揭示黑色素瘤患者来源的类器官模型的治疗机会

摘要

在这里，我们提出了一种方案，通过从新鲜黑色素瘤组织中培养解离的细胞悬液来生成黑色素瘤患者衍生的类器官。这些类器官在体外忠实地概括了患者特异性肿瘤 ， 为探索肿瘤免疫抑制机制、药物筛选、耐药机制和癌症监测方法提供了一种创新方法。

摘要

随着免疫疗法的发展，持续需要开发能够概括天然肿瘤肿瘤微环境的模型。虽然传统的二维和三维模型可以提供对癌症发展和进展的见解，但这些模型缺乏阻碍忠实模拟天然肿瘤的关键方面。一种引起广泛关注的替代模型是患者来源的类器官。这些类器官的发育概括了肿瘤复杂的细胞间通讯、肿瘤微环境和组织结构。本文描述了建立黑色素瘤患者来源的类器官 （MPDO） 模型的方案。为了验证这些模型，我们评估了免疫细胞组成，包括 T 细胞活化标志物的表达水平，以确认类器官的细胞异质性。此外，为了描述 MPDO 在细胞疗法中的潜在效用，我们评估了用 γδ T 细胞治疗类器官的细胞毒能力。总之，MPDO 模型为了解肿瘤复杂性、验证治疗策略和潜在推进个性化治疗提供了有前途的途径。

引言

传统的 2-D 细胞培养模型是癌症研究中研究癌症进展和治疗的重要工具¹。这些模型不仅允许在受控的实验条件下研究癌症发展和进展的分子和细胞机制，而且还提供具有成本效益且相对快速的实验结果。然而，由于肿瘤微环境 （TME） 中的细胞多样性有限，它们的使用受到限制，这不能在单一培养模型的共面性质中概括²。此外，与人体相比，细胞培养模型提供了过于简化的环境³。因此，为了更好地了解癌症进展并开发有效的治疗方法，研究人员转向了旨在在自然界中密切概括 TME 的创新模型。因此，在这些模型中，保持对天然肿瘤的保真度至关重要。鉴于癌症的复杂性，与原始肿瘤的任何重大偏差都可能引入不可预见的变量，这些变量可能会混淆有关肿瘤行为的有意义结论。

虽然患者来源的异种移植物 （PDX） 已成为一种允许在体内监测肿瘤进展的模型系统，但一些局限性质疑开发的肿瘤在多大程度上概括了人类癌症生物学⁴。例如，黑色素瘤 TME 包含肿瘤浸润免疫细胞和基质细胞。当作为异种移植物传代时，患者的非癌细胞会逐渐丢失，这可以选择与患者肿瘤不同的适应。虽然可以通过在体内进行 PDX 的有限传代来减轻这些限制，但物种之间的差异仍然可能对 PDX 造成偏离天然肿瘤遗传变化的风险⁵。此外，PDX 模型通常在免疫功能低下的小鼠中建立，以防止对人体组织的排斥反应。这限制了研究宿主免疫系统在癌症中的作用的能力，尤其是在免疫治疗研究中⁶。我们和其他人已经在“人源化”小鼠中植入了 PDX ^7,8。然而，在人源化小鼠中建立 PDX 模型既耗时又昂贵。从患者的肿瘤标本中开发单个 PDX 模型可能需要数月到数年的时间，从而限制了研究的速度和规模。尽管存在这些限制，但 PDX 模型已被证明可以准确代表 TME 的生物学特性，因此已被广泛用于癌症治疗、个性化医疗和免疫疗法等的开发⁹。

已经出现的另一种 3D 培养技术是患者来源的类器官 （PDO），其中培养新鲜切除的患者肿瘤以创建保持表型异质性、组织结构和细胞间通讯的模型¹⁰。它与天然肿瘤非常相似的能力先前已经得到证明，其中来自非肌层浸润性 （NMIBC） 和肌层浸润性膀胱癌 （MIBC） 的培养类器官成功地概括了亲本肿瘤的关键方面¹¹。由于与其他模型相比，PDO 具有潜力和优势，因此提供了其他模型所缺乏的各种定制应用，包括但不限于免疫检查点抑制剂的研究和开发以及细胞和靶向治疗。例如，我们之前曾使用黑色素瘤患者来源的类器官 （MPDO） 来研究肿瘤浸润淋巴细胞 （TIL） 被 IL-2 和抗 PD1 抗体 （αPD-1） 扩增的能力。结果表明，IL-2 和 αPD-1 扩增的 TILs 不仅数量更多，而且可以成功浸润 MPDO 并杀死黑色素瘤细胞，效率高于使用其他方法扩增的^TILs12。其他小组也显示出类似的结果，其中抗 PD-1 和/或抗 PD-L1 的使用导致 TILs 在 PDO 中保持功能，随后导致肿瘤杀伤¹³。此外，我们小组还使用 MPDO 来评估 γδ T 细胞浸润和杀伤能力¹⁴。PDO 的适用性涵盖广泛的领域，包括 TIL 扩增、细胞毒性研究和小分子筛选。所有这些应用程序都突出了该模型所赋予的潜力和可用性。因此，我们描述了 MPDO 培养的详细方案。

研究方案

人类黑色素瘤组织是使用宾夕法尼亚大学机构审查委员会批准的组织收集方案 （UPCC08607） 从宾夕法尼亚大学接受治疗的患者那里获得的。所有患者均已签署知情同意书。切除人黑色素瘤组织后，将肿瘤组织置于 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基 （DMEM） 中并保持在 4 °C 直至加工（6 小时内）。黑色素瘤患者来源的类器官 （MPDO） 来源于新鲜肿瘤， 如图 1 所示。

1. 从人黑色素瘤组织中分离细胞

1. 手术开始前的准备工作
   注：两种培养方法（基质胶和胶原凝胶）可用于培养解离的黑色素瘤组织：
   1. 对于 Matrigel 方法： 用类器官培养基（见 表 1）以 1：2 的比例稀释 GFR 基底膜基质，制备低生长因子 （GFR） 基底膜基质的包被溶液。将大约 115 μL 解冻的溶液添加到 48 孔板的几个孔中，并在加湿培养箱中于 37 °C 固化 30 分钟。
   2. 对于胶原蛋白凝胶法： 将 1 mL 胶原蛋白凝胶（见 表 1）添加到 30 mm 内膜插入物中。让凝胶在加湿培养箱中于 37 °C 固化 30 分钟。
2. 制备 L-WRN 条件培养基¹⁵。L-WRN 条件培养基由 L-WRN 细胞系生产，该细胞系经过工程改造，可将 Wnt3a、R-spondin 3 和 Noggin 分泌到广泛用于细胞培养的单一条件培养基中。
   1. 在 37 °C 水浴中解冻 L-WRN 细胞的冻存管。将 5 mL L 细胞培养基（见 表 1）和 L-WRN 细胞悬液添加到 15 mL 锥形管中，并在 4 °C 下以 120 × g 离心 5 分钟。 吸出上清液，确保在底部留下 ~500 μL 以重悬细胞沉淀。
   2. 将上清液中的细胞沉淀转移到冰上的 30 mL L 细胞培养基中，并加入 150 μL 潮霉素 （500 μg/mL） 和 300 μL G418 （500 μg/mL）。将细胞以 3 × 10⁶ 的密度接种在 T-150 培养瓶上，并在 37 °C 下在 5% CO₂ 的加湿培养箱中孵育，直至 ~90% 汇合。
   3. 一旦细胞达到 ~90% 汇合，用 20 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤、吸出并用 3 mL 胰蛋白酶替代品消化，将细胞分成 5 个 T-150 培养瓶。5 分钟后，用 9 mL L 细胞培养基中和，然后在 4 °C 下以 120 × g 离心 5 分钟。当 ~100% 汇合时，将 5 个 T-150 培养瓶分成 10 个 T-175 3 层培养瓶。
   4. 汇合后，用 2 x 50 mL PBS 洗涤细胞，然后用 25 mL 洗涤培养基洗涤细胞（见 表 1）。
   5. 向每个 T-175 3 层培养瓶中加入 75 mL 原代培养基，并在 37 °C 下在含 5% CO₂ 的加湿培养箱中孵育 3 天（见 表 1）。
   6. 3 天后，将条件培养基收获到 50 mL 锥形中，并在 4 °C 下以 1,100 × g 离心 5 分钟。 收集上清液（条件培养基），确保留下 5 mL。
   7. 向每个 T-175 3 层培养瓶中加入新鲜的 75 mL 原代细胞培养基，再孵育 3 天以收集额外的条件培养基。
   8. 向收集的条件培养基中加入等体积的原代细胞培养基（50% 体积），并使用 0.22 μm 过滤器对内容物进行真空过滤。将等分试样储存到 50 mL 试管中，并在 -20 °C 下长期使用，或在 4 °C 下储存长达 2-3 周。使用这种培养基补充类器官培养基（见 表 1）。
      注意：使用前在 4 °C 下解冻等分试样过夜。
3. 从新鲜的黑色素瘤组织中收集细胞混合物
   1. 在含有洗涤介质的 10 mL 培养皿中洗涤新鲜切除的黑色素瘤组织。第一次冲洗后，使用无菌镊子将肿瘤转移到第二个培养皿中进一步清洗，并在冰上重复此过程 3 次，以保持肿瘤完整性和活力。在这些冲洗周期中，使用无菌剪刀和刀片去除多余的结缔组织、脂肪和残留的血液。洗涤 3 次后，将肿瘤放入空培养皿中，并使用无菌刀片将其切碎。
      注意：切碎后，肿瘤应表现出凝胶状稠度。肿瘤切碎越细，细胞产量就越高。这是因为较大的肿瘤团块将更具消化性，并且在后续步骤中可能无法通过 70 μm 尼龙细胞过滤器。
   2. 彻底清洗并切碎肿瘤组织后，将其转移到含有 10 mL 制备的消化培养基的 50 mL 锥形管中（见 表 1）。将圆锥细胞置于 37 °C 的水浴中，确保内容物每 5 分钟涡旋一次。
   3. 25 分钟后，加入 30 mL 含有 10% FBS 的 ADMEM/F12 培养基以停止消化。
      注意：这些指定数量适用于重量不超过 0.2 g 的肿瘤。
   4. 通过 70 μm 尼龙细胞过滤器过滤消化的细胞悬液，然后用含有 10% FBS 的 ADMEM/F12 （1x） 减血清培养基 （1：1） 冲洗过滤器。洗涤步骤后，使用移液器取回过滤器底部的任何剩余培养基，以确保取回尽可能多的细胞。然后，在 4 °C 下以 300 × g 离心 7 分钟。 弃去上清液，将沉淀重悬于类器官培养基中（见 表 1）。
   5. 在 Matrigel 或胶原培养系统中培养黑色素瘤单细胞悬液：
      1. 基质胶：对单细胞悬液进行计数，以确保将大约 2 × 10⁵ 个细胞接种在补充有 200 μL 类器官培养基的预热基质胶包被的孔中。
         注意：基于基质胶的类器官用于研究病理生理学、筛选药物疗效和测试药物毒性¹⁶。
      2. 胶原凝胶：对单细胞悬液进行计数，以确保大约 10⁶ 个细胞与 1 mL 胶原凝胶混合。将混合物添加到预固化的胶原凝胶膜插入物中，并将它们放入 6 孔板中。添加足够的类器官培养基以浸没含有细胞和胶原凝胶的插入物。
         注：胶原凝胶类器官用于测量 T 细胞迁移和研究组织发育¹⁶。
   6. 让类器官生长，同时确保每 3 天添加一次新鲜培养基。
   7. 一旦类器官达到 150-200 μm 的大小，就传代或冷冻保存它们直到进一步使用。
      1. 对于类器官的传代，将类器官转移到 15 mL 锥形瓶中并用 1x DPSB 洗涤。将混合物在 4 °C 下以 300 × g 离心 7 分钟。 去除上清液，加入胰蛋白酶替代物（每个类器官 50-100 μL）在 37 °C 水浴中 10 分钟，确保内容物每 3 分钟涡旋一次。
      2. 使用含有 10% FBS 的 ADMEM/F12 （1x） 减血清培养基 （1：1） 培养基终止消化。将混合物以 300 × g 离心 7 分钟，然后重悬于类器官培养基中。
      3. 以相同的初始接种密度将单细胞悬液接种到新的基质胶/胶原蛋白包被的孔中（2 × 10⁵ 个细胞在 200 μL 类器官培养基中，用于 48 孔板中的基质胶包被的孔，或 10⁶ 个细胞在 1 mL 类器官培养基中，用于胶原蛋白包被的 30 毫米内膜插入物）。
      4. 对于冷冻保存，使用胰蛋白酶替代品将 MPDO 消化成单细胞悬液，然后将 10⁶ 个细胞重悬于 1 mL 冷冻培养基中（见 表 1）。

结果

随着时间的推移监测 MPDO 的形状和大小，以研究它们的生长动态。如图 2 所示，在初始生长期，类器官大小在所描述的 7 天内大幅增加。在观察 MPDO 生长动力学之后，注意力转向评估免疫细胞组成，以验证类器官对原始肿瘤的忠实再现。这项评估主要关注 αβ T 细胞的丰度，为类器官与亲本肿瘤之间的相似性提供了见解。如您所见， ...

讨论

PDO 的出现解决了其他先前建立的癌症研究方法带来的多重限制，同时在该领域引入了变革性的潜在应用。这种类器官技术最初由 Hans Clevers 及其同事于 2009 年提出，他们能够在含有 R-sponsin、EGF 和 Noggin 因子²⁰ 的 3D 基质凝胶中培养源自小鼠肠道的 Lgr5⁺ 干细胞，从而成功建立肠道类器官培养系统。几年后，即 2020 年，Koehler 的团队报告了一种类器?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Red Cap Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial	Corning	431420
50 mL Polypropylene Conical Tube	Corning	352070
100 mm TC-treated Cell Culture Dish	Corning	353003
105 mm Polystyrene Forceps Sterile	Caplugs Evergreen	222-1121-B1I
150 cm2 Cell Culture Flask	Corning	CLS430825
A83-01	Tocris	2939
Advanced DMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1)	Gibco	12634-010
B-27 Supplement (50x)	Gibco	17504-044
Brilliant Violet 510 anti-human Perforin Antibody	BioLegend	308120
Brilliant Violet 605 anti-human Ki-67 Antibody	BioLegend	350522
Brilliant Violet 650 anti-human CD366 (Tim-3) Antibody	BioLegend	345028
Brilliant Violet 711 anti-human CD45 Antibody	BioLegend	304050
Cell Culture Inserts 0.4 µm, 30 mm Diameter	Millipore Sigma	PIHP03050
Cell Staining Buffer	BioLegend	420201
Cell Strainer 40 µm Nylon	Corning	352340
Cell Strainer 70 µm Nylon	Corning	352350
Collagenase, Type IV, powder	Gibco	17104019
Cultrex Rat Collagen I	Trevigen	3440-100-01
Culture Plate, PS, 48 wells, TC treated with lid, sterile	Max Scientific	07-6048
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM - high glucose 4.5 mg/mL	Corning	MT10-0130CV
Dnase I - Grade II	Millipore Sigma	10104159001
DPBS, 1%	Corning	21-031-CV
Fetal Bovine Serum, FBS	Corning	MT35-010-CV
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I	BD Biosciences	556547
Forskolin	Tocris	1099
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)	ThermoFisher	10131035
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher	35050061
Ham's F12 Nutrient Mix	ThermoFisher	11765054
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Hygromycin B (50 mg/mL)	ThermoFisher	10687010
L-Glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-081
L-WRN cell	ATCC	CRL-3276
Matrigel Phenol Free & Growth Fact. Reduced	Corning	356231
Millex PVDF syringe filter, 0.22 μM	Millipore Sigma	SLGVR33RB
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-100G
Nunc TripleFlask Treated Cell Culture Flask	ThermoFisher	132867
PE/Cyanine5 anti-human CD8a Antibody	BioLegend	301010
PE-Cy 7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)	BD Biosciences	561272
Pen Strep	Gibco	15140-122
Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15-1MG
Recombinant Human FGF-acidic	Peprotech	100-17A
Sodium Bicarbonate Solution (NaHCO3) (7.5%)	Quality Biological	118-085-721
Stainless Steel Surgical Blades no. 22	Integra	4-322
TrypLE Express	Gibco	12604-021