Étude des circuits rétiniens et de la localisation moléculaire par immunomicroscopie électronique pré-intégrée

Résumé

Ce protocole décrit en détail les étapes de la pré-intégration de l’immunomicroscopie électronique, en mettant l’accent sur l’exploration des circuits synaptiques et la localisation des protéines dans la rétine.

Résumé

La rétine comprend de nombreuses cellules formant divers circuits neuronaux, qui constituent la première étape de la voie visuelle. Chaque circuit est caractérisé par des caractéristiques uniques et des neurotransmetteurs distincts, déterminant son rôle et sa signification fonctionnelle. Étant donné la complexité des types de cellules au sein de sa structure, la complexité des circuits neuronaux de la rétine pose des défis pour l’exploration. Pour mieux étudier les circuits rétiniens et la diaphonie, tels que le lien entre les voies du cône et du bâtonnet, et la localisation moléculaire précise (neurotransmetteurs ou neuropeptides), comme la présence d’une immunoréactivité de type P dans la rétine de la souris, nous avons utilisé une méthode d’immunomicroscopie électronique pré-intégrée (immuno-EM) pour explorer les connexions synaptiques et l’organisation. Cette approche nous permet d’identifier des connexions synaptiques intercellulaires spécifiques et une localisation moléculaire précise et pourrait jouer un rôle guide dans l’exploration de sa fonction. Cet article décrit le protocole, les réactifs utilisés et les étapes détaillées, y compris (1) la préparation de la fixation de la rétine, (2) l’immunocoloration avant l’intégration et (3) la post-fixation et l’intégration.

Introduction

La complexité des circuits neuronaux de la rétine présente des défis pour l’exploration, compte tenu de la diversité des types de cellules au sein de sa structure ^1,2. La première étape consiste à identifier les connexions synaptiques entre différentes cellules et à déterminer la localisation cellulaire de neurotransmetteurs ou neuropeptides spécifiques. À mesure que les progrès de la biologie moléculaire introduisent de nouvelles protéines, une localisation précise dans la rétine devient cruciale pour comprendre leurs fonctions et analyser les circuits rétiniens et les connex....

Protocole

Les soins et la manipulation des animaux ont été approuvés par le règlement du comité d’éthique de l’Université de médecine de Wenzhou conformément aux directives de l’ARVO. Des souris adultes (C57BL/6J, mâles et femelles, âgées de 8 à 12 semaines) ont été utilisées dans cette recherche. L’équipement et les réactifs nécessaires à l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation à la fixation de la rétine

1. Assemblez le matériel et les outils suivants : un microscope à dissection, deux pinces à pointes très fines, des ciseaux, une aiguille de seringu....

Discussion

Cet article a décrit trois étapes critiques pour l’observation réussie des circuits synaptiques et de la localisation des protéines : (1) la fixation rapide et faible, (2) l’immunomarquage avant l’intégration et (3) la post-fixation et l’intégration.

Nous proposons que la fixation soit l’étape clé d’une approche immuno-EM réussie de pré-intégration. Ainsi, l’importance d’un fixateur frais et d’une fixation rapide est soulignée ici.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe needle	kangdelai
1% OsO4	Electron Microscopy Science	19100
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
8% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
8% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
Anti-rabbit PKC	Sigma-Aldrich	P4334
Anti-Rabbit SP	Abcam	ab67006
DAB Substrate kit	MXB Biotechnologies	KIT-9701/9702/9703
Elbow scissors	Suzhou66 vision company	54010
Electron microscope	Phillips	CM120
Epon resin	Electron Microscopy Science	14910
forcep	Suzhou66 vision company	S101A
Millipore filter paper	Merck Millipore	PR05538
Na2HPO4· 12H2O	Sigma	71650	A component of phosphate buffer
NaH2PO4· H2O	Sigma	71507	A component of phosphate buffer
Picric acid	Electron Microscopy Science	19550
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma	215511
Tris	Solarbio	917R071
Ultramicrotome	Leica
Uranyl acetate	Electron Microscopy Science	22400
VACTASTAIN ABC kit, Peroxidase (Rabbit IgG)	Vector Laboratories	PK-4001