Untersuchung von retinalen Schaltkreisen und molekularer Lokalisierung durch Voreinbettung der Immunelektronenmikroskopie

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die detaillierten Schritte der Immunelektronenmikroskopie vor der Einbettung, wobei der Schwerpunkt auf der Erforschung synaptischer Schaltkreise und der Proteinlokalisierung in der Netzhaut liegt.

Zusammenfassung

Die Netzhaut besteht aus zahlreichen Zellen, die verschiedene neuronale Schaltkreise bilden, die die erste Stufe der Sehbahn bilden. Jeder Schaltkreis zeichnet sich durch einzigartige Merkmale und unterschiedliche Neurotransmitter aus, die seine Rolle und funktionelle Bedeutung bestimmen. Angesichts der komplizierten Zelltypen innerhalb ihrer Struktur stellt die Komplexität der neuronalen Schaltkreise in der Netzhaut eine Herausforderung für die Erforschung dar. Um retinale Schaltkreise und Cross-Talks, wie z.B. die Verbindung zwischen Zapfen- und Stäbchenwegen, und die genaue molekulare Lokalisierung (Neurotransmitter oder Neuropeptide), wie z.B. das Vorhandensein von Substanz P-ähnlicher Immunreaktivität in der Netzhaut der Maus, besser untersuchen zu können, haben wir eine Pre-Embedding-Immunelektronenmikroskopie (Immuno-EM) Methode eingesetzt, um synaptische Verbindungen und Organisation zu untersuchen. Dieser Ansatz ermöglicht es uns, spezifische interzelluläre synaptische Verbindungen und eine präzise molekulare Lokalisierung zu lokalisieren und könnte eine richtungsweisende Rolle bei der Erforschung seiner Funktion spielen. Dieser Artikel beschreibt das Protokoll, die verwendeten Reagenzien und detaillierte Schritte, einschließlich (1) Vorbereitung der Netzhautfixierung, (2) Immunfärbung vor der Einbettung und (3) Nachfixierung und Einbettung.

Einleitung

Die Komplexität der neuronalen Schaltkreise in der Netzhaut stellt eine Herausforderung für die Erforschung dar, wenn man die unterschiedlichen Zelltypen innerhalb ihrer Struktur berücksichtigt ^1,2. In einem ersten Schritt geht es darum, synaptische Verbindungen zwischen verschiedenen Zellen zu identifizieren und die zelluläre Lokalisation bestimmter Neurotransmitter oder Neuropeptide zu bestimmen. Mit den Fortschritten in der Molekularbiologie und der Einführung neuer Proteine wird die präzise Lokalisierung in der Netzhaut entscheidend für das Verständnis ihrer Funktionen und die Analyse von retinalen Schaltkreisen und synaptischen Verbindungen ^3,4,5.

Aufgrund der begrenzten Auflösung der Lichtmikroskopie wird die Elektronenmikroskopie (EM) häufig eingesetzt, um die subzellulären Strukturen von Nervenzellen zu detektieren. EM hat verschiedene Klassifikationen, wobei die konventionelle Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) zur Beobachtung von Zellultrastrukturen verwendet wird 6,7,8,9. Die Immunelektronenmikroskopie (Immuno-EM), die die räumliche Auflösung der EM mit der chemischen Identifizierungsfähigkeit von Antikörpern kombiniert, die spezifisch an Proteine^{binden 10}, erweist sich als die optimale und exklusive Methode zur Untersuchung synaptischer Verbindungen und der subzellulären Proteinlokalisation in der Netzhaut^11,12.

Immun-EM-Techniken können in Prä-Embedding- und Post-Embedding-Methoden unterteilt werden, basierend auf der Reihenfolge der Einbettung und der Antikörperinkubation. Im Vergleich zur Post-Embedding-Methode ist der Pre-Embedding-Ansatz in der Lage, großflächig und über große Entfernungen zu identifizieren 13,14,15 und bietet einen optimalen Ansatz für die Untersuchung von Zellprozessen wie Axonen und Dendriten. Darüber hinaus bietet diese Technik ein starkes Signal und ein breites Sichtfeld, was sie für umfassende Untersuchungen der Proteinexpression und der molekularen Lokalisation im Zytoplasma vorteilhaft macht. Diese Methode erweist sich als besonders wertvoll, um chemisch identifizierte Strukturen zu gewährleisten, die im gesamten Zytoplasma, in den Zellen oder in der Netzhaut sichtbar sind.

Die Post-Embedding-Methode weist zwar eine geringere Penetration oder Diffusion im Vergleich zur Pre-Embedding-Methode auf, ist jedoch nicht so empfindlich^16,17. Einfach ausgedrückt: Wenn das Ziel darin besteht, die Lokalisation spezifischer Neurotransmitter im Zytoplasma oder in den synaptischen Endungen zu untersuchen, ist die Pre-Embedding-Immuno-EM die bevorzugte Methode. Umgekehrt wird zur Identifizierung der Lokalisation von Membranrezeptoren eher empfohlen, Immunogold-EM nach der Einbettung zu verwenden.

Vor diesem Hintergrund entscheiden wir uns für die Pre-Embedding-Immuno-EM-Methode, um in retinale Schaltkreise einzutauchen, einschließlich der Interaktion zwischen Zapfen- und Stäbchenwegen, und der molekularen Lokalisation, wie z. B. der Verteilung und synaptischen Organisation der Substanz P-like Immunoreactivity (SP-IR) in der Netzhaut der Maus.

Protokoll

Die Pflege und der Umgang mit den Tieren wurden durch die Verordnung der Ethikkommission der Medizinischen Universität Wenzhou in Übereinstimmung mit den ARVO-Richtlinien genehmigt. In dieser Studie wurden adulte Mäuse (C57BL/6J, männlich und weiblich, 8 bis 12 Wochen alt) verwendet. Die für die Studie benötigten Geräte und Reagenzien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung für die Netzhautfixierung

1. Stellen Sie folgende Materialien und Werkzeuge zusammen: ein Präpariermikroskop, zwei Pinzetten mit sehr feinen Spitzen, eine Schere, eine 1 mL Spritzennadel (Nadelstärke: G26) und Filterpapier.
2. Mäuse durch intraperitoneale Injektion von 2,2,2-Tribromethanol bei 0,25 mg/g Körpergewicht tief anästhesieren. Enthaupte anschließend die Mäuse und schneide ihnen die Köpfe ab¹⁶.
3. Entkernen Sie die Augen mit einer Ellbogenschere und legen Sie sie in eine Glasschale, die 4 % Paraformaldehyd-0,2 % Pikrinsäure in 0,1 M Phosphatpuffer (PB; pH 7,4) enthält.
4. Stanzen Sie unter dem Präpariermikroskop mit einer 1-ml-Spritzennadel ein Loch in den Hornhautlimbus und schneiden Sie den vorderen Abschnitt mit einer Schere ab, indem Sie dem Loch folgen. Entfernen Sie dann die Linse mit einer Pinzette von der inneren Netzhautoberfläche.
5. Schäle die Sklera mit zwei Pinzetten vorsichtig, bis die Netzhaut vollständig von der Augenmuschel isoliert ist (das kuschelige Netzhautgewebe löst sich vollständig von der Aderhaut). Schneide anschließend die Netzhaut in vier Stücke.
6. Fixieren Sie diese Abschnitte 2 h lang bei Raumtemperatur (RT) in 4 % Paraformaldehyd-0,2 % Pikrinsäure in 0,1 M PB (pH 7,4) und übertragen Sie das Gewebe dann über Nacht bei 4 °C auf 4 % Paraformaldehyd in 0,1 M PB (pH 10,4).

2. Immunfärbung vor der Einbettung

1. Nach sechsmaligem Waschen in 0,01 M PBS (pH 7,4) für jeweils 10 min inkubieren Sie das Netzhautgewebe in 1 % Natriumborhydrid (NaBH₄) in 0,01 M PBS (pH 7,4) für 30 min.
2. Waschen Sie die Netzhautschnitte mindestens sechsmal in 0,01 M PBS (pH 7,4). In der Zwischenzeit den Glaskörper mit Filterpapier entfernen und anschließend die Netzhaut mit einer zweischneidigen Rasierklinge in kleine Scheiben zwischen 100-300 μm schneiden.
3. Nach Blockierung mit 5 % normalem Ziegenserum (NGS) in 0,1 M PB (pH 7,4) für 1 h bei RT inkubieren Sie die Netzhautschnitte mit primären Antikörpern (Anti-Kaninchen-PKCα, 1:80; Anti-Kaninchen-SP, 1:100) zusammen mit 2 % NGS in 0,01 M PBS (pH 7,4) für 2 h bei RT auf einem Shaker. Anschließend 96 h (5 Tage) bei 4 °C auf einem Shaker inkubieren.
4. Nach sechsmaligem Waschen für jeweils 10 Minuten in 0,01 M PBS (pH 7,4) inkubieren Sie die Netzhautscheiben mit dem Sekundärantikörper bei 1:200, wie z. B. Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG, zusammen mit 2 % NGS in 0,01 M PBS (pH 7,4) für 2 h bei RT auf einem Shaker. Anschließend 48 h (2 Tage) bei 4 °C auf einem Shaker inkubieren.
   HINWEIS: Sekundärantikörper wurden in Kontrollexperimenten allein appliziert.
5. Waschen Sie die Netzhautstreifen sechsmal in 0,01 M PBS (pH 7,4) für jeweils 10 Minuten, bevor Sie sie mit Reagenz A und Reagenz B aus dem ABC-Kit bei 1:100 in 0,01 M PBS (pH 7,4) für 2 Tage bei 4 °C inkubieren. (Sowohl Reagenz A als auch Reagenz B wurden mit 0,01 M PBS verdünnt. Zum Beispiel: Eine Lösung: 6 μl; B-Lösung: 6 μl; 0,01 M PBS: 588 μl, insgesamt 600 μl).
6. Waschen Sie die Netzhautstreifen dreimal für jeweils 10 min in 0,05 M Tris-Puffer (pH 7,2). Dann inkubieren Sie die Netzhautstreifen mit 5 % Reagenz 1 und 5 % Reagenz 3 aus dem DAB-Kit 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in destilliertem Wasser. (Das Verhältnis zum Beispiel: Reagenz 1: 50 μl; Reagenz 3: 50 μl; destilliertes Wasser: 900 μl, insgesamt 1000 μl).
7. Färben Sie die Netzhautstreifen mit DAB. Geben Sie nacheinander das gleiche Volumen der Lösung aus drei Röhrchen des DAB-Kits hinzu (Reagenz 1-Reagenz 2-Reagenz 3). Beobachten Sie den Färbezustand mit dem Präpariermikroskop. Stoppen Sie die Färbung, wenn die Zellen braun werden; Dieser Vorgang dauert 10-20 Minuten.
8. Waschen Sie die Netzhautstreifen dreimal für jeweils 10 min mit 0,05 M Tris-Puffer (pH 7,2) und waschen Sie sie dann sechsmal für jeweils 10 min in 0,01 M PBS.

3. Nachfixierung und Einbettung

1. Fixieren Sie die Netzhautstreifen 1-2 h lang bei Raumtemperatur (RT) in 2% Glutaraldehyd und waschen Sie sie dann sechsmal für jeweils 10 min in 0,01 M PBS (pH 7,4).
2. Inkubieren Sie die Netzhautstreifen mit 1% Osmiumtetroxid (OsO₄) in 0,1 M PB für 1 h bei RT und bewahren Sie sie an einem dunklen Ort auf.
3. Nach sechsmaligem Waschen in destilliertem Wasser (ddH₂O) für jeweils 10 min inkubieren Sie das Netzhautgewebe 1 h lang bei RT mit Uranylacetat und bewahren Sie es an einem dunklen Ort auf, um dieses Gewebe zu färben.
4. Legen Sie das Netzhautgewebe jeweils 10 Minuten lang in Acetonlösungen (50%, 70%, 80% und 90%) und dann zweimal für jeweils 10 Minuten in 100% ein.
5. Tauchen Sie das Netzhautgewebe 1 h lang bei 37 °C Trockenschrank in eine Mischung mit dem gleichen Volumen Uranylacetat und einem Epoxidharz, gefolgt von einer Mischung aus Uranylacetat und dem Harz (1:4) über Nacht bei 37 °C Trockenschrank.
6. Das Netzhautgewebe wird mit einem Zahnstocher für 1 h bei 45 °C in einem Trockenschrank vorsichtig in das neue Harz überführt, dann wird der orientierte Netzhautstreifen mit dem Harz in die Einbettungsplatte eingebettet.
7. Die Probe 3 h lang in einen 45 °C Trockenschrank und 48 h in einen 65 °C Trockenschrank geben.
8. Formen Sie die Einbettungsblöcke zu Trapezen und schneiden Sie den Block mit einem Ultramikrotom in 1 μm dicke Abschnitte, färben Sie diese Abschnitte mit Toluidinblau und screenen Sie die interessierenden Bereiche unter einem Lichtmikroskop.
9. Sammeln Sie ultradünne Schnitte (70-90 nm) auf Kupfergittern und betrachten Sie sie unter einem Elektronenmikroskop.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt Beispiele für Kontrollexperimente ohne Inkubation von Primärantikörpern gegen Proteinkinase C alpha (PKCα) oder SP, in denen keine Immunreaktivität (IR) gefunden wurde.

Abbildung 2 zeigt das PKCα-IR in der Netzhaut der Maus. PKCα dient als Marker für alle Stäbchen-Bipolarzellen (RBC) in der Netzhaut¹⁸. Auf der Ebene der Elektronenmikroskopie (EM) kön...

Diskussion

In diesem Artikel wurden drei kritische Schritte für die erfolgreiche Beobachtung synaptischer Schaltkreise und der Proteinlokalisierung beschrieben: (1) schnelle und schwache Fixierung, (2) Immunfärbung vor der Einbettung und (3) Nachfixierung und Einbettung.

Wir gehen davon aus, dass die Fixierung der Schlüsselschritt für einen erfolgreichen Ansatz vor der Einbettung von Immuno-EM ist. Daher wird hier die Bedeutung von frischem Fixiermittel und schneller...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe needle	kangdelai
1% OsO4	Electron Microscopy Science	19100
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
8% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
8% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
Anti-rabbit PKC	Sigma-Aldrich	P4334
Anti-Rabbit SP	Abcam	ab67006
DAB Substrate kit	MXB Biotechnologies	KIT-9701/9702/9703
Elbow scissors	Suzhou66 vision company	54010
Electron microscope	Phillips	CM120
Epon resin	Electron Microscopy Science	14910
forcep	Suzhou66 vision company	S101A
Millipore filter paper	Merck Millipore	PR05538
Na2HPO4· 12H2O	Sigma	71650	A component of phosphate buffer
NaH2PO4· H2O	Sigma	71507	A component of phosphate buffer
Picric acid	Electron Microscopy Science	19550
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma	215511
Tris	Solarbio	917R071
Ultramicrotome	Leica
Uranyl acetate	Electron Microscopy Science	22400
VACTASTAIN ABC kit, Peroxidase (Rabbit IgG)	Vector Laboratories	PK-4001