Раскрытие терапевтических возможностей с помощью моделей органоидов, полученных от пациентов с меланомой

Резюме

Здесь мы представляем протокол получения органоидов, полученных от пациента с меланомой, путем культивирования диссоциированных клеточных суспензий из свежих тканей меланомы. Эти органоиды точно повторяют специфические для пациента опухоли in vitro, предлагая инновационный подход к изучению иммуносупрессивных механизмов опухолей, скрининга лекарств, механизмов лекарственной устойчивости и подходов к надзору за раком.

Аннотация

С развитием иммунотерапии существует постоянная потребность в разработке моделей, которые могут повторять опухолевое микроокружение нативных опухолей. В то время как традиционные двух- и трехмерные модели могут дать представление о развитии и прогрессировании рака, им не хватает важных аспектов, которые препятствуют точной имитации нативных опухолей. Альтернативной моделью, которая привлекла много внимания, является органоид, полученный от пациента. Развитие этих органоидов отражает сложную межклеточную коммуникацию, микроокружение опухоли и гистоархитектуру опухолей. В данной статье описан протокол создания моделей органоидов, полученных от пациента с меланомой. Чтобы проверить эти модели, мы оценили состав иммунных клеток, включая уровни экспрессии маркеров активации Т-клеток, чтобы подтвердить клеточную гетерогенность органоидов. Кроме того, чтобы описать потенциальную полезность MPDO в клеточной терапии, мы оценили цитотоксические возможности обработки органоидов γδ Т-клетками. В заключение следует отметить, что модели MPDO предлагают многообещающие возможности для понимания сложности опухоли, валидации терапевтических стратегий и потенциального продвижения персонализированного лечения.

Введение

Традиционные двумерные модели клеточных культур являются важными инструментами в исследованиях рака для изучения прогрессирования рака и его терапии¹. Эти модели не только позволяют в контролируемых экспериментальных условиях исследовать молекулярные и клеточные механизмы, лежащие в основе развития и прогрессирования рака, но и обеспечивают экономически эффективные и относительно быстрые экспериментальные результаты. Их использование, однако, ограничено из-за ограниченного клеточного разнообразия в опухолевом микроокружении (ТМЭ), которое не может быть воспроизведено в компланарном характере монокультурных моделей². Кроме того, модели клеточных культур предлагают чрезмерно упрощенную среду по сравнению с человеческим телом³. Таким образом, чтобы лучше понять прогрессирование рака и разработать эффективные методы лечения, исследователи обратились к инновационным моделям, которые нацелены на то, чтобы точно повторить ТМЭ в природе. Следовательно, поддержание верности нативным опухолям имеет первостепенное значение в этих моделях. Учитывая сложную природу рака, любое значительное отклонение от исходной опухоли может привести к непредвиденным переменным, которые могут исказить значимые выводы о поведении опухоли.

В то время как ксенотрансплантаты, полученные от пациента (PDX), стали модельной системой, позволяющей отслеживать прогрессирование опухоли in vivo, некоторые ограничения ставят под сомнение то, насколько хорошо развитая опухоль повторяет биологию рака^{человека.} Например, меланома TME содержит инфильтрирующие опухоль иммунные клетки и стромальные клетки. При прохождении в виде ксенотрансплантата нераковые клетки пациента будут постепенно теряться, что может привести к адаптациям, отличающимся от тех, которые используются в опухолях пациента. Хотя эти ограничения могут быть смягчены путем выполнения ограниченного пассажа PDX in vivo, различия между видами все же могут представлять риск генетических изменений PDX, которые отклоняются от таковых у нативной опухоли⁵. Кроме того, PDX-модели обычно создаются на мышах с ослабленным иммунитетом для предотвращения отторжения тканей человека. Это ограничивает возможность изучения роли иммунной системы хозяина в развитии рака, особенно в иммунотерапевтических исследованиях⁶. Мы и другие привили PDX «гуманизированным» мышам ^7,8. Тем не менее, создание PDX-моделей на гуманизированных мышах занимает много времени и денег. Разработка одной модели PDX на основе образца опухоли пациента может занять от нескольких месяцев до нескольких лет, что ограничивает скорость и масштаб исследования. Несмотря на эти ограничения, было показано, что модели PDX точно представляют биологию ТМЭ, таким образом, широко используются для разработки методов лечения рака, персонализированной медицины и иммунотерапии, среди прочего⁹.

Альтернативным методом 3D-культивирования является органоид пациента (PDO), при котором свежерезецированная опухоль пациента культивируется для создания моделей, поддерживающих фенотипическую гетерогенность, гистоархитектуру и межклеточные коммуникации^. Его способность быть очень похожим на нативные опухоли была продемонстрирована ранее, когда культивируемые органоиды из немышечно-инвазивного (NMIBC) и мышечно-инвазивного рака мочевого пузыря (MIBC) успешно повторили ключевые аспекты родительских опухолей¹¹. Благодаря своему потенциалу и преимуществам по сравнению с другими моделями, PDO предлагают широкий спектр специализированных приложений, которых нет в других моделях, включая, помимо прочего, изучение и разработку ингибиторов иммунных контрольных точек наряду с клеточной и таргетной терапией. Например, ранее мы использовали органоиды, полученные от пациентов с меланомой (MPDOs), для изучения способности инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TILs) расширяться антителами IL-2 и анти-PD1 (αPD-1). Результаты показали, что TILs, расширенные IL-2 и αPD-1, не только имеют большее количество, но также могут успешно инфильтровать MPDO и убивать клетки меланомы с более высокой эффективностью^{, чем} TILs, расширенные другими методами. Другие группы показали аналогичные результаты, когда использование анти-PD-1 и/или анти-PD-L1 приводит к тому, что TILs остаются функциональными в PDO, что впоследствии приводит к уничтожению опухоли¹³. Кроме того, наша группа также использовала MPDO для оценки инфильтрации γδ Т-клеток и их убивающей способности¹⁴. Применимость PDO охватывает широкий спектр областей, включая расширение TIL, исследования цитотоксичности и скрининг малых молекул. Все эти приложения подчеркивают потенциал и удобство использования, которые предоставляет эта модель. Таким образом, мы описываем подробный протокол для культуры MPDO.

протокол

Ткани меланомы человека были получены от пациентов, проходящих лечение в Университете Пенсильвании, с использованием протокола сбора тканей (UPCC08607), который одобрен Институциональным наблюдательным советом Университета Пенсильвании. Все пациенты подписали информированное согласие. После резекции тканей меланомы человека опухолевую ткань помещают в модифицированную среду Dulbecco Eagle Medium (DMEM) и выдерживают при температуре 4 °C до обработки (в течение 6 часов). Органоиды (MPDO) пациента с меланомой были получены из свежей опухоли, как показано на рисунке 1.

1. Выделение клеток из ткани меланомы человека

1. Подготовка перед началом процедуры
   ПРИМЕЧАНИЕ: Два метода культивирования (Матригель и коллагеновый гель) могут быть использованы для культивирования диссоциированной ткани меланомы:
   1. Для метода Матригель: Приготовьте раствор покрытия матрицы базальной мембраны с пониженным фактором роста (GFR) путем разбавления матрицы базальной мембраны GFR органоидной питательной средой (см. таблицу 1) в соотношении 1:2. Добавьте приблизительно 115 мкл размороженного раствора в каждую из нескольких лунок 48-луночного планшета и оставьте его затвердевать на 30 мин при 37 °C в увлажненном инкубаторе.
   2. Для метода с коллагеновым гелем: Добавьте 1 мл коллагенового геля (см. Таблицу 1) во внутреннюю мембранную вставку диаметром 30 мм. Дайте гелю застыть в течение 30 минут при температуре 37 °C в увлажненном инкубаторе.
2. Приготовьте кондиционированную среду L-WRN¹⁵. Кондиционированная среда L-WRN производится из клеточной линии L-WRN, сконструированной для секреции Wnt3a, R-спондина 3 и ноггина в единую кондиционированную среду, которая широко используется для культивирования клеток.
   1. Разморозьте криопробирку с клетками L-WRN на водяной бане при температуре 37 °C. Добавьте 5 мл среды L-клеток (см. Таблицу 1) и суспензию клеток L-WRN в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 120 × г в течение 5 мин при 4 °C. Аспирируйте надосадочную жидкость, следя за тем, чтобы ~500 мкл осталось на дне для ресуспендии гранул клеток.
   2. Перенесите клеточную гранулу в надосадочную жидкость в 30 мл L-клеточной среды на льду и добавьте 150 мкл гигромицина (500 мкг/мл) и 300 мкл G418 (500 мкг/мл). Засейте клетки при плотности 3 × 10⁶ в колбе Т-150 и инкубируйте при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5%_CO2 до ~90% конфлюента.
   3. После того, как клетки слились на ~90%, разделите клетки на пять колб Т-150 путем промывания 20 мл фосфатно-солевого буфера (PBS), аспирации и расщепления 3 мл заменителя трипсина. Через 5 мин нейтрализовать 9 мл среды L-клеток с последующим центрифугированием в течение 5 мин при 120 × г при 4 °C. Когда ~100% сливается, разделите пять колб Т-150 на 10 3-слойных колб Т-175.
   4. После слияния промойте ячейки 2 x 50 мл PBS, а затем 25 мл моющего средства (см. Таблицу 1).
   5. Добавьте по 75 мл первичной питательной среды в каждую 3-слойную колбу T-175 и инкубируйте в течение 3 дней при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5%_CO2 (см. Таблицу 1).
   6. Через 3 дня соберите кондиционированную среду в коническую форму объемом 50 мл и отжимайте при 1 100 × г в течение 5 минут при 4 °C. Соберите надосадочную жидкость (кондиционированную среду), следя за тем, чтобы осталось 5 мл жидкости.
   7. Добавьте свежее 75 мл первичной среды для культивирования клеток в каждую 3-слойную колбу T-175 и инкубируйте еще 3 дня для сбора дополнительной кондиционированной среды.
   8. К собранной кондиционированной среде добавить равный объем первичной среды для клеточных культур (50% объема) и вакуумировать содержимое с помощью фильтра 0,22 мкм. Храните аликвоты в пробирках объемом 50 мл и храните при температуре -20 °C для длительного использования или при 4 °C в течение 2-3 недель. Используйте эту среду в качестве дополнения к органоидным питательным средам (см. Таблицу 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разморозьте аликвоты при 4 °C в течение ночи перед использованием.
3. Заготовка клеточной смеси из свежей ткани меланомы
   1. Промойте только что резецированную ткань меланомы в чашке Петри объемом 10 мл с моющим средством. После первого полоскания с помощью стерильного пинцета перенесите опухоль во вторую чашку Петри для дальнейшего промывания и повторите этот процесс 3 раза на льду, чтобы сохранить целостность и жизнеспособность опухоли. На протяжении всех циклов полоскания используйте стерильные ножницы и лезвие для удаления излишков соединительной ткани, жира и остаточной крови. После трех мытья поместите опухоль в пустую чашку Петри и с помощью стерильных лезвий мелко измельчите ее.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После измельчения опухоль должна иметь гелеобразную консистенцию. Чем мельче измельчение опухоли, тем выше будет выход клеток. Это связано с тем, что большие скопления опухоли будут более сложными для переваривания и могут не пройти через 70 μм нейлоновый клеточный фильтр на следующем этапе.
   2. После того, как опухолевая ткань будет тщательно промыта и измельчена, переложите ее в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую 10 мл приготовленной среды для разложения (см. Таблицу 1). Поместите конус на водяную баню при температуре 37 °C, следя за тем, чтобы содержимое переливалось каждые 5 минут.
   3. Через 25 минут добавьте 30 мл среды ADMEM/F12, содержащей 10% FBS, чтобы остановить пищеварение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Указанные количества предназначены для опухолей массой не более 0,2 г.
   4. Отфильтруйте расщепленную клеточную суспензию через нейлоновое клеточное ситечко размером 70 мкм, затем промойте ситечко средой с уменьшенным содержанием сыворотки ADMEM/F12 (1x) (1:1), содержащей 10% FBS. После промывки с помощью пипетки удалите остатки фильтра на дне фильтра, чтобы обеспечить извлечение максимально возможного количества клеток. Затем центрифугируйте при 300 × г в течение 7 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в органоидной питательной среде (см. табл. 1).
   5. Культивируйте суспензию одиночных клеток меланомы в системах культивирования Matrigel или коллагена:
      1. Матригель: Подсчитайте суспензию одиночных клеток, чтобы убедиться, что примерно 2 × 10⁵ клеток засеяны в предварительно подогретые лунки, покрытые Матригелем, с добавлением 200 мкл органоидной питательной среды.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды на основе матригеля используются для изучения патофизиологии, скрининга эффективности лекарств и проверки токсичности лекарств¹⁶.
      2. Коллагеновый гель: Подсчитайте суспензию одиночных клеток, чтобы убедиться, что примерно 10-6 клеток смешаны с 1 мл коллагенового геля. Добавьте смесь в предварительно затвердевшие мембранные вставки из коллагенового геля и поместите их в 6-луночную пластину. Добавьте достаточное количество органоидной питательной среды, чтобы погрузить вставки, содержащие клетки и коллагеновый гель.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды коллагенового геля используются для измерения миграции Т-клеток и изучения развития тканей¹⁶.
   6. Дайте органоидам вырасти, добавляя свежую среду каждые 3 дня.
   7. Пропустите органоиды, как только они достигнут размера 150-200 мкм, или криоконсервируйте их до дальнейшего использования.
      1. Для прохождения органоидов переложите органоиды в коническую форму объемом 15 мл и промойте 1x DPSB. Центрифугируйте смесь при 300 × г в течение 7 мин при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость и добавьте заменитель трипсина (50-100 мкл на органоид) в течение 10 минут на водяной бане при температуре 37 °C, следя за тем, чтобы содержимое переполнялось каждые 3 минуты.
      2. Остановите пищеварение с помощью среды ADMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1), содержащей 10% FBS. Смесь центрифугировать при 300 × г в течение 7 мин и повторно суспендировать в органоидной питательной среде.
      3. Засейте суспензию одиночных клеток в новую лунку, покрытую Матригелем/Коллагеном, при той же начальной плотности посева (2 × 10⁵ клеток в 200 мкл органоидных питательных сред для лунок, покрытых Матригелем, в 48-луночном планшете или 10⁶ клеток в 1 мл органоидных питательных сред для 30 мм внутренней мембранной вставки, покрытой коллагеном).
      4. Для криоконсервации МПДО с использованием заменителя трипсина превращают в одиночные клеточные суспензии с последующей ресуспензией 10⁶ клеток в 1 мл замораживающей среды (см. таблицу 1).

Результаты

Форма и размер MPDO контролировались с течением времени для изучения динамики их роста. Как видно на рисунке 2, в течение начального периода роста размер органоидов значительно увеличился в течение изображенных 7 дней. После наблюдения за динамикой рост?...

Обсуждение

Появление PDO устранило многочисленные ограничения, связанные с другими ранее установленными методами исследования рака, и в то же время представило преобразующие потенциальные приложения в этой области. Эта органоидная технология была первоначально предложена в 2009...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Red Cap Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial	Corning	431420
50 mL Polypropylene Conical Tube	Corning	352070
100 mm TC-treated Cell Culture Dish	Corning	353003
105 mm Polystyrene Forceps Sterile	Caplugs Evergreen	222-1121-B1I
150 cm2 Cell Culture Flask	Corning	CLS430825
A83-01	Tocris	2939
Advanced DMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1)	Gibco	12634-010
B-27 Supplement (50x)	Gibco	17504-044
Brilliant Violet 510 anti-human Perforin Antibody	BioLegend	308120
Brilliant Violet 605 anti-human Ki-67 Antibody	BioLegend	350522
Brilliant Violet 650 anti-human CD366 (Tim-3) Antibody	BioLegend	345028
Brilliant Violet 711 anti-human CD45 Antibody	BioLegend	304050
Cell Culture Inserts 0.4 µm, 30 mm Diameter	Millipore Sigma	PIHP03050
Cell Staining Buffer	BioLegend	420201
Cell Strainer 40 µm Nylon	Corning	352340
Cell Strainer 70 µm Nylon	Corning	352350
Collagenase, Type IV, powder	Gibco	17104019
Cultrex Rat Collagen I	Trevigen	3440-100-01
Culture Plate, PS, 48 wells, TC treated with lid, sterile	Max Scientific	07-6048
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM - high glucose 4.5 mg/mL	Corning	MT10-0130CV
Dnase I - Grade II	Millipore Sigma	10104159001
DPBS, 1%	Corning	21-031-CV
Fetal Bovine Serum, FBS	Corning	MT35-010-CV
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I	BD Biosciences	556547
Forskolin	Tocris	1099
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)	ThermoFisher	10131035
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher	35050061
Ham's F12 Nutrient Mix	ThermoFisher	11765054
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Hygromycin B (50 mg/mL)	ThermoFisher	10687010
L-Glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-081
L-WRN cell	ATCC	CRL-3276
Matrigel Phenol Free & Growth Fact. Reduced	Corning	356231
Millex PVDF syringe filter, 0.22 μM	Millipore Sigma	SLGVR33RB
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-100G
Nunc TripleFlask Treated Cell Culture Flask	ThermoFisher	132867
PE/Cyanine5 anti-human CD8a Antibody	BioLegend	301010
PE-Cy 7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)	BD Biosciences	561272
Pen Strep	Gibco	15140-122
Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15-1MG
Recombinant Human FGF-acidic	Peprotech	100-17A
Sodium Bicarbonate Solution (NaHCO3) (7.5%)	Quality Biological	118-085-721
Stainless Steel Surgical Blades no. 22	Integra	4-322
TrypLE Express	Gibco	12604-021