Studio dei circuiti retinici e della localizzazione molecolare mediante microscopia immunoelettronica pre-incorporata

Riepilogo

Questo protocollo delinea le fasi dettagliate della microscopia immunoelettronica pre-incorporamento, con particolare attenzione all'esplorazione dei circuiti sinaptici e della localizzazione delle proteine nella retina.

Abstract

La retina comprende numerose cellule che formano diversi circuiti neuronali, che costituiscono il primo stadio del percorso visivo. Ogni circuito è caratterizzato da caratteristiche uniche e neurotrasmettitori distinti, che ne determinano il ruolo e il significato funzionale. Dati gli intricati tipi di cellule all'interno della sua struttura, la complessità dei circuiti neuronali nella retina pone sfide per l'esplorazione. Per studiare meglio i circuiti retinici e il cross-talk, come il legame tra le vie del cono e dei bastoncelli, e la precisa localizzazione molecolare (neurotrasmettitori o neuropeptidi), come la presenza di immunoreattività P-like nella retina del topo, abbiamo impiegato un metodo di microscopia immunoelettronica pre-incorporante (immuno-EM) per esplorare le connessioni sinaptiche e l'organizzazione. Questo approccio ci consente di individuare specifiche connessioni sinaptiche intercellulari e una precisa localizzazione molecolare e potrebbe svolgere un ruolo guida nell'esplorazione della sua funzione. Questo articolo descrive il protocollo, i reagenti utilizzati e i passaggi dettagliati, tra cui (1) preparazione della fissazione della retina, (2) immunocolorazione pre-inclusione e (3) post-fissazione e inclusione.

Introduzione

La complessità dei circuiti neuronali nella retina presenta sfide per l'esplorazione, considerando i diversi tipi di cellule all'interno della sua struttura ^1,2. La fase iniziale prevede l'identificazione delle connessioni sinaptiche tra le diverse cellule e la determinazione della localizzazione cellulare di specifici neurotrasmettitori o neuropeptidi. Con l'avanzare della biologia molecolare che introduce nuove proteine, la localizzazione precisa nella retina diventa fondamentale per comprendere le loro funzioni e analizzare i circuiti retinici e le connessioni sinaptiche ^3,4,5.

A causa della risoluzione limitata della microscopia ottica, la microscopia elettronica (EM) è comunemente usata per rilevare le strutture subcellulari delle cellule nervose. EM ha varie classificazioni, con la microscopia elettronica a trasmissione convenzionale (TEM) utilizzata per l'osservazione delle ultrastrutture cellulari 6,7,8,9. La microscopia immunoelettronica (immuno-EM), che combina la risoluzione spaziale dell'EM con la capacità di identificazione chimica degli anticorpi che si legano specificamente alle proteine¹⁰, si distingue come il metodo ottimale ed esclusivo per studiare le connessioni sinaptiche e la localizzazione delle proteine subcellulari nella retina^11,12.

Le tecniche immuno-EM possono essere suddivise in metodi pre-embedding e post-embedding in base all'ordine di inclusione e incubazione degli anticorpi. Rispetto al metodo post-embedding, l'approccio pre-embedding è in grado di identificare su larga scala e a lunga distanza 13,14,15, offrendo un approccio ottimale per lo studio dei processi cellulari come assoni e dendriti. Inoltre, questa tecnica fornisce un segnale forte e un ampio campo visivo, rendendola vantaggiosa per indagini complete sull'espressione proteica e sulla localizzazione molecolare nel citoplasma. Questo metodo si rivela particolarmente prezioso per garantire strutture chimicamente identificate che siano visibili in tutto il citoplasma, nelle cellule o nella retina.

Tuttavia, il metodo post-embedding, pur avendo una penetrazione o una diffusione inferiore rispetto al metodo pre-embedding, non è così sensibile^16,17. In parole povere, se l'obiettivo è quello di esplorare la localizzazione di specifici neurotrasmettitori nel citoplasma o nei terminali sinaptici, l'immuno-EM pre-embedding è il metodo preferito. Al contrario, per identificare la localizzazione dei recettori di membrana, è più raccomandato utilizzare l'immunogold EM post-incorporazione.

Alla luce di queste considerazioni, optiamo per il metodo immuno-EM pre-embedding per approfondire i circuiti retinici, compresa l'interazione tra le vie del cono e dei bastoncelli, e la localizzazione molecolare, come la distribuzione e l'organizzazione sinaptica della sostanza immunoreattività P-like (SP-IR) nella retina del topo.

Protocollo

La cura e la gestione degli animali sono state approvate dal regolamento del Comitato etico dell'Università di medicina di Wenzhou in conformità con le linee guida ARVO. In questa ricerca sono stati utilizzati topi adulti (C57BL/6J, maschio e femmina, da 8 a 12 settimane di età). L'attrezzatura e i reagenti necessari per lo studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Preparazione per la fissazione della retina

1. Assembla i seguenti materiali e strumenti: un microscopio da dissezione, due pinze con punte molto sottili, forbici, un ago per siringa da 1 ml (misura dell'ago: G26) e carta da filtro.
2. Anestetizzare profondamente i topi mediante iniezione intraperitoneale di 2,2,2-tribromoetanolo a 0,25 mg/g di peso corporeo. Successivamente, decapitare i topi e tagliare loro la testa¹⁶.
3. Enucleare i loro occhi con le forbici del gomito e metterli in un piatto di vetro contenente il 4% di paraformaldeide-0,2% di acido picrico in tampone fosfato 0,1 M (PB; pH 7,4).
4. Al microscopio da dissezione, praticare un foro nel limbus corneale utilizzando un ago da siringa da 1 ml e tagliare il segmento anteriore con le forbici, seguendo il foro. Quindi, rimuovere la lente dalla superficie retinica interna con una pinza.
5. Utilizzare due pinze per staccare con cura la sclera fino a quando la retina non è completamente isolata dall'oculare (il tessuto della retina coppuscolare si è separato completamente dalla coroide). Successivamente, tagliare la retina in quattro pezzi.
6. Fissare queste sezioni in paraformaldeide al 4% e acido picrico allo 0,2% in 0,1 M PB (pH 7,4) per 2 ore a temperatura ambiente (RT), quindi trasferire il tessuto in paraformaldeide al 4% in 0,1 M PB (pH 10,4) per una notte a 4 °C.

2. Immunocolorazione pre-inclusione

1. Dopo il lavaggio in PBS 0,01 M (pH 7,4) sei volte per 10 minuti ciascuna, incubare i tessuti retinici in boroidruro di sodio all'1% (NaBH₄) in PBS 0,01 M (pH 7,4) per 30 minuti.
2. Lavare le sezioni retiniche con 0,01 M PBS (pH 7,4) almeno sei volte. Nel frattempo, rimuovere il vitreo con carta da filtro e poi tagliare la retina a fette piccole tra 100-300 μm utilizzando una lametta a doppio taglio.
3. Dopo il blocco con siero di capra normale al 5% (NGS) a 0,1 M PB (pH 7,4) per 1 ora a RT, incubare le fette di retina con anticorpi primari (Anti-rabbit PKCα, 1:80; Anti-Rabbit SP, 1:100) insieme al 2% di NGS in 0,01 M PBS (pH 7,4) per 2 ore a RT su un agitatore. Successivamente, incubare per 96 ore (5 giorni) a 4 °C su un agitatore.
4. Dopo aver lavato sei volte per 10 minuti ciascuna in 0,01 M PBS (pH 7,4), incubare le fette di retina con l'anticorpo secondario a 1:200, come IgG anti-coniglio di capra, insieme al 2% di NGS in 0,01 M PBS (pH 7,4) per 2 ore a RT su uno shaker. Quindi, incubare per 48 ore (2 giorni) a 4 °C su uno shaker.
   NOTA: Gli anticorpi secondari sono stati applicati da soli negli esperimenti di controllo.
5. Lavare le strisce retiniche in 0,01 M PBS (pH 7,4) sei volte per 10 minuti ciascuna prima di incubare con il reagente A e il reagente B del kit ABC a 1:100 in 0,01 M PBS (pH 7,4) per 2 giorni a 4°C. (Sia il reagente A che il reagente B sono stati diluiti con 0,01 M di PBS. Ad esempio: Una soluzione: 6 μl; Soluzione B: 6 μl; 0,01 M PBS: 588 μl, totale 600 μl).
6. Lavare le strisce retiniche in tampone Tris 0,05 M (pH 7,2) tre volte per 10 minuti ciascuna. Quindi, pre-incubare le strisce retiniche con il 5% di reagente 1 e il 5% di reagente 3 del kit DAB in acqua distillata per 1 ora a temperatura ambiente. (Il rapporto ad esempio: reagente 1: 50 μl; reagente 3: 50 μl; acqua distillata: 900 μl, totale di 1000 μl).
7. Colorare le strisce retiniche con DAB. Aggiungere in sequenza lo stesso volume di soluzione da tre provette del kit DAB (reagente 1-reagente 2-reagente 3). Osservare lo stato di colorazione utilizzando il microscopio di dissezione. Fermare la colorazione quando le cellule diventano marroni; Questo processo richiede 10-20 minuti.
8. Lavare le strisce retiniche con tampone Tris 0,05 M (pH 7,2) tre volte per 10 minuti ciascuna e quindi lavare con PBS 0,01 M sei volte per 10 minuti ciascuna.

3. Post-fissazione e inclusione

1. Fissare le strisce retiniche in glutaraldeide al 2% per 1-2 ore a temperatura ambiente (RT), quindi lavare con 0,01 M PBS (pH 7,4) sei volte per 10 minuti ciascuna.
2. Incubare le strisce retiniche con tetrossido di osmio all'1% (OsO₄) in 0,1 M PB per 1 ora a RT e conservarle in un luogo buio.
3. Dopo il lavaggio in acqua distillata (ddH₂O) sei volte per 10 minuti ciascuna, incubare i tessuti retinici con acetato di uranile per 1 ora a RT e tenerli in un luogo buio per colorare questi tessuti.
4. Mettere i tessuti retinici in soluzioni di acetone (50%, 70%, 80% e 90%) per 10 minuti ciascuna, quindi al 100% due volte per 10 minuti ciascuna.
5. Immergere i tessuti retinici in una miscela contenente lo stesso volume di acetato di uranile e una resina epossidica per 1 ora in forno di essiccazione a 37 °C, seguita da una miscela contenente acetato di uranile e resina (1:4) per una notte in forno di essiccazione a 37 °C.
6. Trasferire delicatamente i tessuti retinici con uno stuzzicadenti nella nuova resina per 1 ora a 45 °C in un forno di essiccazione, quindi la striscia retinica orientata viene incorporata nella piastra di inclusione con la resina.
7. Mettere il campione in una stufa di essiccazione a 45 °C per 3 ore e in una stufa a 65 °C per 48 ore.
8. Modellare i blocchi di inclusione in trapezi e tagliare il blocco in sezioni spesse 1 μm con un ultramicrotomo, colorare queste sezioni con blu di toluidina e preselezionare le regioni di interesse al microscopio ottico.
9. Raccogli sezioni ultrasottili (70-90 nm) su griglie di rame e visualizzale al microscopio elettronico.

Risultati

La Figura 1 mostra esempi di esperimenti di controllo senza l'incubazione di anticorpi primari contro la proteina chinasi C alfa (PKCα) o SP, in cui non è stata trovata alcuna immunoreattività (IR).

La Figura 2 illustra la PKCα-IR nella retina del topo. PKCα funge da marcatore per tutte le cellule bipolari dei bastoncelli (RBC) nella retina¹⁸. A livello di microscopia elet...

Discussione

Questo articolo ha descritto tre passaggi critici per il successo dell'osservazione dei circuiti sinaptici e della localizzazione delle proteine: (1) fissazione rapida e debole, (2) immunocolorazione pre-inclusione e (3) post-fissazione e inclusione.

Proponiamo che la fissazione sia il passo chiave per un approccio immuno-EM pre-incorporamento di successo. Pertanto, qui viene sottolineata l'importanza del fissativo fresco e della fissazione rapida, denominando...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe needle	kangdelai
1% OsO4	Electron Microscopy Science	19100
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
8% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
8% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
Anti-rabbit PKC	Sigma-Aldrich	P4334
Anti-Rabbit SP	Abcam	ab67006
DAB Substrate kit	MXB Biotechnologies	KIT-9701/9702/9703
Elbow scissors	Suzhou66 vision company	54010
Electron microscope	Phillips	CM120
Epon resin	Electron Microscopy Science	14910
forcep	Suzhou66 vision company	S101A
Millipore filter paper	Merck Millipore	PR05538
Na2HPO4· 12H2O	Sigma	71650	A component of phosphate buffer
NaH2PO4· H2O	Sigma	71507	A component of phosphate buffer
Picric acid	Electron Microscopy Science	19550
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma	215511
Tris	Solarbio	917R071
Ultramicrotome	Leica
Uranyl acetate	Electron Microscopy Science	22400
VACTASTAIN ABC kit, Peroxidase (Rabbit IgG)	Vector Laboratories	PK-4001