Untersuchung von retinalen Schaltkreisen und molekularer Lokalisierung durch Voreinbettung der Immunelektronenmikroskopie

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die detaillierten Schritte der Immunelektronenmikroskopie vor der Einbettung, wobei der Schwerpunkt auf der Erforschung synaptischer Schaltkreise und der Proteinlokalisierung in der Netzhaut liegt.

Zusammenfassung

Die Netzhaut besteht aus zahlreichen Zellen, die verschiedene neuronale Schaltkreise bilden, die die erste Stufe der Sehbahn bilden. Jeder Schaltkreis zeichnet sich durch einzigartige Merkmale und unterschiedliche Neurotransmitter aus, die seine Rolle und funktionelle Bedeutung bestimmen. Angesichts der komplizierten Zelltypen innerhalb ihrer Struktur stellt die Komplexität der neuronalen Schaltkreise in der Netzhaut eine Herausforderung für die Erforschung dar. Um retinale Schaltkreise und Cross-Talks, wie z.B. die Verbindung zwischen Zapfen- und Stäbchenwegen, und die genaue molekulare Lokalisierung (Neurotransmitter oder Neuropeptide), wie z.B. das Vorhandensein von Substanz P-ähnlicher Immunreaktivität in der Netzhaut der Maus, besser untersuchen zu können, haben wir eine Pre-Embedding-Immunelektronenmikroskopie (Immuno-EM) Methode eingesetzt, um synaptische Verbindungen und Organisation zu untersuchen. Dieser Ansatz ermöglicht es uns, spezifische interzelluläre synaptische Verbindungen und eine präzise molekulare Lokalisierung zu lokalisieren und könnte eine richtungsweisende Rolle bei der Erforschung seiner Funktion spielen. Dieser Artikel beschreibt das Protokoll, die verwendeten Reagenzien und detaillierte Schritte, einschließlich (1) Vorbereitung der Netzhautfixierung, (2) Immunfärbung vor der Einbettung und (3) Nachfixierung und Einbettung.

Einleitung

Die Komplexität der neuronalen Schaltkreise in der Netzhaut stellt eine Herausforderung für die Erforschung dar, wenn man die unterschiedlichen Zelltypen innerhalb ihrer Struktur berücksichtigt ^1,2. In einem ersten Schritt geht es darum, synaptische Verbindungen zwischen verschiedenen Zellen zu identifizieren und die zelluläre Lokalisation bestimmter Neurotransmitter oder Neuropeptide zu bestimmen. Mit den Fortschritten in der Molekularbiologie und der Einführung neuer Proteine wird die präzise Lokalisierung in der Netzhaut entscheidend für das Verständnis ihrer Funktionen und....

Protokoll

Die Pflege und der Umgang mit den Tieren wurden durch die Verordnung der Ethikkommission der Medizinischen Universität Wenzhou in Übereinstimmung mit den ARVO-Richtlinien genehmigt. In dieser Studie wurden adulte Mäuse (C57BL/6J, männlich und weiblich, 8 bis 12 Wochen alt) verwendet. Die für die Studie benötigten Geräte und Reagenzien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung für die Netzhautfixierung

1. Stellen Sie folgende Materialien und Werkzeuge zusammen: ein Präpariermikroskop, zwei Pinzetten mit sehr feinen Spitzen, eine Schere, eine 1 mL Spritze....

Diskussion

In diesem Artikel wurden drei kritische Schritte für die erfolgreiche Beobachtung synaptischer Schaltkreise und der Proteinlokalisierung beschrieben: (1) schnelle und schwache Fixierung, (2) Immunfärbung vor der Einbettung und (3) Nachfixierung und Einbettung.

Wir gehen davon aus, dass die Fixierung der Schlüsselschritt für einen erfolgreichen Ansatz vor der Einbettung von Immuno-EM ist. Daher wird hier die Bedeutung von frischem Fixiermittel und schneller.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe needle	kangdelai
1% OsO4	Electron Microscopy Science	19100
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
8% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
8% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
Anti-rabbit PKC	Sigma-Aldrich	P4334
Anti-Rabbit SP	Abcam	ab67006
DAB Substrate kit	MXB Biotechnologies	KIT-9701/9702/9703
Elbow scissors	Suzhou66 vision company	54010
Electron microscope	Phillips	CM120
Epon resin	Electron Microscopy Science	14910
forcep	Suzhou66 vision company	S101A
Millipore filter paper	Merck Millipore	PR05538
Na2HPO4· 12H2O	Sigma	71650	A component of phosphate buffer
NaH2PO4· H2O	Sigma	71507	A component of phosphate buffer
Picric acid	Electron Microscopy Science	19550
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma	215511
Tris	Solarbio	917R071
Ultramicrotome	Leica
Uranyl acetate	Electron Microscopy Science	22400
VACTASTAIN ABC kit, Peroxidase (Rabbit IgG)	Vector Laboratories	PK-4001