Investigación de circuitos retinianos y localización molecular mediante microscopía inmunoelectrónica previa a la inclusión

Resumen

Este protocolo describe los pasos detallados de la microscopía inmunoelectrónica previa a la incorporación, con un enfoque en la exploración de los circuitos sinápticos y la localización de proteínas en la retina.

Resumen

La retina está formada por numerosas células que forman diversos circuitos neuronales, que constituyen la primera etapa de la vía visual. Cada circuito se caracteriza por características únicas y neurotransmisores distintos, lo que determina su papel e importancia funcional. Dados los intrincados tipos de células dentro de su estructura, la complejidad de los circuitos neuronales en la retina plantea desafíos para la exploración. Para investigar mejor los circuitos de la retina y la diafonía, como el enlace entre las vías del cono y el bastón, y la localización molecular precisa (neurotransmisores o neuropéptidos), como la presencia de inmunorreactividad similar a la sustancia P en la retina del ratón, empleamos un método de microscopía inmunoelectrónica previa a la inclusión (immuno-EM) para explorar las conexiones sinápticas y la organización. Este enfoque nos permite identificar conexiones sinápticas intercelulares específicas y una localización molecular precisa, y podría desempeñar un papel guía en la exploración de su función. En este artículo se describe el protocolo, los reactivos utilizados y los pasos detallados, que incluyen (1) la preparación de la fijación de la retina, (2) la inmunotinción previa a la inserción y (3) la posfijación y la inclusión.

Introducción

La complejidad de los circuitos neuronales en la retina presenta desafíos para la exploración, considerando los diversos tipos de células dentro de su estructura ^1,2. El paso inicial consiste en identificar las conexiones sinápticas entre diferentes células y determinar la localización celular de neurotransmisores o neuropéptidos específicos. A medida que los avances de la biología molecular introducen nuevas proteínas, la localización precisa en la retina se vuelve crucial para comprender sus funciones y analizar los circuitos retinianos y las conexiones sinápticas

Protocolo

El cuidado y manejo de los animales fueron aprobados por el Reglamento del Comité de Ética de la Universidad Médica de Wenzhou de acuerdo con las directrices de ARVO. En esta investigación se utilizaron ratones adultos (C57BL/6J, macho y hembra, de 8 a 12 semanas de edad). El equipo y los reactivos necesarios para el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación para la fijación de la retina

1. Reúna los siguientes materiales y herramientas: un microscopio de disección, dos pinzas con puntas muy finas, tijeras, una aguja de jeringa de 1 ml (tamaño de ....

Discusión

Este artículo ha descrito tres pasos críticos para la observación exitosa de los circuitos sinápticos y la localización de proteínas: (1) fijación rápida y débil, (2) inmunotinción previa a la inclusión y (3) postfijación e incrustación.

Proponemos que la fijación es el paso clave para el éxito de un enfoque inmuno-EM previo a la incorporación. Por lo tanto, aquí se enfatiza la importancia de un fijador fresco y una fijación rápida, denomina.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe needle	kangdelai
1% OsO4	Electron Microscopy Science	19100
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
8% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
8% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
Anti-rabbit PKC	Sigma-Aldrich	P4334
Anti-Rabbit SP	Abcam	ab67006
DAB Substrate kit	MXB Biotechnologies	KIT-9701/9702/9703
Elbow scissors	Suzhou66 vision company	54010
Electron microscope	Phillips	CM120
Epon resin	Electron Microscopy Science	14910
forcep	Suzhou66 vision company	S101A
Millipore filter paper	Merck Millipore	PR05538
Na2HPO4· 12H2O	Sigma	71650	A component of phosphate buffer
NaH2PO4· H2O	Sigma	71507	A component of phosphate buffer
Picric acid	Electron Microscopy Science	19550
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma	215511
Tris	Solarbio	917R071
Ultramicrotome	Leica
Uranyl acetate	Electron Microscopy Science	22400
VACTASTAIN ABC kit, Peroxidase (Rabbit IgG)	Vector Laboratories	PK-4001