidades citotóxicas del tratamiento de los organoides con linfocitos T γδ. En conclusión, los modelos MPDO ofrecen vías prometedoras para comprender la complejidad tumoral, validar estrategias terapéuticas y, potencialmente, avanzar en el tratamiento personalizado.

Introducción

Los modelos convencionales de cultivo celular en 2D son herramientas esenciales en la investigación del cáncer para estudiar la progresión y el tratamiento del cáncer¹. Estos modelos no solo permiten condiciones experimentales controladas para investigar los mecanismos moleculares y celulares que subyacen al desarrollo y la progresión del cáncer, sino que también proporcionan resultados experimentales rentables y relativamente rápidos. Su uso, sin embargo, está restringido debido a la limitada diversidad celular en el microambiente tumoral (TME), que no puede recapitularse en la naturaleza coplanar de los model....

Protocolo

Los tejidos de melanoma humano se obtuvieron de pacientes que recibían tratamiento en la Universidad de Pensilvania utilizando el protocolo de recolección de tejidos (UPCC08607) aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Pensilvania. Todos los pacientes han firmado el consentimiento informado. Después de la resección de los tejidos de melanoma humano, el tejido tumoral se coloca en el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y se mantiene a 4 °C hasta el procesamiento (dentro de las 6 h). Los organoides derivados del paciente con melanoma (MPDO) se derivaron de un tumor reciente, como se ilustra en la

Resultados

La forma y el tamaño de los MPDOs fueron monitoreados a lo largo del tiempo para estudiar su dinámica de crecimiento. Como se observa en la Figura 2, durante el período de crecimiento inicial, el tamaño del organoide aumentó sustancialmente a lo largo de los 7 días representados. Tras la observación de la dinámica de crecimiento de la MPDO, la atención se centró en la evaluación de la composición de las células inmunitarias para verificar la fie.......

Discusión

La aparición de las PDOs ha abordado las múltiples limitaciones planteadas por otros métodos de investigación del cáncer previamente establecidos, al tiempo que ha introducido aplicaciones potenciales transformadoras en el campo. Esta tecnología de organoides fue propuesta inicialmente en 2009 por Hans Clevers y sus colegas, quienes pudieron establecer con éxito un sistema de cultivo de organoides intestinales mediante el cultivo de células madre Lgr5⁺ derivadas del in.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Red Cap Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial	Corning	431420
50 mL Polypropylene Conical Tube	Corning	352070
100 mm TC-treated Cell Culture Dish	Corning	353003
105 mm Polystyrene Forceps Sterile	Caplugs Evergreen	222-1121-B1I
150 cm2 Cell Culture Flask	Corning	CLS430825
A83-01	Tocris	2939
Advanced DMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1)	Gibco	12634-010
B-27 Supplement (50x)	Gibco	17504-044
Brilliant Violet 510 anti-human Perforin Antibody	BioLegend	308120
Brilliant Violet 605 anti-human Ki-67 Antibody	BioLegend	350522
Brilliant Violet 650 anti-human CD366 (Tim-3) Antibody	BioLegend	345028
Brilliant Violet 711 anti-human CD45 Antibody	BioLegend	304050
Cell Culture Inserts 0.4 µm, 30 mm Diameter	Millipore Sigma	PIHP03050
Cell Staining Buffer	BioLegend	420201
Cell Strainer 40 µm Nylon	Corning	352340
Cell Strainer 70 µm Nylon	Corning	352350
Collagenase, Type IV, powder	Gibco	17104019
Cultrex Rat Collagen I	Trevigen	3440-100-01
Culture Plate, PS, 48 wells, TC treated with lid, sterile	Max Scientific	07-6048
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM - high glucose 4.5 mg/mL	Corning	MT10-0130CV
Dnase I - Grade II	Millipore Sigma	10104159001
DPBS, 1%	Corning	21-031-CV
Fetal Bovine Serum, FBS	Corning	MT35-010-CV
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I	BD Biosciences	556547
Forskolin	Tocris	1099
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)	ThermoFisher	10131035
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher	35050061
Ham's F12 Nutrient Mix	ThermoFisher	11765054
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Hygromycin B (50 mg/mL)	ThermoFisher	10687010
L-Glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-081
L-WRN cell	ATCC	CRL-3276
Matrigel Phenol Free & Growth Fact. Reduced	Corning	356231
Millex PVDF syringe filter, 0.22 μM	Millipore Sigma	SLGVR33RB
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-100G
Nunc TripleFlask Treated Cell Culture Flask	ThermoFisher	132867
PE/Cyanine5 anti-human CD8a Antibody	BioLegend	301010
PE-Cy 7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)	BD Biosciences	561272
Pen Strep	Gibco	15140-122
Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15-1MG
Recombinant Human FGF-acidic	Peprotech	100-17A
Sodium Bicarbonate Solution (NaHCO3) (7.5%)	Quality Biological	118-085-721
Stainless Steel Surgical Blades no. 22	Integra	4-322
TrypLE Express	Gibco	12604-021