Раскрытие терапевтических возможностей с помощью моделей органоидов, полученных от пациентов с меланомой

Резюме

Здесь мы представляем протокол получения органоидов, полученных от пациента с меланомой, путем культивирования диссоциированных клеточных суспензий из свежих тканей меланомы. Эти органоиды точно повторяют специфические для пациента опухоли in vitro, предлагая инновационный подход к изучению иммуносупрессивных механизмов опухолей, скрининга лекарств, механизмов лекарственной устойчивости и подходов к надзору за раком.

Аннотация

С развитием иммунотерапии существует постоянная потребность в разработке моделей, которые могут повторять опухолевое микроокружение нативных опухолей. В то время как традиционные двух- и трехмерные модели могут дать представление о развитии и прогрессировании рака, им не хватает важных аспектов, которые препятствуют точной имитации нативных опухолей. Альтернативной моделью, которая привлекла много внимания, является органоид, полученный от пациента. Развитие этих органоидов отражает сложную межклеточную коммуникацию, микроокружение опухоли и гистоархитектуру опухолей. В данной статье описан протокол создания моделей органоидов, полученных от пациента с меланомой. Чтобы проверить эти модели, мы оценили состав иммунных клеток, включая уровни экспрессии маркеров активации Т-клеток, чтобы подтвердить клеточную гетерогенность органоидов. Кроме того, чтобы описать потенциальную полезность MPDO в клеточной терапии, мы оценили цитотоксические возможности обработки органоидов γδ Т-клетками. В заключение следует отметить, что модели MPDO предлагают многообещающие возможности для понимания сложности опухоли, валидации терапевтических стратегий и потенциального продвижения персонализированного лечения.

Введение

Традиционные двумерные модели клеточных культур являются важными инструментами в исследованиях рака для изучения прогрессирования рака и его терапии¹. Эти модели не только позволяют в контролируемых экспериментальных условиях исследовать молекулярные и клеточные механизмы, лежащие в основе развития и прогрессирования рака, но и обеспечивают экономически эффективные и относительно быстрые экспериментальные результаты. Их использование, однако, ограничено из-за ограниченного клеточного разнообразия в опухолевом микроокружении (ТМЭ), которое не может быть воспроизведено в компланарном характере монокультурных моде....

протокол

Ткани меланомы человека были получены от пациентов, проходящих лечение в Университете Пенсильвании, с использованием протокола сбора тканей (UPCC08607), который одобрен Институциональным наблюдательным советом Университета Пенсильвании. Все пациенты подписали информированное согласие. После резекции тканей меланомы человека опухолевую ткань помещают в модифицированную среду Dulbecco Eagle Medium (DMEM) и выдерживают при температуре 4 °C до обработки (в течение 6 часов). Органоиды (MPDO) пациента с меланомой были получены из свежей опухоли, как показано на рисунке 1.

1. Вы....

Результаты

Форма и размер MPDO контролировались с течением времени для изучения динамики их роста. Как видно на рисунке 2, в течение начального периода роста размер органоидов значительно увеличился в течение изображенных 7 дней. После наблюдения за динамикой рост?.......

Обсуждение

Появление PDO устранило многочисленные ограничения, связанные с другими ранее установленными методами исследования рака, и в то же время представило преобразующие потенциальные приложения в этой области. Эта органоидная технология была первоначально предложена в 2009.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Red Cap Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial	Corning	431420
50 mL Polypropylene Conical Tube	Corning	352070
100 mm TC-treated Cell Culture Dish	Corning	353003
105 mm Polystyrene Forceps Sterile	Caplugs Evergreen	222-1121-B1I
150 cm2 Cell Culture Flask	Corning	CLS430825
A83-01	Tocris	2939
Advanced DMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1)	Gibco	12634-010
B-27 Supplement (50x)	Gibco	17504-044
Brilliant Violet 510 anti-human Perforin Antibody	BioLegend	308120
Brilliant Violet 605 anti-human Ki-67 Antibody	BioLegend	350522
Brilliant Violet 650 anti-human CD366 (Tim-3) Antibody	BioLegend	345028
Brilliant Violet 711 anti-human CD45 Antibody	BioLegend	304050
Cell Culture Inserts 0.4 µm, 30 mm Diameter	Millipore Sigma	PIHP03050
Cell Staining Buffer	BioLegend	420201
Cell Strainer 40 µm Nylon	Corning	352340
Cell Strainer 70 µm Nylon	Corning	352350
Collagenase, Type IV, powder	Gibco	17104019
Cultrex Rat Collagen I	Trevigen	3440-100-01
Culture Plate, PS, 48 wells, TC treated with lid, sterile	Max Scientific	07-6048
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM - high glucose 4.5 mg/mL	Corning	MT10-0130CV
Dnase I - Grade II	Millipore Sigma	10104159001
DPBS, 1%	Corning	21-031-CV
Fetal Bovine Serum, FBS	Corning	MT35-010-CV
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I	BD Biosciences	556547
Forskolin	Tocris	1099
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)	ThermoFisher	10131035
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher	35050061
Ham's F12 Nutrient Mix	ThermoFisher	11765054
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Hygromycin B (50 mg/mL)	ThermoFisher	10687010
L-Glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-081
L-WRN cell	ATCC	CRL-3276
Matrigel Phenol Free & Growth Fact. Reduced	Corning	356231
Millex PVDF syringe filter, 0.22 μM	Millipore Sigma	SLGVR33RB
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-100G
Nunc TripleFlask Treated Cell Culture Flask	ThermoFisher	132867
PE/Cyanine5 anti-human CD8a Antibody	BioLegend	301010
PE-Cy 7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)	BD Biosciences	561272
Pen Strep	Gibco	15140-122
Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15-1MG
Recombinant Human FGF-acidic	Peprotech	100-17A
Sodium Bicarbonate Solution (NaHCO3) (7.5%)	Quality Biological	118-085-721
Stainless Steel Surgical Blades no. 22	Integra	4-322
TrypLE Express	Gibco	12604-021