通过预包埋免疫电子显微镜研究视网膜回路和分子定位

摘要

该协议概述了预嵌入免疫电子显微镜检查的详细步骤，重点是探索视网膜中的突触回路和蛋白质定位。

摘要

视网膜由许多细胞组成，形成不同的神经元回路，构成视觉通路的第一阶段。每个回路都具有独特的特征和不同的神经递质，决定了它的作用和功能意义。鉴于其结构内错综复杂的细胞类型，视网膜中神经元回路的复杂性为探索带来了挑战。为了更好地研究视网膜回路和串扰，例如视锥细胞和视杆通路之间的联系，以及精确的分子定位（神经递质或神经肽），例如小鼠视网膜中存在 P 物质样免疫反应性，我们采用了预嵌入免疫电子显微镜 （immuno-EM） 方法来探索突触连接和组织。这种方法使我们能够确定特定的细胞间突触连接和精确的分子定位，并且可以在探索其功能方面发挥指导作用。本文介绍了实验步骤、使用的试剂和详细步骤，包括 （1） 视网膜固定准备，（2） 包埋前免疫染色，以及 （3） 固定后和包埋。

引言

考虑到其结构中的多种细胞类型，视网膜中神经元回路的复杂性为探索带来了挑战 ^1,2。第一步包括识别不同细胞之间的突触连接并确定特定神经递质或神经肽的细胞定位。随着分子生物学的进步引入新的蛋白质，在视网膜中的精确定位对于了解其功能以及分析视网膜回路和突触连接变得至关重要 ^3,4,5。

由于光学显微镜的分辨率有限，电子显微镜 （EM） 通常用于检测神经细胞的亚细胞结构。EM 有多种分类，传统的透射电子显微镜 （TEM） 用于观察细胞超微结构 6,7,8,9。免疫电子显微镜 （immuno-EM） 将 EM 的空间分辨率与特异性结合蛋白质的抗体的化学鉴定能力相结合¹⁰，是研究视网膜中突触连接和亚细胞蛋白定位的最佳和唯一方法^11,12。

免疫电镜技术根据包埋和抗体孵育的顺序可分为预包埋和后包埋方法。与后嵌入方法相比，预嵌入方法能够进行大规模和远距离识别 13,14,15，为研究轴突和树突等细胞过程提供了最佳方法。此外，该技术提供了强信号和宽视野，使其有利于全面研究细胞质中的蛋白质表达和分子定位。事实证明，这种方法在确保化学鉴定结构在整个细胞质、细胞或视网膜中可见方面特别有价值。

然而，后嵌入方法虽然与预嵌入方法相比具有较低的渗透或扩散，但不那么敏感^16,17。简单来说，如果目标是探索特定神经递质在细胞质或突触末梢中的定位，则预嵌入免疫电镜是首选方法。相反，为了鉴定膜受体的定位，更建议使用包埋后免疫金 EM。

鉴于这些考虑，我们选择预嵌入免疫电镜方法来深入研究视网膜回路，包括视锥细胞和视杆细胞通路之间的相互作用，以及分子定位，例如 P 物质免疫反应性 （SP-IR） 在小鼠视网膜中的分布和突触组织。

研究方案

根据 ARVO 指南，温州医科大学伦理委员会法规批准了动物的护理和处理。本研究使用成年小鼠 （C57BL/6J，雄性和雌性，8 至 12 周龄）。研究所需的设备和试剂列在 材料表中。

1. 视网膜固定的准备

1. 组装以下材料和工具:解剖显微镜、两个带有非常细尖端的镊子、剪刀、1 mL 注射器针头（针头尺寸:G26）和滤纸。
2. 通过腹膜内注射 0.25 mg/g 体重的 2,2,2-三溴乙醇对小鼠进行深度麻醉。随后，将老鼠斩首并切开它们的头¹⁶.
3. 用肘部剪刀摘除眼睛，并将其放入含有 4% 多聚甲醛-0.2% 苦味酸和 0.1 M 磷酸盐缓冲液 （PB;pH 7.4） 的玻璃皿中。
4. 在解剖显微镜下，使用 1 mL 注射器针头在角膜缘上打一个孔，然后用剪刀沿着孔切掉眼前段。然后，用镊子从视网膜内表面取下晶状体。
5. 用两把镊子小心地剥开巩膜，直到视网膜与眼罩完全分离（丘比视网膜组织与脉络膜完全分离）。随后，将视网膜切成四块。
6. 在室温 （RT） 下将这些切片在 0.1 M PB （pH 7.4） 中的 4% 多聚甲醛-0.2% 苦味酸中固定 2 小时，然后将组织转移到 0.1 M PB （pH 10.4） 中的 4% 多聚甲醛中过夜。

2. 预包埋免疫染色

1. 在 0.01 M PBS （pH 7.4） 中洗涤 6 次，每次 10 分钟后，将视网膜组织在 1% 硼氢化钠 （NaBH₄） 中在 0.01 M PBS （pH 7.4） 中孵育 30 分钟。
2. 在 0.01 M PBS （pH 7.4） 中洗涤视网膜切片至少六次。同时，用滤纸去除玻璃体，然后使用双刃剃须刀片将视网膜切成 100-300 μm 之间的小片。
3. 在 RT 下用 0.1 M PB （pH 7.4） 中的 5% 正常山羊血清 （NGS） 封闭 1 小时后，将视网膜切片与一抗（抗兔 PKCα，1:80;抗兔 SP，1:100）以及 2% NGS 的 0.01 M PBS （pH 7.4） 溶液，在摇床上室温下放置 2 小时。随后，在 4 °C 下在摇床上孵育 96 小时（5 天）。
4. 在 0.01 M PBS（pH 7.4）中洗涤 6 次，每次 10 分钟后，将视网膜切片与 1:200 的二抗（例如山羊抗兔 IgG）以及 2% NGS 在 0.01 M PBS（pH 7.4）中孵育 2 小时在室温下在摇床上。接下来，在 4 °C 下在摇床上孵育 48 小时（2 天）。
   注:在对照实验中单独使用二抗。
5. 在 0.01 M PBS （pH 7.4） 中洗涤视黄醛条纹 6 次，每次 10 分钟，然后与 ABC 试剂盒中的试剂 A 和试剂 B 在 0.01M PBS （pH 7.4） 中以 1:100 的比例在 4°C 下孵育 2 天。 （试剂 A 和试剂 B 均用 0.01 M PBS 稀释。例如:A 溶液:6 μl;B 溶液:6 μl;0.01 M PBS:588 μl，共 600 μl）。
6. 在 0.05 M Tris 缓冲液 （pH 7.2） 中洗涤视网膜条纹 3 次，每次 10 分钟。然后，将视网膜条纹与 DAB 试剂盒中的 5% 试剂 1 和 5% 试剂 3 在蒸馏水中在室温下预孵育 1 小时。（比例例如:试剂 1:50 μl;试剂 3:50 μl;蒸馏水:900 μl，总共 1000 μl）。
7. 用 DAB 对视网膜条纹进行染色。依次从 DAB 试剂盒中的三个试管中加入相同体积的溶液（试剂 1-试剂 2-试剂 3）。使用解剖显微镜观察染色情况。当细胞变成棕色时停止染色;此过程需要 10-20 分钟。
8. 用 0.05 M Tris 缓冲液 （pH 7.2） 洗涤视网膜条纹 3 次，每次 10 分钟，然后在 0.01 M PBS 中洗涤 6 次，每次 10 分钟。

3. 固定后和包埋

1. 在室温 （RT） 下将视网膜条纹在 2% 戊二醛中固定 1-2 小时，然后在 0.01 M PBS （pH 7.4） 中洗涤 6 次，每次 10 分钟。
2. 将视网膜条纹与 1% 四氧化锇 （OsO₄） 在 0.1 M PB 中在 RT 下孵育 1 小时，并将它们保存在黑暗处。
3. 在蒸馏水 （ddH₂O） 中洗涤 6 次，每次 10 分钟后，将视网膜组织与乙酸铀酰在 RT 下孵育 1 小时，并将它们保存在黑暗处以染色这些组织。
4. 将视黄醛组织放入丙酮溶液（50%、70%、80% 和 90%）中，每次 10 分钟，然后放入 100% 中两次，每次 10 分钟。
5. 将视网膜组织在含有相同体积的乙酸铀酰和环氧树脂的混合物中，在37°C干燥箱中浸泡1小时，然后将含有乙酸铀酰和树脂（1:4）的混合物在37°C干燥箱中浸泡过夜。
6. 用牙签将视网膜组织在干燥箱中于 45 °C 轻轻转移到新树脂中 1 小时，然后将定向的视网膜条纹与树脂一起嵌入包埋板中。
7. 将样品放入 45 °C 干燥箱中 3 小时，在 65 °C 干燥箱中放置 48 小时。
8. 将包埋块塑造成梯形，用超薄切片机将块切成 1 μm 厚的切片，用甲苯胺蓝染色这些切片，并在光学显微镜下预筛选感兴趣的区域。
9. 在铜网格上收集超薄切片 （70-90 nm） 并在电子显微镜下观察它们。

结果

图 1 显示了未孵育针对蛋白激酶 C α （PKCα） 或 SP 的一抗的对照实验示例，其中未发现免疫反应性 （IR）。

图 2 描绘了小鼠视网膜中的 PKCα-IR。PKCα 是视网膜中所有杆状双极细胞 （RBC） 的标志物¹⁸。在电子显微镜 （EM） 水平上，可以通过 PKCα-IR 识别 RBC，并通过具有高电子密度的二氨?...

讨论

本文描述了成功观察突触回路和蛋白质定位的三个关键步骤:（1） 快速和弱固定，（2） 包埋前免疫染色，以及 （3） 固定后和包埋。

我们提出固定是成功的预嵌入免疫 EM 方法的关键步骤。因此，这里强调了新鲜固定剂和快速固定的重要性，并将该原理命名为"4F 原则"，这在组织制备中至关重要。然而，同时实现增强的抗体渗透和有效固定是一项挑?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe needle	kangdelai
1% OsO4	Electron Microscopy Science	19100
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
8% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
8% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
Anti-rabbit PKC	Sigma-Aldrich	P4334
Anti-Rabbit SP	Abcam	ab67006
DAB Substrate kit	MXB Biotechnologies	KIT-9701/9702/9703
Elbow scissors	Suzhou66 vision company	54010
Electron microscope	Phillips	CM120
Epon resin	Electron Microscopy Science	14910
forcep	Suzhou66 vision company	S101A
Millipore filter paper	Merck Millipore	PR05538
Na2HPO4· 12H2O	Sigma	71650	A component of phosphate buffer
NaH2PO4· H2O	Sigma	71507	A component of phosphate buffer
Picric acid	Electron Microscopy Science	19550
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma	215511
Tris	Solarbio	917R071
Ultramicrotome	Leica
Uranyl acetate	Electron Microscopy Science	22400
VACTASTAIN ABC kit, Peroxidase (Rabbit IgG)	Vector Laboratories	PK-4001