揭示黑色素瘤患者来源的类器官模型的治疗机会

摘要

在这里，我们提出了一种方案，通过从新鲜黑色素瘤组织中培养解离的细胞悬液来生成黑色素瘤患者衍生的类器官。这些类器官在体外忠实地概括了患者特异性肿瘤 ， 为探索肿瘤免疫抑制机制、药物筛选、耐药机制和癌症监测方法提供了一种创新方法。

摘要

随着免疫疗法的发展，持续需要开发能够概括天然肿瘤肿瘤微环境的模型。虽然传统的二维和三维模型可以提供对癌症发展和进展的见解，但这些模型缺乏阻碍忠实模拟天然肿瘤的关键方面。一种引起广泛关注的替代模型是患者来源的类器官。这些类器官的发育概括了肿瘤复杂的细胞间通讯、肿瘤微环境和组织结构。本文描述了建立黑色素瘤患者来源的类器官 （MPDO） 模型的方案。为了验证这些模型，我们评估了免疫细胞组成，包括 T 细胞活化标志物的表达水平，以确认类器官的细胞异质性。此外，为了描述 MPDO 在细胞疗法中的潜在效用，我们评估了用 γδ T 细胞治疗类器官的细胞毒能力。总之，MPDO 模型为了解肿瘤复杂性、验证治疗策略和潜在推进个性化治疗提供了有前途的途径。

引言

传统的 2-D 细胞培养模型是癌症研究中研究癌症进展和治疗的重要工具¹。这些模型不仅允许在受控的实验条件下研究癌症发展和进展的分子和细胞机制，而且还提供具有成本效益且相对快速的实验结果。然而，由于肿瘤微环境 （TME） 中的细胞多样性有限，它们的使用受到限制，这不能在单一培养模型的共面性质中概括²。此外，与人体相比，细胞培养模型提供了过于简化的环境³。因此，为了更好地了解癌症进展并开发有效的治疗方法，研究人员转向了旨在在自然界中密切概括 TME 的创新模型。因此，在这些模型中，保持对天然肿瘤的保真度至关重要。鉴于癌症的复杂性，与原始肿瘤的任何重大偏差都可能引入不可预见的变量，这些变量可能会混淆有关肿瘤行为的有意义结论。

虽然患者来源的异种移植物 （PDX） 已成为一种允许在体内监测肿瘤进展的模型系统，但一些局限性质疑开发的肿瘤在多大程度上概括了人类癌症生物学⁴。例如，黑色素瘤 TME 包含肿瘤浸润免疫细胞和基质细胞。当作为异种移植物传代时，患者的非癌细胞会逐渐丢失，这可以选择与患者肿瘤不同的适应。虽然可以通过在体内进行 PDX 的有限传代来减轻这些限制，但物种之间的差异仍然可能对 P....

研究方案

人类黑色素瘤组织是使用宾夕法尼亚大学机构审查委员会批准的组织收集方案 （UPCC08607） 从宾夕法尼亚大学接受治疗的患者那里获得的。所有患者均已签署知情同意书。切除人黑色素瘤组织后，将肿瘤组织置于 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基 （DMEM） 中并保持在 4 °C 直至加工（6 小时内）。黑色素瘤患者来源的类器官 （MPDO） 来源于新鲜肿瘤， 如图 1 所示。

1. 从人黑色素瘤组织中分离细胞

1. 手术开始前的准备工作
   注：两种培养方法（基质胶和胶原凝胶）可用于培养解离的黑色素瘤组织：
   1. 对于 Matrigel 方法： 用类器官培养基（见 表 1）以 1：2 的比例稀释 GFR 基底膜基质，制备低生长因子 （GFR） 基底膜基质的包被溶液。将大约 115 μL 解冻的溶液添加到 48 孔板的几个孔中，并在加湿培养箱中于 37 °C 固化 30 分钟。
   2. 对于胶原蛋白凝胶法： 将 1 mL 胶原蛋白凝胶（见 表 1）添加到 30 mm 内膜插入物中。让凝胶在加湿培养箱中于 37 °C 固化 30 分钟。
   ....

讨论

PDO 的出现解决了其他先前建立的癌症研究方法带来的多重限制，同时在该领域引入了变革性的潜在应用。这种类器官技术最初由 Hans Clevers 及其同事于 2009 年提出，他们能够在含有 R-sponsin、EGF 和 Noggin 因子²⁰ 的 3D 基质凝胶中培养源自小鼠肠道的 Lgr5⁺ 干细胞，从而成功建立肠道类器官培养系统。几年后，即 2020 年，Koehler 的团队报告了一种类器?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Red Cap Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial	Corning	431420
50 mL Polypropylene Conical Tube	Corning	352070
100 mm TC-treated Cell Culture Dish	Corning	353003
105 mm Polystyrene Forceps Sterile	Caplugs Evergreen	222-1121-B1I
150 cm2 Cell Culture Flask	Corning	CLS430825
A83-01	Tocris	2939
Advanced DMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1)	Gibco	12634-010
B-27 Supplement (50x)	Gibco	17504-044
Brilliant Violet 510 anti-human Perforin Antibody	BioLegend	308120
Brilliant Violet 605 anti-human Ki-67 Antibody	BioLegend	350522
Brilliant Violet 650 anti-human CD366 (Tim-3) Antibody	BioLegend	345028
Brilliant Violet 711 anti-human CD45 Antibody	BioLegend	304050
Cell Culture Inserts 0.4 µm, 30 mm Diameter	Millipore Sigma	PIHP03050
Cell Staining Buffer	BioLegend	420201
Cell Strainer 40 µm Nylon	Corning	352340
Cell Strainer 70 µm Nylon	Corning	352350
Collagenase, Type IV, powder	Gibco	17104019
Cultrex Rat Collagen I	Trevigen	3440-100-01
Culture Plate, PS, 48 wells, TC treated with lid, sterile	Max Scientific	07-6048
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM - high glucose 4.5 mg/mL	Corning	MT10-0130CV
Dnase I - Grade II	Millipore Sigma	10104159001
DPBS, 1%	Corning	21-031-CV
Fetal Bovine Serum, FBS	Corning	MT35-010-CV
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I	BD Biosciences	556547
Forskolin	Tocris	1099
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)	ThermoFisher	10131035
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher	35050061
Ham's F12 Nutrient Mix	ThermoFisher	11765054
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Hygromycin B (50 mg/mL)	ThermoFisher	10687010
L-Glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-081
L-WRN cell	ATCC	CRL-3276
Matrigel Phenol Free & Growth Fact. Reduced	Corning	356231
Millex PVDF syringe filter, 0.22 μM	Millipore Sigma	SLGVR33RB
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-100G
Nunc TripleFlask Treated Cell Culture Flask	ThermoFisher	132867
PE/Cyanine5 anti-human CD8a Antibody	BioLegend	301010
PE-Cy 7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)	BD Biosciences	561272
Pen Strep	Gibco	15140-122
Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15-1MG
Recombinant Human FGF-acidic	Peprotech	100-17A
Sodium Bicarbonate Solution (NaHCO3) (7.5%)	Quality Biological	118-085-721
Stainless Steel Surgical Blades no. 22	Integra	4-322
TrypLE Express	Gibco	12604-021