A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השלבים המפורטים של הטמעה מראש של מיקרוסקופ אימונואלקטרונים, תוך התמקדות בחקר מעגלים סינפטיים ולוקליזציה של חלבונים ברשתית.

Abstract

הרשתית מורכבת מתאים רבים היוצרים מעגלים עצביים מגוונים, המהווים את השלב הראשון של מסלול הראייה. כל מעגל מאופיין בתכונות ייחודיות ובמוליכים עצביים מובחנים, הקובעים את תפקידו ואת משמעותו התפקודית. בהתחשב בסוגי התאים המורכבים בתוך המבנה שלה, המורכבות של מעגלים עצביים ברשתית מציבה אתגרים לחקירה. כדי לחקור טוב יותר מעגלי רשתית ודיבור צולב, כגון הקשר בין מסלולי חרוט ומוט, ולוקליזציה מולקולרית מדויקת (מוליכים עצביים או נוירופפטידים), כגון נוכחות של חומר דמוי תגובתיות חיסונית דמוית P ברשתית העכבר, השתמשנו בשיטת מיקרוסקופ אימונואלקטרונים (immuno-EM) להטמעה מראש (immuno-EM) כדי לחקור קשרים סינפטיים וארגון. גישה זו מאפשרת לנו לאתר קשרים סינפטיים בין-תאיים ספציפיים ולוקליזציה מולקולרית מדויקת, ויכולה למלא תפקיד מנחה בחקר תפקידה. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול, ריאגנטים שבהם נעשה שימוש ושלבים מפורטים, כולל (1) הכנת קיבוע רשתית, (2) הטבעה מראש של אימונוסטיין, ו-(3) לאחר קיבוע והטבעה.

Introduction

המורכבות של מעגלים עצביים ברשתית מציבה אתגרים לחקירה, בהתחשב בסוגי התאים המגוונים בתוך המבנה שלה 1,2. השלב הראשוני כולל זיהוי קשרים סינפטיים בין תאים שונים וקביעת הלוקליזציה התאית של נוירוטרנסמיטורים או נוירופפטידים ספציפיים. ככל שהביולוגיה המולקולרית מתקדמת מציגה חלבונים חדשים, לוקליזציה מדויקת ברשתית הופכת חיונית להבנת תפקודיהם ולניתוח מעגלי הרשתית והקשרים הסינפטיים 3,4,5.

בשל הרזולוציה המוגבלת של מיקרוסקופ אור, מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) משמש בדרך כלל כדי ....

Protocol

הטיפול והטיפול בבעלי חיים אושרו על ידי תקנה של ועדת האתיקה של האוניברסיטה הרפואית וונג'ואו בהתאם להנחיות ARVO. במחקר זה נעשה שימוש בעכברים בוגרים (C57BL/6J, זכר ונקבה, בני 8 עד 12 שבועות). הציוד והריאגנטים הדרושים למחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנה לקיבוע הרשתית

  1. הרכיבו את החומרים והכלים הבאים: מיקרוסקופ נתיחה, שני מלקחיים עם קצוות עדינים מאוד, מספריים, מחט מזרק 1 מ"ל (גודל מחט: G26) ונייר סינון.
  2. הרדמה עמוקה של עכברים על ידי הזרקה תוך צפקית של 2,2,2-tribromoethanol במשקל גוף של 0.25 מ"ג/גרם. לאחר מכן, ערפו את ראשיהם של העכברים וחתכו את ראשיהם

תוצאות

איור 1 מראה דוגמאות לניסויי בקרה ללא דגירה של נוגדנים ראשוניים כנגד חלבון קינאז C אלפא (PKCα) או SP, שבהם לא נמצאה תגובתיות חיסונית (IR).

איור 2 מתאר את PKCα-IR ברשתית העכבר. PKCα משמש כסמן לכל תאי המוט הדו-קוטבי (RBC) ברשתית18.......

Discussion

מאמר זה תיאר שלושה שלבים קריטיים לתצפית מוצלחת של מעגלים סינפטיים ולוקליזציה של חלבונים: (1) קיבוע מהיר וחלש, (2) הטבעה מוקדמת של אימונוסטיין, ו-(3) קיבוע והטבעה לאחר קיבוע.

אנו מציעים כי קיבוע הוא שלב המפתח לגישה מוצלחת של הטמעה מראש של immuno-EM. לפיכך, מודגשת כאן .......

Disclosures

למחברים אין גילויים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים מהתוכנית הלאומית למחקר ופיתוח מפתח של סין (2022YFA1105503), מעבדת המפתח הממלכתית למדעי המוח (SKLN-202103), קרן ג'ג'יאנג למדעי הטבע של סין (Y21H120019).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringe needlekangdelai
1% OsO4Electron Microscopy Science19100
2,2,2-TribromoethanolSigma-AldrichT48402
8% GlutaraldehydeElectron Microscopy Science16020
8% ParaformaldehydeElectron Microscopy Science157-8
AcetoneElectron Microscopy Science10000
Anti-rabbit PKCSigma-AldrichP4334
Anti-Rabbit SPAbcamab67006
DAB Substrate kitMXB BiotechnologiesKIT-9701/9702/9703
Elbow scissorsSuzhou66 vision company54010
Electron microscopePhillipsCM120
Epon resinElectron Microscopy Science14910
forcepSuzhou66 vision companyS101A
Millipore filter paperMerck Millipore PR05538
Na2HPO4· 12H2OSigma71650A component of phosphate buffer
NaH2PO4· H2OSigma71507A component of phosphate buffer
Picric acidElectron Microscopy Science19550
Sodium borohydride (NaBH4) Sigma215511
TrisSolarbio917R071
UltramicrotomeLeica
Uranyl acetateElectron Microscopy Science22400
VACTASTAIN ABC kit, Peroxidase (Rabbit IgG)Vector LaboratoriesPK-4001

References

  1. Chua, N. J., et al. A complete reconstruction of the early visual system of an adult insect. Curr Biol. 33 (21), 4611-4623.e4614 (2023).
  2. Ravi Chander, P., Hanson, L., Chundekkad, L., Awatramani, G. B. Neural circuit....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE209P

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved