免疫電子顕微鏡のプレ埋め込みによる網膜回路と分子局在の研究

要約

このプロトコルでは、網膜のシナプス回路とタンパク質の局在の探索に焦点を当てて、免疫電子顕微鏡のプレ埋め込みの詳細な手順を概説しています。

要約

網膜は、視覚経路の第一段階を構成する多様なニューロン回路を形成する多数の細胞から構成されています。各回路は、独自の機能と異なる神経伝達物質によって特徴付けられ、その役割と機能的意義を決定します。その構造内には複雑な細胞タイプがあるため、網膜のニューロン回路の複雑さは、探索に課題をもたらします。網膜回路とクロストーク(錐体経路と桿体経路のリンクなど)、およびマウス網膜におけるサブスタンスP様免疫反応性の存在などの正確な分子局在(神経伝達物質または神経ペプチド)をより詳細に調査するために、シナプスの結合と組織化を探索するために、プレエンベッド免疫電子顕微鏡(免疫電子顕微鏡)法を採用しました。このアプローチにより、特定の細胞間シナプス結合と正確な分子局在を特定することができ、その機能を探求する上での指針となる可能性があります。この記事では、(1)網膜固定の準備、(2)包埋前の免疫染色、(3)固定後の包埋など、プロトコール、使用する試薬、および詳細な手順について説明します。

概要

網膜の神経回路の複雑さは、その構造内の多様な細胞タイプを考慮すると、探索の課題を提示します^1,2。最初のステップでは、異なる細胞間のシナプス結合を特定し、特定の神経伝達物質または神経ペプチドの細胞局在を決定します。分子生物学の進歩により新しいタンパク質が導入されるにつれて、網膜における正確な局在化は、その機能を理解し、網膜回路とシナプス結合を解析するために重要になる^3,4,5。

光学顕微鏡の分解能には限界があるため、神経細胞の細胞内構造を検出するために電子顕微鏡(EM)が一般的に使用されます。電磁界には様々な分類があり、従来の透過型電子顕微鏡(TEM)は細胞の超微細構造の観察に利用されていました6,7,8,9。免疫電子顕微鏡(immuno-EM)は、EMの....

プロトコル

動物の世話と取り扱いは、ARVOガイドラインに従って、温州医科大学の倫理委員会の規則によって承認されました。本研究では、成体マウス(C57BL/6J、雌雄、8週齢から12週齢)を用いた。本試験に必要な機器および試薬は、 資料表に記載されています。

1. 網膜固定の準備

1. 解剖顕微鏡、先端が非常に細い鉗子2本、はさみ、1mLシリンジ針(針サイズ:G26)、濾紙の材料と道具を組み立てます。
2. 体重0.25 mg / gで2,2,2-トリブロモエタノールの腹腔内注射によりマウスに深く麻酔をかけます。その後、ネズミの首を切り落とし、頭^{を切断します16}。
3. 肘ハサミで眼球を摘出し、0.1 M リン酸緩衝液 (PB; pH 7.4) に 4% パラホルムアルデヒド-0.2% ピクリン酸 4% を含有するガラス皿に入れます。
4. 解剖顕微鏡下で、1mLのシリンジ針を使用して角膜リンバスに穴を開け、穴をたどってハサミで前部を切り取ります。次に、鉗子で内側の網膜表面からレンズを取り外します。
5. 2つの鉗子を使用して、網膜がアイカップから完全に分離されるまで(カップ状の網膜組織が脈絡膜から完全に分離された)まで強膜を慎重に剥がし....

ディスカッション

この記事では、シナプス回路とタンパク質の局在をうまく観察するための3つの重要なステップ、(1)迅速および弱い固定、(2)免疫染色のプレエンベッド、および(3)ポスト固定とインベッドについて説明しました。

私たちは、固定化がプレエンベッド免疫EMアプローチを成功させるための重要なステップであることを提案します。したがって、ここ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe needle	kangdelai
1% OsO4	Electron Microscopy Science	19100
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
8% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
8% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
Anti-rabbit PKC	Sigma-Aldrich	P4334
Anti-Rabbit SP	Abcam	ab67006
DAB Substrate kit	MXB Biotechnologies	KIT-9701/9702/9703
Elbow scissors	Suzhou66 vision company	54010
Electron microscope	Phillips	CM120
Epon resin	Electron Microscopy Science	14910
forcep	Suzhou66 vision company	S101A
Millipore filter paper	Merck Millipore	PR05538
Na2HPO4· 12H2O	Sigma	71650	A component of phosphate buffer
NaH2PO4· H2O	Sigma	71507	A component of phosphate buffer
Picric acid	Electron Microscopy Science	19550
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma	215511
Tris	Solarbio	917R071
Ultramicrotome	Leica
Uranyl acetate	Electron Microscopy Science	22400
VACTASTAIN ABC kit, Peroxidase (Rabbit IgG)	Vector Laboratories	PK-4001