JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يحدد هذا البروتوكول الخطوات التفصيلية للفحص المجهري الإلكتروني المناعي قبل التضمين ، مع التركيز على استكشاف الدوائر المشبكية وتوطين البروتين في شبكية العين.

Abstract

تتكون شبكية العين من العديد من الخلايا التي تشكل دوائر عصبية متنوعة ، والتي تشكل المرحلة الأولى من المسار البصري. تتميز كل دائرة بميزات فريدة وناقلات عصبية متميزة ، تحدد دورها وأهميتها الوظيفية. بالنظر إلى أنواع الخلايا المعقدة داخل هيكلها ، فإن تعقيد الدوائر العصبية في شبكية العين يشكل تحديات للاستكشاف. للتحقيق بشكل أفضل في دوائر الشبكية والحديث المتبادل ، مثل الرابط بين المسارات المخروطية والقضيب ، والتوطين الجزيئي الدقيق (الناقلات العصبية أو الببتيدات العصبية) ، مثل وجود تفاعل مناعي يشبه المادة P في شبكية العين على الفأر ، استخدمنا طريقة المجهر الإلكتروني المناعي قبل التضمين (immuno-EM) لاستكشاف الروابط المشبكية والتنظيم. يمكننا هذا النهج من تحديد اتصالات متشابكة محددة بين الخلايا وتحديد الموقع الجزيئي الدقيق ويمكن أن يلعب دورا توجيهيا في استكشاف وظيفته. توضح هذه المقالة البروتوكول والكواشف المستخدمة والخطوات التفصيلية ، بما في ذلك (1) إعداد تثبيت شبكية العين ، (2) التضمين المسبق للمناعة ، و (3) التثبيت والتضمين اللاحق.

Introduction

يمثل تعقيد الدوائر العصبية في شبكية العين تحديات للاستكشاف ، مع الأخذ في الاعتبار أنواع الخلايا المتنوعة داخل هيكلها 1,2. تتضمن الخطوة الأولى تحديد الروابط المشبكية بين الخلايا المختلفة وتحديد التوطين الخلوي لناقلات عصبية معينة أو ببتيدات عصبية. مع تقدم البيولوجيا الجزيئية لإدخال بروتينات جديدة ، يصبح التوطين الدقيق في شبكية العين أمرا بالغ الأهمية لفهم وظائفها وتحليل دوائر الشبكية والوصلات المشبكية3،4،5.

نظرا للدقة المحدودة للفحص المجهري الضوئي ، يستخدم المجهر الإلكتروني (EM) بشكل شائع للكشف عن الهياكل تحت الخلوية للخلايا العصبية. يحتوي EM على تصنيفات مختلفة ، مع استخدام المجهر الإلكتروني التقليدي (TEM) لمراقبة الهياكل الفائقة للخلايا6،7،8،9. المجهر الإلكتروني المناعي (immuno-EM) ، الذي يجمع بين الدقة المكانية ل EM مع القدرة على التعرف الكيميائي للأجسام المضادة المرتبطة على وجه التحديد بالبروتينات10 ، يبرز كطريقة مثالية وحصرية للتحقيق في الاتصالات المشبكية وتوطين البروتين تحت الخلوي في شبكية العين11,12.

يمكن تقسيم تقنيات EM المناعية إلى طرق ما قبل التضمين وما بعد التضمين بناء على ترتيب التضمين وحضانة الأجسام المضادة. بالمقارنة مع طريقة ما بعد التضمين ، فإن نهج ما قبل التضمين قادر على تحديد13،14،15 على نطاق واسع وبعيد المدى ، مما يوفر نهجا مثاليا لدراسة عمليات الخلايا مثل المحاور العصبية والتشعبات. بالإضافة إلى ذلك ، توفر هذه التقنية إشارة قوية ومجال رؤية واسع ، مما يجعلها مفيدة للتحقيقات الشاملة للتعبير البروتيني والتوطين الجزيئي في السيتوبلازم. تثبت هذه الطريقة قيمتها بشكل خاص في ضمان الهياكل المحددة كيميائيا والتي تكون مرئية في جميع أنحاء السيتوبلازم أو الخلايا أو شبكية العين بأكملها.

ومع ذلك ، فإن طريقة ما بعد التضمين ، على الرغم من انخفاض الاختراق أو الانتشار مقارنة بطريقة التضمين المسبق ، ليست حساسة16,17. بعبارات بسيطة ، إذا كان الهدف هو استكشاف توطين ناقلات عصبية معينة في السيتوبلازم أو المحطات المشبكية ، فإن التضمين المسبق المناعي EM هو الطريقة المفضلة. على العكس من ذلك ، لتحديد توطين مستقبلات الغشاء ، يوصى باستخدام EM المناعي بعد التضمين.

بالنظر إلى هذه الاعتبارات ، نختار طريقة التضمين المسبق المناعي الكهرومغناطيسي للتعمق في دوائر الشبكية ، بما في ذلك التفاعل بين المسارات المخروطية والقضيب ، والتوطين الجزيئي ، مثل التوزيع والتنظيم المشبكي للمادة P-LIKE IMMUNOACTIVITY (SP-IR) في شبكية الفأر.

Protocol

تمت الموافقة على رعاية والتعامل معها من قبل لائحة لجنة الأخلاقيات بجامعة ونتشو الطبية وفقا لإرشادات ARVO. تم استخدام الفئران البالغة (C57BL / 6J ، ذكورا وإناثا ، من 8 إلى 12 أسبوعا من العمر) في هذا البحث. يتم سرد المعدات والكواشف اللازمة للدراسة في جدول المواد.

1. التحضير لتثبيت الشبكية

  1. قم بتجميع المواد والأدوات التالية: مجهر تشريح ، وملقطان بأطراف دقيقة جدا ، ومقص ، وإبرة حقنة سعة 1 مل (حجم الإبرة: G26) ، وورق ترشيح.
  2. تخدير الفئران بعمق عن طريق الحقن داخل الصفاق من 2،2،2-ثلاثي برومو إيثانول عند 0.25 ملغ / غرام من وزن الجسم. بعد ذلك ، قطع رأس الفئران وقطع رؤوسهم16.
  3. قم باستئصال عيونهم بمقص الكوع ووضعها في طبق زجاجي يحتوي على 4٪ بارافورمالدهايد -0.2٪ حمض البكريك في 0.1 M فوسفات عازلة (PB ؛ درجة الحموضة 7.4).
  4. تحت المجهر التشريحي ، قم بعمل ثقب في طرف القرنية باستخدام إبرة حقنة سعة 1 مل وقطع الجزء الأمامي بالمقص ، بعد الثقب. ثم قم بإزالة العدسة من سطح الشبكية الداخلي بالملقط.
  5. استخدم ملقطين لتقشير الصلبة بعناية حتى يتم عزل الشبكية تماما عن فنجان العين (نسيج الشبكية الكوب المنفصل عن المشيمية تماما). في وقت لاحق ، قطع شبكية العين إلى أربع قطع.
  6. ثبت هذه المقاطع في 4٪ بارافورمالدهايد -0.2٪ حمض البكريك في 0.1 M PB (درجة الحموضة 7.4) لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة (RT) ، ثم انقل الأنسجة إلى 4٪ بارافورمالدهيد في 0.1 M PB (درجة الحموضة 10.4) طوال الليل عند 4 درجات مئوية.

2. التضمين المسبق للمناعة

  1. بعد الغسيل في 0.01 M PBS (درجة الحموضة 7.4) ست مرات لمدة 10 دقائق لكل منها ، احتضان أنسجة الشبكية في 1٪ بوروهيدريد الصوديوم (NaBH4) في 0.01 M PBS (درجة الحموضة 7.4) لمدة 30 دقيقة.
  2. اغسل أقسام الشبكية في 0.01 M PBS (درجة الحموضة 7.4) ست مرات على الأقل. في هذه الأثناء ، قم بإزالة الجسم الزجاجي بورق الترشيح ثم قطع شبكية العين إلى شرائح صغيرة تتراوح بين 100-300 ميكرومتر باستخدام شفرة حلاقة ذات حدين.
  3. بعد الحجب باستخدام مصل الماعز الطبيعي بنسبة 5٪ (NGS) في 0.1 M PB (درجة الحموضة 7.4) لمدة ساعة واحدة في RT ، احتضان شرائح الشبكية بالأجسام المضادة الأولية (Anti-rabbit PKCα، 1:80; Anti-Rabbit SP ، 1: 100) جنبا إلى جنب مع 2٪ NGS في 0.01 M PBS (درجة الحموضة 7.4) لمدة 2 ساعة في RT على شاكر. بعد ذلك ، احتضان لمدة 96 ساعة (5 أيام) عند 4 درجات مئوية على شاكر.
  4. بعد الغسيل ست مرات لمدة 10 دقائق لكل منها في 0.01 M PBS (درجة الحموضة 7.4) ، احتضان شرائح الشبكية بالجسم المضاد الثانوي عند 1: 200 ، مثل الماعز المضاد للأرانب IgG ، جنبا إلى جنب مع 2٪ NGS في 0.01 M PBS (درجة الحموضة 7.4) لمدة ساعتين في RT على شاكر. بعد ذلك ، احتضان لمدة 48 ساعة (2 أيام) عند 4 درجات مئوية على شاكر.
    ملاحظة: تم تطبيق الأجسام المضادة الثانوية وحدها في تجارب التحكم.
  5. اغسل خطوط الشبكية في 0.01 M PBS (درجة الحموضة 7.4) ست مرات لمدة 10 دقائق لكل منها قبل الحضانة بالكاشف A والكاشف B من مجموعة ABC في 1: 100 في 0.01M PBS (درجة الحموضة 7.4) لمدة يومين عند 4 درجات مئوية. (تم تخفيف كل من الكاشف A والكاشف B ب 0.01 M PBS. على سبيل المثال: الحل: 6 ميكرولتر ؛ محلول ب: 6 ميكرولتر ؛ 0.01 م PBS: 588 ميكرولتر ، إجمالي 600 ميكرولتر).
  6. اغسل خطوط الشبكية في محلول 0.05 متر Tris (درجة الحموضة 7.2) ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها. بعد ذلك ، قم باحتضان خطوط الشبكية مسبقا باستخدام كاشف 5٪ 1 وكاشف 5٪ 3 من مجموعة DAB في الماء المقطر لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. (النسبة على سبيل المثال: الكاشف 1: 50 ميكرولتر ؛ الكاشف 3: 50 ميكرولتر ؛ الماء المقطر: 900 ميكرولتر ، إجمالي 1000 ميكرولتر).
  7. تلطيخ خطوط الشبكية مع DAB. أضف نفس حجم المحلول من ثلاثة أنابيب في مجموعة DAB بالتسلسل (الكاشف 1-الكاشف 2-الكاشف 3). مراقبة حالة تلطيخ باستخدام المجهر تشريح. وقف تلطيخ عندما تصبح الخلايا بنية. تستغرق هذه العملية 10-20 دقيقة.
  8. اغسل خطوط الشبكية بمحلول 0.05 متر تريس (درجة الحموضة 7.2) ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها ثم اغسلها في 0.01 متر PBS ست مرات لمدة 10 دقائق لكل منها.

3. التثبيت والتضمين

  1. ثبت خطوط الشبكية في 2٪ جلوتارالدهيد لمدة 1-2 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT) ، ثم اغسلها في 0.01 متر PBS (درجة الحموضة 7.4) ست مرات لمدة 10 دقائق لكل منها.
  2. احتضان خطوط الشبكية مع 1٪ رابع أكسيد الأوزميوم (OsO4) في 0.1 M PB لمدة 1 ساعة في RT واحتفظ بها في مكان مظلم.
  3. بعد الغسيل في الماء المقطر (ddH2O) ست مرات لمدة 10 دقائق لكل منها ، احتضان أنسجة الشبكية مع أسيتات اليورانيل لمدة 1 ساعة في RT واحتفظ بها في مكان مظلم لتلطيخ هذه الأنسجة.
  4. ضع أنسجة الشبكية في محاليل الأسيتون (50٪ ، 70٪ ، 80٪ ، و 90٪) لمدة 10 دقائق لكل منها ، ثم في 100٪ مرتين لمدة 10 دقائق لكل منهما.
  5. اغمس أنسجة الشبكية في خليط يحتوي على نفس الحجم من أسيتات اليورانيل وراتنجات الإيبوكسي لمدة ساعة واحدة عند فرن تجفيف 37 درجة مئوية ، متبوعا بخليط يحتوي على أسيتات اليورانيل والراتنج (1: 4) طوال الليل عند فرن تجفيف 37 درجة مئوية.
  6. انقل أنسجة الشبكية برفق باستخدام عود أسنان إلى الراتنج الجديد لمدة 1 ساعة عند 45 درجة مئوية في فرن تجفيف ، ثم يتم تضمين شريط الشبكية الموجه في لوحة التضمين مع الراتنج.
  7. ضع العينة في فرن تجفيف 45 درجة مئوية لمدة 3 ساعات وفرن تجفيف 65 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
  8. قم بتشكيل كتل التضمين في شبه منحرف وقطع الكتلة إلى أقسام بسمك 1 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم فائق ، وقم بتلطيخ هذه الأقسام باللون الأزرق التولويدين ، ومناطق الفحص المسبق ذات الأهمية تحت المجهر الضوئي.
  9. اجمع المقاطع فائقة النحافة (70-90 نانومتر) على شبكات نحاسية واعرضها تحت المجهر الإلكتروني.

النتائج

يوضح الشكل 1 أمثلة على تجارب التحكم دون احتضان الأجسام المضادة الأولية ضد بروتين كيناز C alpha (PKCα) أو SP ، حيث لم يتم العثور على نشاط مناعي (IR).

يوضح الشكل 2 PKCα-IR في شبكية الفأر. يعمل PKCα كعلامة لجميع الخلايا ثنائية القطب (RBC) في شبك...

Discussion

وصفت هذه المقالة ثلاث خطوات حاسمة للمراقبة الناجحة للدوائر المشبكية وتوطين البروتين: (1) التثبيت السريع والضعيف ، (2) التضمين المسبق للمناعة ، و (3) التثبيت والتضمين اللاحق.

نقترح أن التثبيت هو الخطوة الأساسية لنهج EM المناعي المقبول الناجح. وبالتالي ، يتم ال?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي إفصاحات.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح من البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2022YFA1105503) ، ومختبر الدولة الرئيسي لعلم الأعصاب (SKLN-202103) ، ومؤسسة تشجيانغ للعلوم الطبيعية في الصين (Y21H120019).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringe needlekangdelai
1% OsO4Electron Microscopy Science19100
2,2,2-TribromoethanolSigma-AldrichT48402
8% GlutaraldehydeElectron Microscopy Science16020
8% ParaformaldehydeElectron Microscopy Science157-8
AcetoneElectron Microscopy Science10000
Anti-rabbit PKCSigma-AldrichP4334
Anti-Rabbit SPAbcamab67006
DAB Substrate kitMXB BiotechnologiesKIT-9701/9702/9703
Elbow scissorsSuzhou66 vision company54010
Electron microscopePhillipsCM120
Epon resinElectron Microscopy Science14910
forcepSuzhou66 vision companyS101A
Millipore filter paperMerck Millipore PR05538
Na2HPO4· 12H2OSigma71650A component of phosphate buffer
NaH2PO4· H2OSigma71507A component of phosphate buffer
Picric acidElectron Microscopy Science19550
Sodium borohydride (NaBH4) Sigma215511
TrisSolarbio917R071
UltramicrotomeLeica
Uranyl acetateElectron Microscopy Science22400
VACTASTAIN ABC kit, Peroxidase (Rabbit IgG)Vector LaboratoriesPK-4001

References

  1. Chua, N. J., et al. A complete reconstruction of the early visual system of an adult insect. Curr Biol. 33 (21), 4611-4623.e4614 (2023).
  2. Ravi Chander, P., Hanson, L., Chundekkad, L., Awatramani, G. B. Neural circuits underlying multi-feature extraction in the retina. J Neurosci. , (2023).
  3. Sirivisoot, S., et al. Development and characterization of mouse anti-canine PD-L1 monoclonal antibodies and their expression in canine tumors by immunohistochemistry in vitro. Vet Q. 43 (1), 1-9 (2023).
  4. Raeisi, H., et al. Development and characterization of phage display-derived anti-toxin antibodies neutralizing TcdA and TcdB of Clostridioides difficile. Microbiol Spectr. 11 (5), e0531022 (2023).
  5. Ryschich, A., Dong, Y., Schäfer, M., Ryschich, E., Karakhanova, S. DWH24: A new antibody for fluorescence-based cell death analysis. Methods Appl Fluoresc. 11 (4), (2023).
  6. Jastrzebska, B., et al. Functional characterization of rhodopsin monomers and dimers in detergents. J Biol Chem. 279 (52), 54663-54675 (2004).
  7. Huang, P., et al. Mechanism of Shenfu injection in suppressing inflammation and preventing sepsis-induced apoptosis in murine cardiomyocytes based on network pharmacology and experimental validation. J Ethnopharmacol. 322, 117599 (2024).
  8. Maheshwari, U., et al. Inorganic phosphate exporter heterozygosity in mice leads to brain vascular calcification, microangiopathy, and microgliosis. Brain Pathol. 33 (6), e13189 (2023).
  9. Mackiewicz, J., et al. Effect of gravity in long-term vitreous tamponade: In vivo investigation using perfluorocarbon liquids and semi-fluorinated alkanes. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 245 (5), 665-675 (2007).
  10. Luján, R., Rubio, M. E. Editorial: Immunoelectron microscopy: Placing molecular functions within a neuronal context. Front Neuroanat. 16, 1043371 (2022).
  11. Xu, S., et al. Synaptic changes and the response of microglia in a light-induced photoreceptor degeneration model. Mol Vis. 27, 206-220 (2021).
  12. Chadha, A., Volland, S., Baliaouri, N. V., Tran, E. M., Williams, D. S. The route of the visual receptor rhodopsin along the cilium. J Cell Sci. 132 (10), jcs.229526 (2019).
  13. Huang, H. J., et al. Multiple nucleocapsid structural forms of shrimp white spot syndrome virus suggests a novel viral morphogenetic pathway. Int J Mol Sci. 24 (8), 7525 (2023).
  14. Tissarinen, P., et al. Elevated human placental heat shock protein 5 is associated with spontaneous preterm birth. Pediatr Res. 94 (2), 520-529 (2023).
  15. Huang, Z., et al. A neural tract tracing study on synaptic connections for cortical glutamatergic terminals and cervical spinal calretinin neurons in rats. Front Neural Circuits. 17, 1086873 (2023).
  16. Zhang, J., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Diamond, J. S. High-resolution quantitative immunogold analysis of membrane receptors at retinal ribbon synapses. J Vis Exp. 108, e53547 (2016).
  17. Ottersen, O. P., Landsend, A. S. Organization of glutamate receptors at the synapse. Eur J Neurosci. 9 (11), 2219-2224 (1997).
  18. Greferath, U., Grünert, U., Wässle, H. Rod bipolar cells in the mammalian retina show protein kinase C-like immunoreactivity. J Comp Neurol. 301 (3), 433-442 (1990).
  19. Wang, F., et al. Distribution and synaptic organization of substance P-like immunoreactive neurons in the mouse retina. Brain Struct Funct. 228 (7), 1703-1724 (2023).
  20. van Opbergen, C. J. M., et al. 34;Orphan" Connexin43 in Plakophilin-2 deficient hearts revealed by volume electron microscopy. Front Cell Dev Biol. 10, 843687 (2022).
  21. Li, S., et al. Safe and efficient oral allergy immunotherapy using one-pot-prepared mannan-coated allergen nanoparticles. Biomaterials. 303, 122381 (2023).
  22. Yamashita, K., Kusakabe, M., Sano, M. A simple and rapid method of dissociating hepatocytes from fixed liver of the mouse. Stain Technol. 56 (1), 29-33 (1981).
  23. Tanabe, T., Shin, M., Fujiwara, K. Immunoelectron microscopy study of polyamines using a newly prepared monoclonal antibody against spermidine: use of a mixture of glutaraldehyde and paraformaldehyde as a cross-linking agent in the preparation of the antigen. J Biochem. 135 (4), 501-507 (2004).
  24. Xiao, J., et al. Rod bipolar cells receive cone photoreceptor inputs through both invaginating synapses and flat contacts in the mouse and guinea pig retinas. J Comp Neurol. 531 (11), 1184-1197 (2023).
  25. Yang, Q., et al. Expression of α-Synuclein in the mouse retina is confined to inhibitory presynaptic elements. J Comp Neurol. 531 (10), 1057-1079 (2023).
  26. Yazulla, S., Studholme, K. M., Zucker, C. L. Synaptic organization of substance P-like immunoreactive amacrine cells in goldfish retina. J Comp Neurol. 231 (2), 232-238 (1985).
  27. Sassoè-Pognetto, M., Wässle, H., Grünert, U. Glycinergic synapses in the rod pathway of the rat retina: cone bipolar cells express the alpha 1 subunit of the glycine receptor. J Neurosci. 14 (8), 5131-5146 (1994).
  28. Hartveit, E., et al. Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina. J Comp Neurol. 348 (4), 570-582 (1994).
  29. Perkins, G. A. The use of miniSOG in the localization of mitochondrial proteins. Methods Enzymol. 547, 165-179 (2014).
  30. Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biol. 9 (4), e1001041 (2011).
  31. Kar, D., et al. Volume electron microscopy reveals human retinal mitochondria that align with reflective bands in optical coherence tomography [Invited]. Biomed Opt Express. 14 (10), 5512-5527 (2023).
  32. Johnson, J. E., et al. Spatiotemporal regulation of ATP and Ca2+ dynamics in vertebrate rod and cone ribbon synapses. Mol Vis. 13, 887-919 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 209 P

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved