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Aquí, presentamos un protocolo para generar organoides derivados de pacientes con melanoma mediante el cultivo de suspensiones celulares disociadas de tejidos frescos de melanoma. Estos organoides recapitulan fielmente los tumores específicos del paciente in vitro, lo que ofrece un enfoque innovador para explorar los mecanismos inmunosupresores de tumores, la detección de fármacos, los mecanismos de resistencia a los medicamentos y los enfoques de vigilancia del cáncer.
Con el desarrollo de la inmunoterapia, existe una necesidad continua de desarrollar modelos que puedan recapitular el microambiente tumoral de los tumores nativos. Si bien los modelos bidimensionales y tridimensionales tradicionales pueden ofrecer información sobre el desarrollo y la progresión del cáncer, carecen de aspectos cruciales que dificulten una imitación fiel de los tumores nativos. Un modelo alternativo que ha ganado mucha atención es el organoide derivado del paciente. El desarrollo de estos organoides recapitula la compleja comunicación intercelular, el microambiente tumoral y la histoarquitectura de los tumores. En este artículo se describe el protocolo para establecer modelos de organoides derivados de pacientes con melanoma (MPDO). Para validar estos modelos, evaluamos la composición de las células inmunitarias, incluidos los niveles de expresión de los marcadores de activación de las células T, para confirmar la heterogeneidad celular de los organoides. Además, para describir la utilidad potencial de los MPDOs en terapias celulares, evaluamos las capacidades citotóxicas del tratamiento de los organoides con linfocitos T γδ. En conclusión, los modelos MPDO ofrecen vías prometedoras para comprender la complejidad tumoral, validar estrategias terapéuticas y, potencialmente, avanzar en el tratamiento personalizado.
Los modelos convencionales de cultivo celular en 2D son herramientas esenciales en la investigación del cáncer para estudiar la progresión y el tratamiento del cáncer1. Estos modelos no solo permiten condiciones experimentales controladas para investigar los mecanismos moleculares y celulares que subyacen al desarrollo y la progresión del cáncer, sino que también proporcionan resultados experimentales rentables y relativamente rápidos. Su uso, sin embargo, está restringido debido a la limitada diversidad celular en el microambiente tumoral (TME), que no puede recapitularse en la naturaleza coplanar de los modelos de monocultivo2. Además, los modelos de cultivo celular ofrecen un entorno demasiado simplificado en comparación con el cuerpo humano3. Por lo tanto, para comprender mejor la progresión del cáncer y desarrollar tratamientos efectivos, los investigadores han recurrido a modelos innovadores que tienen como objetivo recapitular la EMT en la naturaleza de cerca. En consecuencia, mantener la fidelidad a los tumores nativos es primordial en estos modelos. Dada la naturaleza compleja del cáncer, cualquier desviación significativa del tumor original podría introducir variables imprevistas que podrían confundir conclusiones significativas sobre el comportamiento del tumor.
Si bien los xenoinjertos derivados del paciente (PDX) han surgido como un sistema modelo que permite el seguimiento de la progresión tumoral in vivo, algunas limitaciones cuestionan qué tan bien el tumor desarrollado recapitula la biología del cáncer humano4. Por ejemplo, el melanoma TME contiene células inmunitarias infiltrantes de tumores y células estromales. Cuando se pasa como un xenoinjerto, las células no cancerosas del paciente se perderán gradualmente, lo que puede seleccionar adaptaciones que difieren de las de los tumores del paciente. Si bien estas limitaciones pueden mitigarse mediante la realización de pasajes limitados de la PDX in vivo, las diferencias entre las especies aún pueden representar un riesgo de cambios genéticos en la PDX que se desvían de la del tumor nativo5. Además, los modelos PDX se establecen normalmente en ratones inmunocomprometidos para evitar el rechazo de tejidos humanos. Esto limita la capacidad de estudiar el papel del sistema inmune del huésped en el cáncer, especialmente en los estudios inmunoterapéuticos6. Nosotros y otros hemos injertado PDX en ratones "humanizados" 7,8. Sin embargo, el establecimiento de modelos PDX en ratones humanizados requiere mucho tiempo y es costoso. El desarrollo de un único modelo de PDX a partir de la muestra tumoral de un paciente puede llevar varios meses o años, lo que limita la velocidad y la escala de la investigación. A pesar de estas limitaciones, los modelos PDX han demostrado representar con precisión la biología del TME, por lo que han sido ampliamente utilizados para el desarrollo de terapias contra el cáncer, medicina personalizada e inmunoterapia, entre otros9.
Una técnica alternativa de cultivo 3D que ha surgido es el organoide derivado del paciente (PDO), en el que se cultiva un tumor del paciente recién resecado para crear modelos que mantengan la heterogeneidad fenotípica, la histoarquitectura y las comunicaciones intercelulares10. Su capacidad para parecerse mucho a los tumores nativos ha sido demostrada previamente donde los organoides cultivados de cáncer de vejiga no músculo-invasivo (NMIBC) y músculo-invasivo (MIBC) recapitularon con éxito aspectos clave de los tumores parentales11. Debido a su potencial y ventajas sobre otros modelos, las PDOs ofrecen una amplia variedad de aplicaciones personalizadas de las que carecen otros modelos, incluidos, entre otros, el estudio y desarrollo de inhibidores de puntos de control inmunitarios junto con terapias celulares y dirigidas. Por ejemplo, hemos utilizado previamente organoides derivados de pacientes con melanoma (MPDO) para estudiar la capacidad de los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) para expandirse mediante IL-2 y anticuerpos anti-PD1 (αPD-1). Los resultados mostraron que los TILs expandidos por IL-2 y αPD-1 no solo tenían un número mayor, sino que también podían infiltrar con éxito MPDOs y matar las células de melanoma con mayor eficiencia que los TILs expandidos usando otros métodos12. Otros grupos han mostrado resultados similares en los que el uso de anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 conduce a que los TIL permanezcan funcionales en las PDO, lo que posteriormente conduce a la muerte tumoral13. Además, nuestro grupo también ha utilizado MPDOs para evaluar la infiltración y la capacidad de destrucción de las células T γδ14. La aplicabilidad de las PDOs abarca una amplia gama de áreas, incluida la expansión de TIL, los estudios de citotoxicidad y el cribado de moléculas pequeñas. Todas estas aplicaciones ponen de manifiesto el potencial y la usabilidad que confiere este modelo. Como tal, describimos el protocolo detallado para el cultivo de MPDOs.
Los tejidos de melanoma humano se obtuvieron de pacientes que recibían tratamiento en la Universidad de Pensilvania utilizando el protocolo de recolección de tejidos (UPCC08607) aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Pensilvania. Todos los pacientes han firmado el consentimiento informado. Después de la resección de los tejidos de melanoma humano, el tejido tumoral se coloca en el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y se mantiene a 4 °C hasta el procesamiento (dentro de las 6 h). Los organoides derivados del paciente con melanoma (MPDO) se derivaron de un tumor reciente, como se ilustra en la Figura 1.
1. Aislamiento de células de tejido de melanoma humano
La forma y el tamaño de los MPDOs fueron monitoreados a lo largo del tiempo para estudiar su dinámica de crecimiento. Como se observa en la Figura 2, durante el período de crecimiento inicial, el tamaño del organoide aumentó sustancialmente a lo largo de los 7 días representados. Tras la observación de la dinámica de crecimiento de la MPDO, la atención se centró en la evaluación de la composición de las células inmunitarias para verificar la fie...
La aparición de las PDOs ha abordado las múltiples limitaciones planteadas por otros métodos de investigación del cáncer previamente establecidos, al tiempo que ha introducido aplicaciones potenciales transformadoras en el campo. Esta tecnología de organoides fue propuesta inicialmente en 2009 por Hans Clevers y sus colegas, quienes pudieron establecer con éxito un sistema de cultivo de organoides intestinales mediante el cultivo de células madre Lgr5+ derivadas del in...
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Este estudio fue financiado en parte por subvenciones de R01(CA258113), SPORE (CA261608) y P01 (CA114046). La Figura 1 se preparó en BioRender.com.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2 mL Red Cap Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 431420 | |
50 mL Polypropylene Conical Tube | Corning | 352070 | |
100 mm TC-treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
105 mm Polystyrene Forceps Sterile | Caplugs Evergreen | 222-1121-B1I | |
150 cm2 Cell Culture Flask | Corning | CLS430825 | |
A83-01 | Tocris | 2939 | |
Advanced DMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1) | Gibco | 12634-010 | |
B-27 Supplement (50x) | Gibco | 17504-044 | |
Brilliant Violet 510 anti-human Perforin Antibody | BioLegend | 308120 | |
Brilliant Violet 605 anti-human Ki-67 Antibody | BioLegend | 350522 | |
Brilliant Violet 650 anti-human CD366 (Tim-3) Antibody | BioLegend | 345028 | |
Brilliant Violet 711 anti-human CD45 Antibody | BioLegend | 304050 | |
Cell Culture Inserts 0.4 µm, 30 mm Diameter | Millipore Sigma | PIHP03050 | |
Cell Staining Buffer | BioLegend | 420201 | |
Cell Strainer 40 µm Nylon | Corning | 352340 | |
Cell Strainer 70 µm Nylon | Corning | 352350 | |
Collagenase, Type IV, powder | Gibco | 17104019 | |
Cultrex Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
Culture Plate, PS, 48 wells, TC treated with lid, sterile | Max Scientific | 07-6048 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DMEM - high glucose 4.5 mg/mL | Corning | MT10-0130CV | |
Dnase I - Grade II | Millipore Sigma | 10104159001 | |
DPBS, 1% | Corning | 21-031-CV | |
Fetal Bovine Serum, FBS | Corning | MT35-010-CV | |
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences | 556547 | |
Forskolin | Tocris | 1099 | |
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) | ThermoFisher | 10131035 | |
GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
Ham's F12 Nutrient Mix | ThermoFisher | 11765054 | |
HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
Hygromycin B (50 mg/mL) | ThermoFisher | 10687010 | |
L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
L-WRN cell | ATCC | CRL-3276 | |
Matrigel Phenol Free & Growth Fact. Reduced | Corning | 356231 | |
Millex PVDF syringe filter, 0.22 μM | Millipore Sigma | SLGVR33RB | |
N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
Nunc TripleFlask Treated Cell Culture Flask | ThermoFisher | 132867 | |
PE/Cyanine5 anti-human CD8a Antibody | BioLegend | 301010 | |
PE-Cy 7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1) | BD Biosciences | 561272 | |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15-1MG | |
Recombinant Human FGF-acidic | Peprotech | 100-17A | |
Sodium Bicarbonate Solution (NaHCO3) (7.5%) | Quality Biological | 118-085-721 | |
Stainless Steel Surgical Blades no. 22 | Integra | 4-322 | |
TrypLE Express | Gibco | 12604-021 |
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