通过预包埋免疫电子显微镜研究视网膜回路和分子定位

摘要

该协议概述了预嵌入免疫电子显微镜检查的详细步骤，重点是探索视网膜中的突触回路和蛋白质定位。

摘要

视网膜由许多细胞组成，形成不同的神经元回路，构成视觉通路的第一阶段。每个回路都具有独特的特征和不同的神经递质，决定了它的作用和功能意义。鉴于其结构内错综复杂的细胞类型，视网膜中神经元回路的复杂性为探索带来了挑战。为了更好地研究视网膜回路和串扰，例如视锥细胞和视杆通路之间的联系，以及精确的分子定位（神经递质或神经肽），例如小鼠视网膜中存在 P 物质样免疫反应性，我们采用了预嵌入免疫电子显微镜 （immuno-EM） 方法来探索突触连接和组织。这种方法使我们能够确定特定的细胞间突触连接和精确的分子定位，并且可以在探索其功能方面发挥指导作用。本文介绍了实验步骤、使用的试剂和详细步骤，包括 （1） 视网膜固定准备，（2） 包埋前免疫染色，以及 （3） 固定后和包埋。

引言

考虑到其结构中的多种细胞类型，视网膜中神经元回路的复杂性为探索带来了挑战 ^1,2。第一步包括识别不同细胞之间的突触连接并确定特定神经递质或神经肽的细胞定位。随着分子生物学的进步引入新的蛋白质，在视网膜中的精确定位对于了解其功能以及分析视网膜回路和突触连接变得至关重要 ^3,4,5。

由于光学显微镜的分辨率有限，电子显微镜 （EM） 通常用于检测神经细胞的亚细胞结构。EM 有多种分类，传统的透射电子显微镜 （TEM） 用于观察细胞超微结构 6,7,8,9。免疫电子显微镜 （immuno-EM） 将 EM 的空间分辨率与特异性结合蛋白质的抗体的化学鉴定能力相结合¹⁰，是研究视网膜中突触连接和亚细胞蛋白定位的最佳和唯....

研究方案

根据 ARVO 指南，温州医科大学伦理委员会法规批准了动物的护理和处理。本研究使用成年小鼠 （C57BL/6J，雄性和雌性，8 至 12 周龄）。研究所需的设备和试剂列在 材料表中。

1. 视网膜固定的准备

1. 组装以下材料和工具：解剖显微镜、两个带有非常细尖端的镊子、剪刀、1 mL 注射器针头（针头尺寸：G26）和滤纸。
2. 通过腹膜内注射 0.25 mg/g 体重的 2,2,2-三溴乙醇对小鼠进行深度麻醉。随后，将老鼠斩首并切开它们的头¹⁶.
3. 用肘部剪刀摘除眼睛，并将其放入含有 4% 多聚甲醛-0.2% 苦味酸和 0.1 M 磷酸盐缓冲液 （PB;pH 7.4） 的玻璃皿中。
4. 在解剖显微镜下，使用 1 mL 注射器针头在角膜缘上打一个孔，然后用剪刀沿着孔切掉眼前段。然后，用镊子从视网膜内表面取下晶状体。
5. 用两把镊子小心地剥开巩膜，直到视网膜与眼罩完全分离（丘比视网膜组织与脉络膜完全分离）。随后，将视网膜切成四块。
6. 在室温 （RT） 下将这些切片在 0.1 M PB （pH 7.4） 中的 4% 多聚甲醛-0.2% 苦味酸中固定 2 小时，然后将组织转移到 0.1 M PB （pH ....

讨论

本文描述了成功观察突触回路和蛋白质定位的三个关键步骤：（1） 快速和弱固定，（2） 包埋前免疫染色，以及 （3） 固定后和包埋。

我们提出固定是成功的预嵌入免疫 EM 方法的关键步骤。因此，这里强调了新鲜固定剂和快速固定的重要性，并将该原理命名为“4F 原则”，这在组织制备中至关重要。然而，同时实现增强的抗体渗透和有效固定是一?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe needle	kangdelai
1% OsO4	Electron Microscopy Science	19100
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
8% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
8% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
Anti-rabbit PKC	Sigma-Aldrich	P4334
Anti-Rabbit SP	Abcam	ab67006
DAB Substrate kit	MXB Biotechnologies	KIT-9701/9702/9703
Elbow scissors	Suzhou66 vision company	54010
Electron microscope	Phillips	CM120
Epon resin	Electron Microscopy Science	14910
forcep	Suzhou66 vision company	S101A
Millipore filter paper	Merck Millipore	PR05538
Na2HPO4· 12H2O	Sigma	71650	A component of phosphate buffer
NaH2PO4· H2O	Sigma	71507	A component of phosphate buffer
Picric acid	Electron Microscopy Science	19550
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma	215511
Tris	Solarbio	917R071
Ultramicrotome	Leica
Uranyl acetate	Electron Microscopy Science	22400
VACTASTAIN ABC kit, Peroxidase (Rabbit IgG)	Vector Laboratories	PK-4001