فحص دوائر الشبكية والتوطين الجزيئي عن طريق التضمين المسبق للمجهر الإلكتروني المناعي

Summary

يحدد هذا البروتوكول الخطوات التفصيلية للفحص المجهري الإلكتروني المناعي قبل التضمين ، مع التركيز على استكشاف الدوائر المشبكية وتوطين البروتين في شبكية العين.

Abstract

تتكون شبكية العين من العديد من الخلايا التي تشكل دوائر عصبية متنوعة ، والتي تشكل المرحلة الأولى من المسار البصري. تتميز كل دائرة بميزات فريدة وناقلات عصبية متميزة ، تحدد دورها وأهميتها الوظيفية. بالنظر إلى أنواع الخلايا المعقدة داخل هيكلها ، فإن تعقيد الدوائر العصبية في شبكية العين يشكل تحديات للاستكشاف. للتحقيق بشكل أفضل في دوائر الشبكية والحديث المتبادل ، مثل الرابط بين المسارات المخروطية والقضيب ، والتوطين الجزيئي الدقيق (الناقلات العصبية أو الببتيدات العصبية) ، مثل وجود تفاعل مناعي يشبه المادة P في شبكية العين على الفأر ، استخدمنا طريقة المجهر الإلكتروني المناعي قبل التضمين (immuno-EM) لاستكشاف الروابط المشبكية والتنظيم. يمكننا هذا النهج من تحديد اتصالات متشابكة محددة بين الخلايا وتحديد الموقع الجزيئي الدقيق ويمكن أن يلعب دورا توجيهيا في استكشاف وظيفته. توضح هذه المقالة البروتوكول والكواشف المستخدمة والخطوات التفصيلية ، بما في ذلك (1) إعداد تثبيت شبكية العين ، (2) التضمين المسبق للمناعة ، و (3) التثبيت والتضمين اللاحق.

Introduction

يمثل تعقيد الدوائر العصبية في شبكية العين تحديات للاستكشاف ، مع الأخذ في الاعتبار أنواع الخلايا المتنوعة داخل هيكلها ^1,2. تتضمن الخطوة الأولى تحديد الروابط المشبكية بين الخلايا المختلفة وتحديد التوطين الخلوي لناقلات عصبية معينة أو ببتيدات عصبية. مع تقدم البيولوجيا الجزيئية لإدخال بروتينات جديدة ، يصبح التوطين الدقيق في شبكية العين أمرا بالغ الأهمية لفهم وظائفها وتحليل دوائر الشبكية والوصلات المشبكية^3،4،5.

نظرا للدقة المحدودة للفحص المجهري الضوئي ، يستخدم ال....

Protocol

تمت الموافقة على رعاية والتعامل معها من قبل لائحة لجنة الأخلاقيات بجامعة ونتشو الطبية وفقا لإرشادات ARVO. تم استخدام الفئران البالغة (C57BL / 6J ، ذكورا وإناثا ، من 8 إلى 12 أسبوعا من العمر) في هذا البحث. يتم سرد المعدات والكواشف اللازمة للدراسة في جدول المواد.

1. التحضير لتثبيت الشبكية

1. قم بتجميع المواد والأدوات التالية: مجهر تشريح ، وملقطان بأطراف دقيقة جدا ، ومقص ، وإبرة حقنة سعة 1 مل (حجم الإبرة: G26) ، وورق ترشيح.
2. تخدير الفئران بعمق عن طريق الحقن داخل الصفاق من 2،2،2-ثلاثي برومو إيثانول عند 0.25 ملغ / غرام من وزن الجسم. بعد ذلك ، قطع رأس الفئران وقطع....

النتائج

يوضح الشكل 1 أمثلة على تجارب التحكم دون احتضان الأجسام المضادة الأولية ضد بروتين كيناز C alpha (PKCα) أو SP ، حيث لم يتم العثور على نشاط مناعي (IR).

يوضح الشكل 2 PKCα-IR في شبكية الفأر. يعمل PKCα كعلامة لجميع الخلايا ثنائية القطب (RBC) في شبك.......

Discussion

وصفت هذه المقالة ثلاث خطوات حاسمة للمراقبة الناجحة للدوائر المشبكية وتوطين البروتين: (1) التثبيت السريع والضعيف ، (2) التضمين المسبق للمناعة ، و (3) التثبيت والتضمين اللاحق.

نقترح أن التثبيت هو الخطوة الأساسية لنهج EM المناعي المقبول الناجح. وبالتالي ، يتم ال?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe needle	kangdelai
1% OsO4	Electron Microscopy Science	19100
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
8% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
8% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
Anti-rabbit PKC	Sigma-Aldrich	P4334
Anti-Rabbit SP	Abcam	ab67006
DAB Substrate kit	MXB Biotechnologies	KIT-9701/9702/9703
Elbow scissors	Suzhou66 vision company	54010
Electron microscope	Phillips	CM120
Epon resin	Electron Microscopy Science	14910
forcep	Suzhou66 vision company	S101A
Millipore filter paper	Merck Millipore	PR05538
Na2HPO4· 12H2O	Sigma	71650	A component of phosphate buffer
NaH2PO4· H2O	Sigma	71507	A component of phosphate buffer
Picric acid	Electron Microscopy Science	19550
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma	215511
Tris	Solarbio	917R071
Ultramicrotome	Leica
Uranyl acetate	Electron Microscopy Science	22400
VACTASTAIN ABC kit, Peroxidase (Rabbit IgG)	Vector Laboratories	PK-4001