חקירת מעגלי רשתית ולוקליזציה מולקולרית על ידי הטבעה מראש של מיקרוסקופ אימונואלקטרונים

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השלבים המפורטים של הטמעה מראש של מיקרוסקופ אימונואלקטרונים, תוך התמקדות בחקר מעגלים סינפטיים ולוקליזציה של חלבונים ברשתית.

Abstract

הרשתית מורכבת מתאים רבים היוצרים מעגלים עצביים מגוונים, המהווים את השלב הראשון של מסלול הראייה. כל מעגל מאופיין בתכונות ייחודיות ובמוליכים עצביים מובחנים, הקובעים את תפקידו ואת משמעותו התפקודית. בהתחשב בסוגי התאים המורכבים בתוך המבנה שלה, המורכבות של מעגלים עצביים ברשתית מציבה אתגרים לחקירה. כדי לחקור טוב יותר מעגלי רשתית ודיבור צולב, כגון הקשר בין מסלולי חרוט ומוט, ולוקליזציה מולקולרית מדויקת (מוליכים עצביים או נוירופפטידים), כגון נוכחות של חומר דמוי תגובתיות חיסונית דמוית P ברשתית העכבר, השתמשנו בשיטת מיקרוסקופ אימונואלקטרונים (immuno-EM) להטמעה מראש (immuno-EM) כדי לחקור קשרים סינפטיים וארגון. גישה זו מאפשרת לנו לאתר קשרים סינפטיים בין-תאיים ספציפיים ולוקליזציה מולקולרית מדויקת, ויכולה למלא תפקיד מנחה בחקר תפקידה. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול, ריאגנטים שבהם נעשה שימוש ושלבים מפורטים, כולל (1) הכנת קיבוע רשתית, (2) הטבעה מראש של אימונוסטיין, ו-(3) לאחר קיבוע והטבעה.

Introduction

המורכבות של מעגלים עצביים ברשתית מציבה אתגרים לחקירה, בהתחשב בסוגי התאים המגוונים בתוך המבנה שלה ^1,2. השלב הראשוני כולל זיהוי קשרים סינפטיים בין תאים שונים וקביעת הלוקליזציה התאית של נוירוטרנסמיטורים או נוירופפטידים ספציפיים. ככל שהביולוגיה המולקולרית מתקדמת מציגה חלבונים חדשים, לוקליזציה מדויקת ברשתית הופכת חיונית להבנת תפקודיהם ולניתוח מעגלי הרשתית והקשרים הסינפטיים ^3,4,5.

בשל הרזולוציה המוגבלת של מיקרוסקופ אור, מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) משמש בדרך כלל כדי לזהות את המבנים התת-תאיים של תאי עצב. EM יש סיווגים שונים, עם מיקרוסקופ אלקטרונים שידור קונבנציונאלי (TEM) המשמש לצפייה אולטרה מבנים התא 6,7,8,9. מיקרוסקופ אימונואלקטרונים (immuno-EM), המשלב את הרזולוציה המרחבית של EM עם יכולת הזיהוי הכימית של נוגדנים הנקשרים באופן ספציפי לחלבונים¹⁰, בולט כשיטה האופטימלית והבלעדית לחקר קשרים סינפטיים ולוקליזציה של חלבונים תת-תאיים ברשתית ^11,12.

ניתן לחלק את טכניקות האימונו-EM לשיטות קדם-הטבעה ופוסט-הטבעה המבוססות על סדר ההטבעה והדגירה של נוגדנים. בהשוואה לשיטת ההטבעה שלאחר ההטבעה, גישת קדם-הטבעה מסוגלת לזיהוי בקנה מידה גדול ולמרחקים ארוכים 13,14,15, ומציעה גישה אופטימלית לחקר תהליכים תאיים כמו אקסונים ודנדריטים. בנוסף, טכניקה זו מספקת אות חזק ושדה ראייה רחב, מה שהופך אותה ליתרון לחקירות מקיפות של ביטוי חלבונים ולוקליזציה מולקולרית בציטופלסמה. שיטה זו מוכיחה את עצמה כבעלת ערך רב במיוחד בהבטחת מבנים מזוהים כימית הנראים לאורך כל הציטופלסמה, התאים או הרשתית.

עם זאת, שיטת ההטבעה שלאחר ההטבעה, אף שהיא בעלת חדירה או דיפוזיה נמוכה יותר בהשוואה לשיטת ההטבעה המוקדמת, אינה רגישה כל כך^16,17. במילים פשוטות, אם המטרה היא לחקור את הלוקליזציה של נוירוטרנסמיטורים ספציפיים בציטופלסמה או במסופים סינפטיים, ההטבעה מראש של immuno-EM היא השיטה המועדפת. לעומת זאת, לצורך זיהוי לוקליזציה של קולטני ממברנה, מומלץ יותר להשתמש ב- EM אימונוגולד לאחר הטבעה.

בהתחשב בשיקולים אלה, אנו בוחרים בשיטת ההטבעה מראש של immuno-EM כדי להתעמק במעגלי הרשתית, כולל האינטראקציה בין מסלולי חרוט ומוט, ולוקליזציה מולקולרית, כגון התפלגות וארגון סינפטי של תגובתיות חיסונית דמוית P (SP-IR) ברשתית העכבר.

Protocol

הטיפול והטיפול בבעלי חיים אושרו על ידי תקנה של ועדת האתיקה של האוניברסיטה הרפואית וונג'ואו בהתאם להנחיות ARVO. במחקר זה נעשה שימוש בעכברים בוגרים (C57BL/6J, זכר ונקבה, בני 8 עד 12 שבועות). הציוד והריאגנטים הדרושים למחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנה לקיבוע הרשתית

1. הרכיבו את החומרים והכלים הבאים: מיקרוסקופ נתיחה, שני מלקחיים עם קצוות עדינים מאוד, מספריים, מחט מזרק 1 מ"ל (גודל מחט: G26) ונייר סינון.
2. הרדמה עמוקה של עכברים על ידי הזרקה תוך צפקית של 2,2,2-tribromoethanol במשקל גוף של 0.25 מ"ג/גרם. לאחר מכן, ערפו את ראשיהם של העכברים וחתכו את ראשיהם¹⁶.
3. חנכו את עיניהם במספריים למרפק והניחו אותן בכלי זכוכית המכיל 4% פרפורמלדהיד-0.2% חומצה פיקרית בחיץ פוספט 0.1M (PB; pH 7.4).
4. תחת המיקרוסקופ המנתח מנקבים חור בלימבוס הקרנית באמצעות מחט מזרק 1 מ"ל וחותכים את המקטע הקדמי במספריים, בעקבות החור. לאחר מכן, הסר את העדשה משטח הרשתית הפנימית באמצעות מלקחיים.
5. השתמשו בשתי מלקחיים כדי לקלף בזהירות את לובן העין עד שהרשתית מבודדת לחלוטין מהעין (רקמת הרשתית המופרדת לחלוטין מהכורואידים). לאחר מכן, לחתוך את הרשתית לארבעה חלקים.
6. תקן חלקים אלה ב-4% paraformaldehyde-0.2% picric acid ב-0.1 M PB (pH 7.4) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר (RT), ולאחר מכן העבר את הרקמה ל-4% paraformaldehyde ב-0.1 M PB (pH 10.4) למשך הלילה ב-4°C.

2. הטמעה מוקדמת של אימונוסטיישן

1. לאחר שטיפה של 0.01 M PBS (pH 7.4) שש פעמים במשך 10 דקות כל אחת, יש לדגור על רקמות הרשתית בנתרן בורוהידריד 1% (NaBH₄) ב-0.01 M PBS (pH 7.4) למשך 30 דקות.
2. יש לשטוף את מקטעי הרשתית ב-0.01 M PBS (pH 7.4) לפחות שש פעמים. בינתיים, להסיר את הזגוגית עם נייר סינון ולאחר מכן לחתוך את הרשתית לפרוסות קטנות בין 100-300 מיקרומטר באמצעות סכין גילוח פיפיות.
3. לאחר חסימה עם 5% סרום עיזים תקין (NGS) ב 0.1 M PB (pH 7.4) במשך 1 שעה ב RT, לדגור את פרוסות הרשתית עם נוגדנים ראשוניים (נגד ארנב PKCα, 1:80; Anti-Rabbit SP, 1:100) יחד עם 2% NGS ב-0.01 M PBS (pH 7.4) למשך שעתיים ב-RT על שייקר. לאחר מכן, לדגור במשך 96 שעות (5 ימים) ב 4 °C על שייקר.
4. לאחר שטיפה שש פעמים במשך 10 דקות כל אחת ב-0.01 M PBS (pH 7.4), יש לדגור על פרוסות הרשתית עם הנוגדן המשני ב-1:200, כגון IgG נגד ארנב עיזים, יחד עם 2% NGS ב-0.01 M PBS (pH 7.4) למשך שעתיים ב-RT על שייקר. לאחר מכן, לדגור במשך 48 שעות (2 ימים) ב 4 ° C על שייקר.
   הערה: נוגדנים משניים יושמו לבד בניסויי ביקורת.
5. יש לשטוף את פסי הרשתית ב-0.01 M PBS (pH 7.4) שש פעמים במשך 10 דקות כל אחד לפני הדגירה עם מגיב A וריאגנט B מערכת ABC ב-1:100 ב-0.01M PBS (pH 7.4) למשך יומיים ב-4°C. (גם מגיב A וגם מגיב B דוללו ב-0.01 M PBS. לדוגמה: פתרון: 6 μl; תמיסת B: 6 מיקרוליטר; 0.01 M PBS: 588 μl, סה"כ 600 μl).
6. יש לשטוף את פסי הרשתית בחיץ טריס של 0.05 מטר (pH 7.2) שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחד. לאחר מכן, יש לדגור מראש על פסי הרשתית עם מגיב 5% 1 ו-5% מגיב 3 מערכת DAB במים מזוקקים למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. (היחס לדוגמה: מגיב 1: 50 μl; מגיב 3: 50 μl; מים מזוקקים: 900 μl, סך של 1000 μl).
7. מכתימים את פסי הרשתית עם DAB. הוסף את אותו נפח תמיסה משלושה צינורות בערכת DAB ברצף (מגיב 1-מגיב 2-מגיב 3). שימו לב למצב הצביעה באמצעות מיקרוסקופ הדיסקציה. עצור את הכתמים כאשר התאים הופכים חומים; תהליך זה אורך 10-20 דקות.
8. שטפו את פסי הרשתית עם חיץ 0.05 M Tris (pH 7.2) שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד ולאחר מכן שטפו ב-0.01 M PBS שש פעמים במשך 10 דקות כל אחת.

3. לאחר קיבוע והטבעה

1. תקן את פסי הרשתית ב-2% גלוטראלדהיד למשך 1-2 שעות בטמפרטורת החדר (RT), ולאחר מכן שטוף ב-0.01 M PBS (pH 7.4) שש פעמים במשך 10 דקות כל אחד.
2. דגרו על פסי הרשתית עם 1% אוסמיום טטרוקסיד (OsO₄) ב-0.1 M PB למשך שעה אחת ב-RT ושמרו אותם במקום חשוך.
3. לאחר שטיפה במים מזוקקים (ddH₂O) שש פעמים במשך 10 דקות כל אחת, לדגור על רקמות הרשתית עם אורניל אצטט במשך שעה אחת ב- RT ולשמור אותם במקום חשוך כדי להכתים רקמות אלה.
4. שים את רקמות הרשתית בתמיסות אצטון (50%, 70%, 80% ו- 90%) למשך 10 דקות כל אחת, ולאחר מכן ב- 100% פעמיים למשך 10 דקות כל אחת.
5. טבלו את רקמות הרשתית בתערובת המכילה את אותו נפח של אורניל אצטט ושרף אפוקסי למשך שעה אחת בתנור ייבוש של 37°C, ולאחר מכן תערובת המכילה אורניל אצטט ואת השרף (1:4) למשך הלילה בתנור ייבוש של 37°C.
6. מעבירים את רקמות הרשתית בעדינות באמצעות קיסם לתוך השרף החדש למשך שעה אחת בטמפרטורה של 45°C בתנור ייבוש, ולאחר מכן פס הרשתית המכוון מוטבע בצלחת ההטבעה עם השרף.
7. הכניסו את הדגימה לתנור ייבוש בטמפרטורה של 45 מעלות למשך 3 שעות ולתנור ייבוש בטמפרטורה של 65 מעלות למשך 48 שעות.
8. עצבו את קוביות ההטבעה לטרפזים וחתכו את הבלוק למקטעים בעובי 1 מיקרומטר עם אולטרה-מיקרוטום, צבעו חלקים אלה בכחול טולוידין, והקרינו מראש אזורים מעניינים תחת מיקרוסקופ אור.
9. אספו מקטעים דקים במיוחד (70-90 ננומטר) על רשתות נחושת וצפו בהם תחת מיקרוסקופ אלקטרונים.

תוצאות

איור 1 מראה דוגמאות לניסויי בקרה ללא דגירה של נוגדנים ראשוניים כנגד חלבון קינאז C אלפא (PKCα) או SP, שבהם לא נמצאה תגובתיות חיסונית (IR).

איור 2 מתאר את PKCα-IR ברשתית העכבר. PKCα משמש כסמן לכל תאי המוט הדו-קוטבי (RBC) ברשתית¹⁸...

Discussion

מאמר זה תיאר שלושה שלבים קריטיים לתצפית מוצלחת של מעגלים סינפטיים ולוקליזציה של חלבונים: (1) קיבוע מהיר וחלש, (2) הטבעה מוקדמת של אימונוסטיין, ו-(3) קיבוע והטבעה לאחר קיבוע.

אנו מציעים כי קיבוע הוא שלב המפתח לגישה מוצלחת של הטמעה מראש של immuno-EM. לפיכך, מודגשת כאן ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe needle	kangdelai
1% OsO4	Electron Microscopy Science	19100
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
8% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
8% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
Anti-rabbit PKC	Sigma-Aldrich	P4334
Anti-Rabbit SP	Abcam	ab67006
DAB Substrate kit	MXB Biotechnologies	KIT-9701/9702/9703
Elbow scissors	Suzhou66 vision company	54010
Electron microscope	Phillips	CM120
Epon resin	Electron Microscopy Science	14910
forcep	Suzhou66 vision company	S101A
Millipore filter paper	Merck Millipore	PR05538
Na2HPO4· 12H2O	Sigma	71650	A component of phosphate buffer
NaH2PO4· H2O	Sigma	71507	A component of phosphate buffer
Picric acid	Electron Microscopy Science	19550
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma	215511
Tris	Solarbio	917R071
Ultramicrotome	Leica
Uranyl acetate	Electron Microscopy Science	22400
VACTASTAIN ABC kit, Peroxidase (Rabbit IgG)	Vector Laboratories	PK-4001