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要約

ここでは、新鮮なメラノーマ組織から解離細胞懸濁液を培養することにより、メラノーマ患者由来のオルガノイドを生成するプロトコルを紹介します。これらのオルガノイドは 、in vitro で患者特異的な腫瘍を忠実に再現し、腫瘍免疫抑制メカニズム、薬物スクリーニング、薬剤耐性メカニズム、およびがんサーベイランスアプローチを探索するための革新的なアプローチを提供します。

要約

免疫療法の発展に伴い、天然腫瘍の腫瘍微小環境を再現できるモデルの開発が継続的に必要とされています。従来の2次元モデルや3次元モデルでは、がんの発生と進行に関する洞察を得ることができますが、これらには、天然腫瘍の忠実な模倣を妨げる重要な側面が欠けています。多くの注目を集めている代替モデルは、患者由来のオルガノイドです。これらのオルガノイドの発達は、複雑な細胞間コミュニケーション、腫瘍微小環境、および腫瘍の組織構造を再現しています。この論文では、黒色腫患者由来オルガノイド(MPDO)モデルを確立するためのプロトコルについて説明します。これらのモデルを検証するために、T細胞活性化マーカーの発現レベルを含む免疫細胞の組成を評価し、オルガノイドの細胞の不均一性を確認しました。さらに、細胞治療におけるMPDOの潜在的な有用性を説明するために、オルガノイドをγδT細胞で処理することの細胞毒性能を評価しました。結論として、MPDOモデルは、腫瘍の複雑さを理解し、治療戦略を検証し、個別化治療を進める可能性のある有望な手段を提供します。

概要

従来の2次元細胞培養モデルは、がん研究においてがんの進行や治療を研究するために不可欠なツールです1。これらのモデルは、がんの発生と進行の根底にある分子的および細胞的メカニズムを調査するための制御された実験条件を可能にするだけでなく、費用対効果が高く、比較的迅速な実験結果を提供します。しかし、腫瘍微小環境(TME)の細胞多様性が限られているため、その使用は制限されており、単一培養モデル2の同一平面上の性質では再現できません。さらに、細胞培養モデルは、人体と比較して過度に単純化された環境を提供します3。したがって、がんの進行をよりよく理解し、効果的な治療法を開発するために、研究者は自然界のTMEを密接に再現することを目的とした革新的なモデルに目を向けました。したがって、これらのモデルでは、天然腫瘍への忠実度を維持することが最も重要です。がんの複雑な性質を考えると、元の腫瘍からの大幅な逸脱は、腫瘍の挙動に関する有意義な結論を混乱させる可能性のある予期しない変数をもたらす可能性があります。

患者由来異種移植片(PDX)は、in vivoでの腫瘍進行のモニタリングを可能にするモデルシステムとして浮上していますが、いくつかの制限は、開発された腫瘍がヒトのがん生物学をどの程度再現するかを疑問視しています4。たとえば、黒色腫TMEには、腫瘍浸潤免疫細胞と間質細胞が含まれています。異種移植片として継代すると、患者からの非がん細胞は徐々に失われ、患者の腫瘍とは異なる適応を選択できます。これらの制限は、in vivoでPDXの限定的な継代を行うことで軽減できるが、種間の違いは依然として、天然腫瘍のものから逸脱するPDXの遺伝的変化のリスクをもたらす可能性がある5。さらに、PDXモデルは通常、免疫不全マウスで確立され、ヒト組織の拒絶反応を防ぎます。このため、がんにおける宿主免疫系の役割を研究する能力、特に免疫療法研究6。私たちや他の人々は、「ヒト化」マウスにPDXを移植しました7,8。しかし、ヒト化マウスでPDXモデルを確立するには、時間と費用がかかります。患者の腫瘍検体から単一のPDXモデルを開発するには数か月から数年かかる場合があり、研究のスピードと規模が制限されます。これらの制限にもかかわらず、PDXモデルはTMEの生物学を正確に表現することが示されており、したがって、がん治療薬、個別化医療、免疫療法などの開発に広く使用されています9。

出現した代替の3D培養技術は、患者由来オルガノイド(PDO)であり、新たに切除された患者の腫瘍を培養して、表現型の不均一性、組織構造、および細胞間コミュニケーションを維持するモデルを作成します10。その天然腫瘍に酷似する能力は、非筋肉浸潤性膀胱癌(NMIBC)および筋肉浸潤性膀胱癌(MIBC)の培養オルガノイドが親腫瘍の重要な側面を成功裏に再現したことで以前に実証されている11。PDOは、他のモデルよりも可能性が高く、利点があるため、免疫チェックポイント阻害剤の研究と開発、細胞療法、標的療法など、他のモデルにはないさまざまなカスタマイズされたアプリケーションを提供します。例えば、私たちはこれまでにメラノーマ患者由来オルガノイド(MPDO)を用いて、IL-2抗体と抗PD1抗体(αPD-1)によって腫瘍浸潤リンパ球(TIL)が増殖する能力を研究してきました。その結果、IL-2およびαPD-1によって拡大されたTILは、他の方法を使用して拡大されたTILよりも、数が多いだけでなく、MPDOへの浸潤に成功し、メラノーマ細胞を殺傷することもできることが示されました12。他のグループも同様の結果を示しており、抗PD-1および/または抗PD-L1の使用により、PDOでTILが機能を維持し、その結果、腫瘍が死滅する13。さらに、私たちのグループは、γδT細胞の浸潤と殺傷能力を評価するためにMPDOも使用しています14。PDOの適用性は、TILの増殖、細胞毒性試験、低分子スクリーニングなど、幅広い分野に及びます。これらのアプリケーションはすべて、このモデルがもたらす可能性と使いやすさを際立たせています。そのため、MPDOの培養に関する詳細なプロトコルについて説明します。

プロトコル

ヒト黒色腫組織は、ペンシルベニア大学の治験審査委員会によって承認された組織収集プロトコル(UPCC08607)を使用して、ペンシルベニア大学で治療を受けている患者から採取されました。すべての患者はインフォームドコンセントに署名しています。ヒト黒色腫組織の切除後、腫瘍組織をダルベッコの修正イーグル培地(DMEM)に入れ、処理まで4°Cに保ちます(6時間以内)。黒色腫患者由来オルガノイド(MPDO)は、 図1に示すように新鮮な腫瘍に由来しました。

1. ヒト黒色腫組織からの細胞の単離

  1. 手続き開始前の準備
    注:2つの培養方法(マトリゲルゲルとコラーゲンゲル)を使用して、解離したメラノーマ組織を培養できます。
    1. マトリゲル法の場合: Growth Factor Reduction(GFR)Basement Membrane Matrixのコーティング溶液を、GFR Basement Membrane Matrixをオルガノイド培養培地( 表1参照)で1:2の比率で希釈します。解凍した溶液を48ウェルプレートの複数のウェルのそれぞれに約115 μL加え、加湿インキュベーター内で37°Cで30分間固化させます。
    2. コラーゲンゲル法の場合: 1 mLのコラーゲンゲル( 表1を参照)を30 mmの内膜インサートに加えます。.加湿インキュベーターでゲルを37°Cで30分間固化させます。
  2. L-WRNコンディショニングメディウム15を準備します。L-WRN馴化培地は、Wnt3a、R-spondin 3、およびNogginを細胞培養に広く使用されている単一の馴化培地に分泌するように設計されたL-WRN細胞株から製造されます。
    1. L-WRN細胞のクライオチューブを37°Cの水浴で解凍します。5 mLのL細胞培地( 表1を参照)とL-WRN細胞懸濁液を15 mLのコニカルチューブに加え、120 × g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を吸引し、細胞のペレットを再懸濁するために~500μLが底に残るようにします。
    2. 上清中の細胞ペレットを氷上の30 mLのL細胞培地に移し、150 μLのハイグロマイシン(500 μg/mL)と300 μLのG418(500 μg/mL)を加えます。T-150フラスコで細胞を3×106 の密度で播種し、加湿インキュベーター内で5%CO2 を~90%コンフルエントになるまで37°Cでインキュベートします。
    3. 細胞が~90%コンフルエントになったら、20 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、吸引し、3 mLのトリプシン代替品で消化することにより、細胞を5つのT-150フラスコに分割します。5分後、9 mLのL細胞培地で中和し、続いて4°Cで120 × g で5分間遠心分離します。~100%合流したら、5つのT-150フラスコを10個のT-175 3層フラスコに分割します。
    4. コンフルエントになったら、2 x 50 mLのPBSで細胞を洗浄し、次に25 mLの洗浄培地で洗浄します( 表1を参照)。
    5. 各T-175 3層フラスコに75 mLの初代培地を加え、加湿インキュベーター内で5% CO2 を入れた加湿インキュベーターで3日間インキュベートします( 表1を参照)。
    6. 3日後、コンディショニング培地を50 mLの円錐形に回収し、1,100 × g で4°Cで5分間遠心します。 上清(馴化培地)を収集し、5mLが残るようにします。
    7. 新鮮な75 mLの初代細胞培養培地を各T-175 3層フラスコに加え、さらに3日間インキュベートして追加のコンディショニング培地を回収します。
    8. 回収した馴染培地に等量の初代細胞培養培地(容量50%)を加え、0.22 μmフィルターを使用して内容物を真空ろ過します。アリコートを50mLのチューブに保管し、長期使用の場合は-20°C、最大2〜3週間は4°Cで保存してください。この培地を使用して、オルガノイド培養培地を補います( 表1を参照)。
      注意: 使用前にアリコートを4°Cで一晩解凍してください。
  3. 新鮮な黒色腫組織からの細胞混合物の採取
    1. 切除したばかりの黒色腫組織を、洗浄剤が入った10mLのペトリ皿で洗浄します。最初のすすぎ後、滅菌ピンセットを使用して腫瘍を2番目のシャーレに移し、さらに洗浄し、このプロセスを氷上で3回繰り返して、腫瘍の完全性と生存率を維持します。これらのすすぎサイクル全体を通して、滅菌ハサミと刃を使用して、余分な結合組織、脂肪、および残留血液を取り除きます。3回の洗浄後、腫瘍を空のペトリ皿に入れ、滅菌ブレードを使用して腫瘍を細かく刻みます。
      注:ミンチ後、腫瘍はゲル状の粘稠度を示すはずです。腫瘍のミンチが細かいほど、細胞収量は高くなります。これは、腫瘍の塊が大きいと消化が難しくなり、次のステップで70μmのナイロン細胞ストレーナーを通過しない可能性があるためです。
    2. 腫瘍組織を完全に洗浄してミンチにしたら、調製した消化培地10mLが入った50mLの円錐形チューブに移します( 表1を参照のこと)。円錐形を37°Cの水浴に入れ、内容物が5分ごとに渦巻きになるようにします。
    3. 25分後、10% FBSを含むADMEM/F12培地30 mLを加えて消化を停止します。
      注:これらの指定量は、重量が0.2 g以下の腫瘍を対象としています。
    4. 消化した細胞懸濁液を70 μmのナイロン細胞ストレーナーでろ過し、10% FBSを含むADMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1)でストレーナーをすすぎます。洗浄ステップに続いて、ピペットを使用してフィルターの底に残っている培地を取り出し、可能な限り多くの細胞が回収されるようにします。次に、300 × g で4°Cで7分間遠心分離します。 上清を捨て、ペレットをオルガノイド培地に再懸濁します( 表1を参照)。
    5. メラノーマ単細胞懸濁液をマトリゲルまたはコラーゲン培養システムで培養します。
      1. マトリゲル:1細胞懸濁液をカウントし、約2×10個の5 細胞が、200 μLのオルガノイド培地を補充した予熱したマトリゲルコーティングウェルに播種されていることを確認します。
        注:マトリゲルベースのオルガノイドは、病態生理学の研究、薬物の有効性のスクリーニング、および薬物毒性の試験に使用されます16。
      2. コラーゲンゲル:シングルセル懸濁液を数え、約106 個の細胞が1 mLのコラーゲンゲルと混合されていることを確認します。あらかじめ固化させたコラーゲンゲルメンブレンインサートに混合物を加え、これらを6ウェルプレートに入れます。細胞とコラーゲンゲルを含むインサートを沈めるのに十分なオルガノイド培養培地を追加します。
        注:コラーゲンゲルオルガノイドは、T細胞の遊走を測定し、組織発生を研究するために使用されます16。
    6. オルガノイドを成長させながら、新鮮な培地を3日ごとに追加します。
    7. オルガノイドのサイズが150〜200μmに達したら、オルガノイドを継代するか、さらに使用するまで凍結保存します。
      1. オルガノイドを流用するには、オルガノイドを15 mLの円錐形に移し、1x DPSBで洗浄します。混合物を300 × g で4°Cで7分間遠心分離します。 上清を取り除き、トリプシン代替品(オルガノイドあたり50-100 μL)を37°Cの水浴で10分間追加し、内容物が3分ごとにボルテックスされることを確認します。
      2. 10% FBSを含むADMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1) Medium を使用して消化を停止します。混合物を300 × g で7分間遠心分離し、オルガノイド培地に再懸濁します。
      3. 同じ初期播種密度で、新しいマトリゲル/コラーゲン被覆ウェルにシングルセル懸濁液を播種します(48ウェルプレートのマトリゲル被覆ウェルの場合は200μLのオルガノイド培養培地に×2細胞、48ウェルプレートのマトリゲル被覆ウェルの場合は200μLのオルガノイド培養培地に2細胞、30mmの内膜インサートに1mLのオルガノイド培養培地に10個の6細胞)。
      4. 凍結保存のためには、トリプシン代替品を使用してMPDOを単一細胞懸濁液に消化し、続いて10個の6 細胞を1mLの凍結培地に再懸濁します( 表1を参照)。

結果

MPDOの形状とサイズを経時的に監視し、その成長ダイナミクスを研究しました。 図2に見られるように、初期の増殖期には、図示の7日間を通じてオルガノイドのサイズが大幅に増加しました。MPDOの増殖動態の観察に続いて、オルガノイドが元の腫瘍に忠実に再現されることを確認するために、免疫細胞組成の評価に注目が集まりました。この評?...

ディスカッション

PDO の出現により、以前に確立された他のがん研究方法によってもたらされた複数の制限に対処しながら、この分野での変革的な潜在的なアプリケーションを導入しました。このオルガノイド技術は、2009年にHans Cleversらによって最初に提案され、マウスの腸に由来するLgr5+ 幹細胞をR-スポンシン、EGF、およびNoggin因子を含む3Dマトリックスゲルで培養すること?...

開示事項

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

謝辞

この研究は、R01(CA258113)、SPORE(CA261608)、およびP01(CA114046)からの助成金によって部分的に資金提供されました。 図1 は BioRender.com で作成しました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
2 mL Red Cap Internal Threaded Polypropylene Cryogenic VialCorning431420
50 mL Polypropylene Conical TubeCorning352070
100 mm TC-treated Cell Culture DishCorning353003
105 mm Polystyrene Forceps SterileCaplugs Evergreen 222-1121-B1I
150 cm2 Cell Culture FlaskCorningCLS430825
A83-01Tocris2939
Advanced DMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1)Gibco12634-010
B-27 Supplement (50x)Gibco17504-044
Brilliant Violet 510 anti-human Perforin AntibodyBioLegend308120
Brilliant Violet 605 anti-human Ki-67 AntibodyBioLegend350522
Brilliant Violet 650 anti-human CD366 (Tim-3) AntibodyBioLegend345028
Brilliant Violet 711 anti-human CD45 AntibodyBioLegend304050
Cell Culture Inserts 0.4 µm, 30 mm DiameterMillipore SigmaPIHP03050
Cell Staining BufferBioLegend420201
Cell Strainer 40 µm NylonCorning 352340
Cell Strainer 70 µm NylonCorning 352350
Collagenase, Type IV, powderGibco17104019
Cultrex Rat Collagen ITrevigen3440-100-01
Culture Plate, PS, 48 wells, TC treated with lid, sterileMax Scientific 07-6048
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-MaxSigma-AldrichD2650
DMEM - high glucose 4.5 mg/mLCorningMT10-0130CV
Dnase I - Grade IIMillipore Sigma10104159001
DPBS, 1% Corning21-031-CV
Fetal Bovine Serum, FBSCorningMT35-010-CV
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit IBD Biosciences 556547
ForskolinTocris1099
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)ThermoFisher10131035
GlutaMAX SupplementThermoFisher35050061
Ham's F12 Nutrient MixThermoFisher11765054
HEPES (1 M)Gibco15630-080
Hygromycin B (50 mg/mL)ThermoFisher10687010
L-Glutamine 200 mM (100x)Gibco25030-081
L-WRN cellATCCCRL-3276
Matrigel Phenol Free & Growth Fact. ReducedCorning356231
Millex PVDF syringe filter, 0.22 μMMillipore SigmaSLGVR33RB
N-AcetylcysteineSigma-AldrichA9165-5G
NicotinamideSigma-AldrichN0636-100G
Nunc TripleFlask Treated Cell Culture FlaskThermoFisher132867
PE/Cyanine5 anti-human CD8a AntibodyBioLegend301010
PE-Cy 7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)BD Biosciences 561272
Pen StrepGibco15140-122
Recombinant Human EGFPeprotechAF-100-15-1MG
Recombinant Human FGF-acidicPeprotech100-17A
Sodium Bicarbonate Solution (NaHCO3) (7.5%)Quality Biological 118-085-721
Stainless Steel Surgical Blades no. 22Integra4-322
TrypLE Express Gibco12604-021

参考文献

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