Étude des circuits rétiniens et de la localisation moléculaire par immunomicroscopie électronique pré-intégrée

Résumé

Ce protocole décrit en détail les étapes de la pré-intégration de l’immunomicroscopie électronique, en mettant l’accent sur l’exploration des circuits synaptiques et la localisation des protéines dans la rétine.

Résumé

La rétine comprend de nombreuses cellules formant divers circuits neuronaux, qui constituent la première étape de la voie visuelle. Chaque circuit est caractérisé par des caractéristiques uniques et des neurotransmetteurs distincts, déterminant son rôle et sa signification fonctionnelle. Étant donné la complexité des types de cellules au sein de sa structure, la complexité des circuits neuronaux de la rétine pose des défis pour l’exploration. Pour mieux étudier les circuits rétiniens et la diaphonie, tels que le lien entre les voies du cône et du bâtonnet, et la localisation moléculaire précise (neurotransmetteurs ou neuropeptides), comme la présence d’une immunoréactivité de type P dans la rétine de la souris, nous avons utilisé une méthode d’immunomicroscopie électronique pré-intégrée (immuno-EM) pour explorer les connexions synaptiques et l’organisation. Cette approche nous permet d’identifier des connexions synaptiques intercellulaires spécifiques et une localisation moléculaire précise et pourrait jouer un rôle guide dans l’exploration de sa fonction. Cet article décrit le protocole, les réactifs utilisés et les étapes détaillées, y compris (1) la préparation de la fixation de la rétine, (2) l’immunocoloration avant l’intégration et (3) la post-fixation et l’intégration.

Introduction

La complexité des circuits neuronaux de la rétine présente des défis pour l’exploration, compte tenu de la diversité des types de cellules au sein de sa structure ^1,2. La première étape consiste à identifier les connexions synaptiques entre différentes cellules et à déterminer la localisation cellulaire de neurotransmetteurs ou neuropeptides spécifiques. À mesure que les progrès de la biologie moléculaire introduisent de nouvelles protéines, une localisation précise dans la rétine devient cruciale pour comprendre leurs fonctions et analyser les circuits rétiniens et les connexions synaptiques ^3,4,5.

En raison de la résolution limitée de la microscopie optique, la microscopie électronique (EM) est couramment utilisée pour détecter les structures subcellulaires des cellules nerveuses. EM a différentes classifications, la microscopie électronique à transmission conventionnelle (MET) étant utilisée pour l’observation des ultrastructures^cellulaires 6,7,8,9. L’immunomicroscopie électronique (immuno-EM), qui combine la résolution spatiale des EM avec la capacité d’identification chimique des anticorps se liant spécifiquement aux protéines¹⁰, se distingue comme la méthode optimale et exclusive pour étudier les connexions synaptiques et la localisation des protéines subcellulaires dans la rétine^11,12.

Les techniques d’immuno-EM peuvent être divisées en méthodes de pré-intégration et de post-intégration en fonction de l’ordre d’intégration et d’incubation des anticorps. Par rapport à la méthode de post-intégration, l’approche de pré-intégration est capable d’une identification à grande échelle et à longue distance 13,14,15, offrant une approche optimale pour l’étude des processus cellulaires tels que les axones et les dendrites. De plus, cette technique fournit un signal fort et un large champ de vision, ce qui la rend avantageuse pour des études complètes de l’expression des protéines et de la localisation moléculaire dans le cytoplasme. Cette méthode s’avère particulièrement précieuse pour garantir des structures chimiquement identifiées qui sont visibles dans l’ensemble du cytoplasme, des cellules ou de la rétine.

Cependant, la méthode de post-intégration, bien qu’ayant une pénétration ou une diffusion plus faible par rapport à la méthode de pré-intégration, n’est pas aussi sensible^16,17. En termes simples, si l’objectif est d’explorer la localisation de neurotransmetteurs spécifiques dans le cytoplasme ou les terminaisons synaptiques, l’immuno-EM de pré-intégration est la méthode privilégiée. À l’inverse, pour identifier la localisation des récepteurs membranaires, il est plus recommandé d’utiliser l’immunogold EM post-intégration.

Compte tenu de ces considérations, nous optons pour la méthode immuno-EM de pré-intégration pour approfondir les circuits rétiniens, y compris l’interaction entre les voies du cône et du bâtonnet, et la localisation moléculaire, telle que la distribution et l’organisation synaptique de l’immunoréactivité de type P (SP-IR) dans la rétine de la souris.

Protocole

Les soins et la manipulation des animaux ont été approuvés par le règlement du comité d’éthique de l’Université de médecine de Wenzhou conformément aux directives de l’ARVO. Des souris adultes (C57BL/6J, mâles et femelles, âgées de 8 à 12 semaines) ont été utilisées dans cette recherche. L’équipement et les réactifs nécessaires à l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation à la fixation de la rétine

1. Assemblez le matériel et les outils suivants : un microscope à dissection, deux pinces à pointes très fines, des ciseaux, une aiguille de seringue de 1 ml (taille de l’aiguille : G26) et du papier filtre.
2. Anesthésier profondément les souris par injection intrapéritonéale de 2,2,2-tribromoéthanol à 0,25 mg/g de poids corporel. Par la suite, décapitez les souris et coupez-leur la tête¹⁶.
3. Énucléez leurs yeux avec des ciseaux coudiques et placez-les dans un plat en verre contenant 4 % de paraformaldéhyde et 0,2 % d’acide picrique dans un tampon phosphate 0,1 M (PB ; pH 7,4).
4. Sous le microscope de dissection, percer un trou au niveau du limbe cornéen à l’aide d’une aiguille à seringue de 1 mL et couper le segment antérieur avec des ciseaux, en suivant le trou. Ensuite, retirez le cristallin de la surface interne de la rétine à l’aide d’une pince.
5. À l’aide de deux pinces, décollez soigneusement la sclérotique jusqu’à ce que la rétine soit complètement isolée de l’œilleton (le tissu rétinien en forme de cuisse se sépare complètement de la choroïde). Par la suite, coupez la rétine en quatre morceaux.
6. Fixez ces sections dans du paraformaldéhyde à 4 % et de l’acide picrique à 0,2 % dans 0,1 M PB (pH 7,4) pendant 2 h à température ambiante (RT), puis transférez le tissu dans du paraformaldéhyde à 4 % dans 0,1 M PB (pH 10,4) pendant une nuit à 4 °C.

2. Immunomarquage pré-intégré

1. Après avoir lavé dans 0,01 M PBS (pH 7,4) six fois pendant 10 min chacune, incubez les tissus rétiniens dans du borohydrure de sodium à 1 % (NaBH₄) dans 0,01 M PBS (pH 7,4) pendant 30 min.
2. Laver les sections rétiniennes dans 0,01 M de PBS (pH 7,4) au moins six fois. Pendant ce temps, retirez le vitré avec du papier filtre, puis coupez la rétine en petites tranches entre 100 et 300 μm à l’aide d’une lame de rasoir à double tranchant.
3. Après avoir bloqué avec 5 % de sérum de chèvre normal (NGS) dans 0,1 M PB (pH 7,4) pendant 1 h à RT, incuber les tranches rétiniennes avec des anticorps primaires (PKCα anti-lapin, 1:80 ; Anti-Rabbit SP, 1:100) avec 2% NGS dans 0,01 M PBS (pH 7,4) pendant 2 h à RT sur agitateur. Par la suite, incuber pendant 96 h (5 jours) à 4 °C sur un agitateur.
4. Après avoir lavé six fois pendant 10 minutes chacune dans 0,01 M de PBS (pH 7,4), incubez les tranches rétiniennes avec l’anticorps secondaire à 1:200, comme l’IgG anti-lapin de chèvre, ainsi que 2 % de NGS dans 0,01 M de PBS (pH 7,4) pendant 2 h à RT sur un agitateur. Ensuite, incuber pendant 48 h (2 jours) à 4 °C sur un agitateur.
   REMARQUE : Les anticorps secondaires ont été appliqués seuls dans les expériences de contrôle.
5. Laver les bandes rétiniennes dans du PBS 0,01 M (pH 7,4) six fois pendant 10 min chacune avant de les incuber avec le réactif A et le réactif B du kit ABC à 1:100 dans du PBS 0,01M (pH 7,4) pendant 2 jours à 4 °C. (Le réactif A et le réactif B ont été dilués avec 0,01 M de PBS. Par exemple : Une solution : 6 μl ; solution B : 6 μl ; 0,01 M PBS : 588 μl, total de 600 μl).
6. Lavez les bandes rétiniennes dans un tampon Tris 0,05 M (pH 7,2) trois fois pendant 10 min chacune. Ensuite, pré-incubez les bandes rétiniennes avec 5 % du réactif 1 et 5 % du réactif 3 du kit DAB dans de l’eau distillée pendant 1 heure à température ambiante. (Le rapport par exemple : réactif 1 : 50 μl ; réactif 3 : 50 μl ; eau distillée : 900 μl, total de 1000 μl).
7. Teindre les bandes rétiniennes avec du DAB. Ajouter le même volume de solution à partir de trois tubes du kit DAB dans l’ordre (réactif 1-réactif 2-réactif 3). Observez l’état de coloration à l’aide du microscope de dissection. Arrêter la coloration lorsque les cellules deviennent brunes ; Ce processus prend 10 à 20 min.
8. Lavez les bandes rétiniennes avec un tampon Tris 0,05 M (pH 7,2) trois fois pendant 10 min chacune, puis lavez-les six fois avec du PBS 0,01 M pendant 10 min chacune.

3. Post-fixation et intégration

1. Fixez les bandes rétiniennes dans du glutaraldéhyde à 2 % pendant 1 à 2 h à température ambiante (RT), puis lavez-les dans du PBS 0,01 M (pH 7,4) six fois pendant 10 minutes chacune.
2. Incuber les bandes rétiniennes avec 1 % de tétroxyde d’osmium (OsO₄) dans 0,1 M PB pendant 1 h à RT et les conserver dans un endroit sombre.
3. Après s’être lavés à l’eau distillée (ddH₂O) six fois pendant 10 min chacune, incubez les tissus rétiniens avec de l’acétate d’uranyle pendant 1 h à RT et conservez-les dans un endroit sombre pour colorer ces tissus.
4. Mettez les tissus rétiniens dans des solutions d’acétone (50 %, 70 %, 80 % et 90 %) pendant 10 minutes chacune, puis dans 100 % deux fois pendant 10 minutes chacune.
5. Tremper les tissus rétiniens dans un mélange contenant le même volume d’acétate d’uranyle et une résine époxy pendant 1 h à une étuve de séchage à 37 °C, puis un mélange contenant de l’acétate d’uranyle et de la résine (1:4) pendant une nuit à une étuve de séchage à 37 °C.
6. Transférez doucement les tissus rétiniens à l’aide d’un cure-dent dans la nouvelle résine pendant 1 h à 45 °C dans une étuve de séchage, puis la bande rétinienne orientée est incorporée dans la plaque d’enrobage avec la résine.
7. Placez l’échantillon dans une étuve de séchage à 45 °C pendant 3 h et dans une éveuse de séchage à 65 °C pendant 48 h.
8. Façonnez les blocs d’enrobage en trapèzes et coupez le bloc en sections de 1 μm d’épaisseur avec un ultramicrotome, colorez ces sections avec du bleu de toluidine et pré-criblez les régions d’intérêt au microscope optique.
9. Prélever des coupes ultraminces (70-90 nm) sur des grilles de cuivre et les observer au microscope électronique.

Résultats

La figure 1 montre des exemples d’expériences de contrôle sans incubation d’anticorps primaires contre la protéine kinase C alpha (PKCα) ou SP, dans lesquelles aucune immunoréactivité (IR) n’a été trouvée.

La figure 2 représente la PKCα-IR dans la rétine de la souris. PKCα sert de marqueur pour toutes les cellules bipolaires en bâtonnets (GR) de la rétine¹⁸...

Discussion

Cet article a décrit trois étapes critiques pour l’observation réussie des circuits synaptiques et de la localisation des protéines : (1) la fixation rapide et faible, (2) l’immunomarquage avant l’intégration et (3) la post-fixation et l’intégration.

Nous proposons que la fixation soit l’étape clé d’une approche immuno-EM réussie de pré-intégration. Ainsi, l’importance d’un fixateur frais et d’une fixation rapide est soulignée ici...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe needle	kangdelai
1% OsO4	Electron Microscopy Science	19100
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
8% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
8% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
Anti-rabbit PKC	Sigma-Aldrich	P4334
Anti-Rabbit SP	Abcam	ab67006
DAB Substrate kit	MXB Biotechnologies	KIT-9701/9702/9703
Elbow scissors	Suzhou66 vision company	54010
Electron microscope	Phillips	CM120
Epon resin	Electron Microscopy Science	14910
forcep	Suzhou66 vision company	S101A
Millipore filter paper	Merck Millipore	PR05538
Na2HPO4· 12H2O	Sigma	71650	A component of phosphate buffer
NaH2PO4· H2O	Sigma	71507	A component of phosphate buffer
Picric acid	Electron Microscopy Science	19550
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma	215511
Tris	Solarbio	917R071
Ultramicrotome	Leica
Uranyl acetate	Electron Microscopy Science	22400
VACTASTAIN ABC kit, Peroxidase (Rabbit IgG)	Vector Laboratories	PK-4001