חקירת מעגלי רשתית ולוקליזציה מולקולרית על ידי הטבעה מראש של מיקרוסקופ אימונואלקטרונים

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השלבים המפורטים של הטמעה מראש של מיקרוסקופ אימונואלקטרונים, תוך התמקדות בחקר מעגלים סינפטיים ולוקליזציה של חלבונים ברשתית.

Abstract

הרשתית מורכבת מתאים רבים היוצרים מעגלים עצביים מגוונים, המהווים את השלב הראשון של מסלול הראייה. כל מעגל מאופיין בתכונות ייחודיות ובמוליכים עצביים מובחנים, הקובעים את תפקידו ואת משמעותו התפקודית. בהתחשב בסוגי התאים המורכבים בתוך המבנה שלה, המורכבות של מעגלים עצביים ברשתית מציבה אתגרים לחקירה. כדי לחקור טוב יותר מעגלי רשתית ודיבור צולב, כגון הקשר בין מסלולי חרוט ומוט, ולוקליזציה מולקולרית מדויקת (מוליכים עצביים או נוירופפטידים), כגון נוכחות של חומר דמוי תגובתיות חיסונית דמוית P ברשתית העכבר, השתמשנו בשיטת מיקרוסקופ אימונואלקטרונים (immuno-EM) להטמעה מראש (immuno-EM) כדי לחקור קשרים סינפטיים וארגון. גישה זו מאפשרת לנו לאתר קשרים סינפטיים בין-תאיים ספציפיים ולוקליזציה מולקולרית מדויקת, ויכולה למלא תפקיד מנחה בחקר תפקידה. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול, ריאגנטים שבהם נעשה שימוש ושלבים מפורטים, כולל (1) הכנת קיבוע רשתית, (2) הטבעה מראש של אימונוסטיין, ו-(3) לאחר קיבוע והטבעה.

Introduction

המורכבות של מעגלים עצביים ברשתית מציבה אתגרים לחקירה, בהתחשב בסוגי התאים המגוונים בתוך המבנה שלה ^1,2. השלב הראשוני כולל זיהוי קשרים סינפטיים בין תאים שונים וקביעת הלוקליזציה התאית של נוירוטרנסמיטורים או נוירופפטידים ספציפיים. ככל שהביולוגיה המולקולרית מתקדמת מציגה חלבונים חדשים, לוקליזציה מדויקת ברשתית הופכת חיונית להבנת תפקודיהם ולניתוח מעגלי הרשתית והקשרים הסינפטיים ^3,4,5.

בשל הרזולוציה המוגבלת של מיקרוסקופ אור, מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) משמש בדרך כלל כדי ....

Protocol

הטיפול והטיפול בבעלי חיים אושרו על ידי תקנה של ועדת האתיקה של האוניברסיטה הרפואית וונג'ואו בהתאם להנחיות ARVO. במחקר זה נעשה שימוש בעכברים בוגרים (C57BL/6J, זכר ונקבה, בני 8 עד 12 שבועות). הציוד והריאגנטים הדרושים למחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנה לקיבוע הרשתית

1. הרכיבו את החומרים והכלים הבאים: מיקרוסקופ נתיחה, שני מלקחיים עם קצוות עדינים מאוד, מספריים, מחט מזרק 1 מ"ל (גודל מחט: G26) ונייר סינון.
2. הרדמה עמוקה של עכברים על ידי הזרקה תוך צפקית של 2,2,2-tribromoethanol במשקל גוף של 0.25 מ"ג/גרם. לאחר מכן, ערפו את ראשיהם של העכברים וחתכו את ראשיהם

תוצאות

איור 1 מראה דוגמאות לניסויי בקרה ללא דגירה של נוגדנים ראשוניים כנגד חלבון קינאז C אלפא (PKCα) או SP, שבהם לא נמצאה תגובתיות חיסונית (IR).

איור 2 מתאר את PKCα-IR ברשתית העכבר. PKCα משמש כסמן לכל תאי המוט הדו-קוטבי (RBC) ברשתית¹⁸.......

Discussion

מאמר זה תיאר שלושה שלבים קריטיים לתצפית מוצלחת של מעגלים סינפטיים ולוקליזציה של חלבונים: (1) קיבוע מהיר וחלש, (2) הטבעה מוקדמת של אימונוסטיין, ו-(3) קיבוע והטבעה לאחר קיבוע.

אנו מציעים כי קיבוע הוא שלב המפתח לגישה מוצלחת של הטמעה מראש של immuno-EM. לפיכך, מודגשת כאן .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe needle	kangdelai
1% OsO4	Electron Microscopy Science	19100
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
8% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
8% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
Anti-rabbit PKC	Sigma-Aldrich	P4334
Anti-Rabbit SP	Abcam	ab67006
DAB Substrate kit	MXB Biotechnologies	KIT-9701/9702/9703
Elbow scissors	Suzhou66 vision company	54010
Electron microscope	Phillips	CM120
Epon resin	Electron Microscopy Science	14910
forcep	Suzhou66 vision company	S101A
Millipore filter paper	Merck Millipore	PR05538
Na2HPO4· 12H2O	Sigma	71650	A component of phosphate buffer
NaH2PO4· H2O	Sigma	71507	A component of phosphate buffer
Picric acid	Electron Microscopy Science	19550
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma	215511
Tris	Solarbio	917R071
Ultramicrotome	Leica
Uranyl acetate	Electron Microscopy Science	22400
VACTASTAIN ABC kit, Peroxidase (Rabbit IgG)	Vector Laboratories	PK-4001