Investigating retinal circuits and molecular localization by pre-embbedding immunoelectron microscopy (면역전자 현미경 사전 임베딩을 통한 망막 회로 및 분자 국소화 조사)

요약

이 프로토콜은 망막의 시냅스 회로 및 단백질 국소화를 탐색하는 데 중점을 두고 면역전자 현미경을 사전 삽입하는 세부 단계를 간략하게 설명합니다.

초록

망막은 다양한 신경 회로를 형성하는 수많은 세포로 구성되어 있으며, 이는 시각 경로의 첫 번째 단계를 구성합니다. 각 회로는 고유한 특징과 뚜렷한 신경 전달 물질로 특징지어지며 그 역할과 기능적 중요성을 결정합니다. 망막의 구조 내에 있는 복잡한 세포 유형을 감안할 때, 망막에 있는 신경 회로의 복잡성은 연구에 대한 도전을 제기합니다. 원뿔과 간상 경로 사이의 연결과 같은 망막 회로 및 누화, 마우스 망막에 있는 물질 P와 같은 면역 반응성의 존재와 같은 정확한 분자 국소화(신경 전달 물질 또는 신경 펩티드)를 더 잘 조사하기 위해 우리는 시냅스 연결 및 조직을 탐구하기 위해 사전 내장 면역 전자 현미경(immuno-EM) 방법을 사용했습니다. 이 접근 방식을 통해 특정 세포 간 시냅스 연결과 정확한 분자 국소화를 정확히 찾아낼 수 있으며 그 기능을 탐구하는 데 안내 역할을 할 수 있습니다. 이 글에서는 프로토콜, 사용된 시약 및 (1) 망막 고정 준비, (2) 사전 삽입 면역염색, (3) 수정 후 및 삽입을 포함한 자세한 단계에 대해 설명합니다.

서문

망막에 있는 신경 회로의 복잡성은 구조 내의 다양한 세포 유형을 고려할 때 연구에 대한 도전을 제시합니다 ^1,2. 초기 단계에는 서로 다른 세포 간의 시냅스 연결을 식별하고 특정 신경 전달 물질 또는 신경 펩티드의 세포 국소화를 결정하는 것이 포함됩니다. 분자 생물학이 발전함에 따라 새로운 단백질이 도입됨에 따라 단백질의 기능을 이해하고 망막 회로와 시냅스 연결을 분석하는 데 단백질의 정확한 위치 파악이 중요해지고 있습니다 ^3,4,5.

광학 현미경의 제한된 해상도로 인해 전자 현미경(EM)은 일반적으로 신경 세포의 세포 내 구조를 감지하는 데 사용됩니다. EM은 세포 초미구조 ^6,7,8,9

프로토콜

동물의 보살핌과 취급은 ARVO 지침에 따라 Wenzhou Medical University의 윤리위원회 규정에 의해 승인되었습니다. 이 연구에는 성체 마우스(C57BL/6J, 수컷 및 암컷, 8주에서 12주령)가 활용되었습니다. 연구에 필요한 장비 및 시약은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 망막 고정을 위한 준비

1. 다음 재료와 도구를 조립하십시오: 해부 현미경, 끝이 매우 가는 두 개의 집게, 가위, 1mL 주사기 바늘(바늘 크기: G26) 및 여과지.
2. 체중의 0.25mg/g에서 2,2,2-트리브로모에탄올을 복강내 주사하여 마우스를 깊게 마취합니다. 그 후, 쥐의 목을 베고 머리를 자른다¹⁶.
3. 팔꿈치 가위로 눈을 적출하고 0.1M 인산염 완충액(PB, pH 7.4)에 4% 파라포름알데히드-0.2% 피크르산이 함유된 유리 접시에 넣습니다.
4. 해부 현미경으로 1mL 주사 바늘을 사용하여 각막 변두리에 구멍을 뚫고 구멍을 따라 가위로 앞쪽 부분을 잘라냅니다. 그런 다음 집게로 안쪽 망막 표면에서 수정체를 제거합니다....

토론

이 논문에서는 시냅스 회로와 단백질 국소화의 성공적인 관찰을 위한 세 가지 중요한 단계, 즉 (1) 빠르고 약한 고정, (2) 사전 임베딩 면역염색, (3) 사후 고정 및 임베딩에 대해 설명했습니다.

우리는 고정이 성공적인 pre-embedding immuno-EM 접근법을 위한 핵심 단계라고 제안합니다. 따라서 여기에서 새로운 고정제와 빠른 고정의 중요성을 강조하며, 이 원?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe needle	kangdelai
1% OsO4	Electron Microscopy Science	19100
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
8% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
8% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
Anti-rabbit PKC	Sigma-Aldrich	P4334
Anti-Rabbit SP	Abcam	ab67006
DAB Substrate kit	MXB Biotechnologies	KIT-9701/9702/9703
Elbow scissors	Suzhou66 vision company	54010
Electron microscope	Phillips	CM120
Epon resin	Electron Microscopy Science	14910
forcep	Suzhou66 vision company	S101A
Millipore filter paper	Merck Millipore	PR05538
Na2HPO4· 12H2O	Sigma	71650	A component of phosphate buffer
NaH2PO4· H2O	Sigma	71507	A component of phosphate buffer
Picric acid	Electron Microscopy Science	19550
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma	215511
Tris	Solarbio	917R071
Ultramicrotome	Leica
Uranyl acetate	Electron Microscopy Science	22400
VACTASTAIN ABC kit, Peroxidase (Rabbit IgG)	Vector Laboratories	PK-4001