Investigación de circuitos retinianos y localización molecular mediante microscopía inmunoelectrónica previa a la inclusión

Resumen

Este protocolo describe los pasos detallados de la microscopía inmunoelectrónica previa a la incorporación, con un enfoque en la exploración de los circuitos sinápticos y la localización de proteínas en la retina.

Resumen

La retina está formada por numerosas células que forman diversos circuitos neuronales, que constituyen la primera etapa de la vía visual. Cada circuito se caracteriza por características únicas y neurotransmisores distintos, lo que determina su papel e importancia funcional. Dados los intrincados tipos de células dentro de su estructura, la complejidad de los circuitos neuronales en la retina plantea desafíos para la exploración. Para investigar mejor los circuitos de la retina y la diafonía, como el enlace entre las vías del cono y el bastón, y la localización molecular precisa (neurotransmisores o neuropéptidos), como la presencia de inmunorreactividad similar a la sustancia P en la retina del ratón, empleamos un método de microscopía inmunoelectrónica previa a la inclusión (immuno-EM) para explorar las conexiones sinápticas y la organización. Este enfoque nos permite identificar conexiones sinápticas intercelulares específicas y una localización molecular precisa, y podría desempeñar un papel guía en la exploración de su función. En este artículo se describe el protocolo, los reactivos utilizados y los pasos detallados, que incluyen (1) la preparación de la fijación de la retina, (2) la inmunotinción previa a la inserción y (3) la posfijación y la inclusión.

Introducción

La complejidad de los circuitos neuronales en la retina presenta desafíos para la exploración, considerando los diversos tipos de células dentro de su estructura ^1,2. El paso inicial consiste en identificar las conexiones sinápticas entre diferentes células y determinar la localización celular de neurotransmisores o neuropéptidos específicos. A medida que los avances de la biología molecular introducen nuevas proteínas, la localización precisa en la retina se vuelve crucial para comprender sus funciones y analizar los circuitos retinianos y las conexiones sinápticas ^3,4,5.

Debido a la resolución limitada de la microscopía óptica, la microscopía electrónica (EM) se usa comúnmente para detectar las estructuras subcelulares de las células nerviosas. La EM tiene varias clasificaciones, con la microscopía electrónica de transmisión convencional (TEM) utilizada para observar las ultraestructuras celulares 6,7,8,9. La inmunomicroscopía electrónica (immuno-EM), que combina la resolución espacial de la EM con la capacidad de identificación química de los anticuerpos que se unen específicamente a las proteínas¹⁰, se destaca como el método óptimo y exclusivo para investigar las conexiones sinápticas y la localización de proteínas subcelulares en la retina^11,12.

Las técnicas de inmuno-EM se pueden dividir en métodos de pre-inclusión y post-incrustación basados en el orden de inclusión y la incubación de anticuerpos. En comparación con el método de post-incrustación, el enfoque de pre-incrustación es capaz de identificar a gran escala y a larga distancia 13,14,15, ofreciendo un enfoque óptimo para el estudio de procesos celulares como axones y dendritas. Además, esta técnica proporciona una señal fuerte y un amplio campo de visión, lo que la hace ventajosa para investigaciones exhaustivas de la expresión de proteínas y la localización molecular en el citoplasma. Este método resulta particularmente valioso para garantizar estructuras identificadas químicamente que son visibles en todo el citoplasma, las células o la retina.

Sin embargo, el método de post-incrustación, a pesar de tener menor penetración o difusión en comparación con el método de pre-incrustación, no es tan sensible^16,17. En términos simples, si el objetivo es explorar la localización de neurotransmisores específicos en el citoplasma o en las terminales sinápticas, el inmuno-EM previo a la inclusión es el método preferido. Por el contrario, para identificar la localización de los receptores de membrana, se recomienda utilizar inmunogold EM posterior a la incrustación.

Teniendo en cuenta estas consideraciones, optamos por el método inmuno-EM pre-incrustación para profundizar en los circuitos retinianos, incluyendo la interacción entre las vías del cono y el bastón, y la localización molecular, como la distribución y organización sináptica de la inmunorreactividad tipo sustancia P (SP-IR) en la retina del ratón.

Protocolo

El cuidado y manejo de los animales fueron aprobados por el Reglamento del Comité de Ética de la Universidad Médica de Wenzhou de acuerdo con las directrices de ARVO. En esta investigación se utilizaron ratones adultos (C57BL/6J, macho y hembra, de 8 a 12 semanas de edad). El equipo y los reactivos necesarios para el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación para la fijación de la retina

1. Reúna los siguientes materiales y herramientas: un microscopio de disección, dos pinzas con puntas muy finas, tijeras, una aguja de jeringa de 1 ml (tamaño de aguja: G26) y papel de filtro.
2. Anestesiar profundamente ratones mediante inyección intraperitoneal de 2,2,2-tribromoetanol a 0,25 mg/g de peso corporal. Posteriormente, decapitar a los ratones y cortarles la cabeza¹⁶.
3. Enuclear sus ojos con unas tijeras de codo y colocarlos en un plato de vidrio que contenga 4% de paraformaldehído-0,2% de ácido pícrico en tampón de fosfato 0,1 M (PB; pH 7,4).
4. Bajo el microscopio de disección, perfore un orificio en el limbo corneal con una aguja de jeringa de 1 ml y corte el segmento anterior con unas tijeras, siguiendo el orificio. Luego, retire el cristalino de la superficie interna de la retina con fórceps.
5. Use dos pinzas para pelar cuidadosamente la esclerótica hasta que la retina quede completamente aislada de la copa ocular (el tejido de la retina en forma de copa se separó completamente de la coroides). Posteriormente, corta la retina en cuatro trozos.
6. Fijar estas secciones en paraformaldehído al 4%-ácido pícrico al 0,2% en PB 0,1 M (pH 7,4) durante 2 h a temperatura ambiente (RT) y, a continuación, transferir el tejido a paraformaldehído al 4% en PB 0,1 M (pH 10,4) durante la noche a 4 °C.

2. Inmunotinción previa a la inclusión

1. Después de lavar en 0,01 M PBS (pH 7,4) seis veces durante 10 min cada una, incubar los tejidos de la retina en borohidruro de sodio al 1% (NaBH₄) en PBS 0,01 M (pH 7,4) durante 30 min.
2. Lave las secciones de la retina con 0,01 M PBS (pH 7,4) al menos seis veces. Mientras tanto, retire el vítreo con papel de filtro y luego corte la retina en rodajas pequeñas de entre 100 y 300 μm con una cuchilla de afeitar de doble filo.
3. Después de bloquear con suero de cabra normal (NGS) al 5% en 0,1 M PB (pH 7,4) durante 1 h en RT, incubar los cortes de retina con anticuerpos primarios (Anti-rabbit PKCα, 1:80; Anti-Rabbit SP, 1:100) junto con un 2% de NGS en 0,01 M PBS (pH 7,4) durante 2 h a RT en un agitador. Posteriormente, incubar durante 96 h (5 días) a 4 °C en un agitador.
4. Después de lavar seis veces durante 10 min cada una en 0,01 M PBS (pH 7,4), incubar los cortes de retina con el anticuerpo secundario a 1:200, como IgG anti-conejo de cabra, junto con NGS al 2% en 0,01 M PBS (pH 7,4) durante 2 h a RT en un agitador. A continuación, incubar durante 48 h (2 días) a 4 °C en un agitador.
   NOTA: Los anticuerpos secundarios se aplicaron solos en los experimentos de control.
5. Lave las franjas retinianas en 0,01 M PBS (pH 7,4) seis veces durante 10 min cada una antes de incubar con el reactivo A y el reactivo B del kit ABC a 1:100 en 0,01M PBS (pH 7,4) durante 2 días a 4 °C. (Tanto el reactivo A como el reactivo B se diluyeron con 0,01 M de PBS. Por ejemplo: Una solución: 6 μl; Solución B: 6 μl; 0,01 M PBS: 588 μl, total de 600 μl).
6. Lave las rayas de la retina con tampón Tris de 0,05 M (pH 7,2) tres veces durante 10 minutos cada una. A continuación, preincube las rayas de retina con un 5 % de reactivo 1 y un 5 % de reactivo 3 del kit DAB en agua destilada durante 1 hora a temperatura ambiente. (La proporción, por ejemplo: reactivo 1: 50 μl; reactivo 3: 50 μl; agua destilada: 900 μl, total de 1000 μl).
7. Tiñe las rayas de la retina con DAB. Añada el mismo volumen de solución de tres tubos en el kit DAB en secuencia (reactivo 1-reactivo 2-reactivo 3). Observe la condición de tinción con el microscopio de disección. Detenga la tinción cuando las células se vuelvan marrones; Este proceso tarda entre 10 y 20 minutos.
8. Lave las rayas de la retina con tampón Tris 0,05 M (pH 7,2) tres veces durante 10 minutos cada una y luego lávelas con 0,01 M PBS seis veces durante 10 minutos cada una.

3. Post-fijación e inclusión

1. Fije las rayas de la retina en glutaraldehído al 2% durante 1-2 h a temperatura ambiente (RT), y luego lave en 0,01 M PBS (pH 7,4) seis veces durante 10 min cada una.
2. Incubar las franjas retinianas con tetróxido de osmio al 1% (OsO₄) en PB 0,1 M durante 1 h en RT y mantenerlas en un lugar oscuro.
3. Después de lavar en agua destilada (ddH₂O) seis veces durante 10 min cada una, incubar los tejidos de la retina con acetato de uranilo durante 1 h a RT y mantenerlos en un lugar oscuro para teñir estos tejidos.
4. Coloque los tejidos de la retina en soluciones de acetona (50%, 70%, 80% y 90%) durante 10 minutos cada uno, luego al 100% dos veces durante 10 minutos cada uno.
5. Sumerja los tejidos de la retina en una mezcla que contenga el mismo volumen de acetato de uranilo y una resina epoxi durante 1 h a 37 °C en el horno de secado, seguido de una mezcla que contenga acetato de uranilo y la resina (1:4) durante la noche a 37 °C en el horno de secado.
6. Transfiera los tejidos de la retina suavemente con un palillo de dientes a la nueva resina durante 1 h a 45 °C en un horno de secado, y luego la franja de la retina orientada se incrusta en la placa de inclusión con la resina.
7. Introducir la muestra en un horno de secado a 45 °C durante 3 h y en un horno de secado a 65 °C durante 48 h.
8. Forme trapezoides, forme los bloques de inclusión y corte el bloque en secciones de 1 μm de grosor con un ultramicrótomo, tiña estas secciones con azul de toluidina y precribó las regiones de interés con un microscopio óptico.
9. Recoja secciones ultrafinas (70-90 nm) en rejillas de cobre y obsérvelas bajo un microscopio electrónico.

Resultados

La Figura 1 muestra ejemplos de experimentos de control sin incubación de anticuerpos primarios contra la proteína quinasa C alfa (PKCα) o SP, en los que no se encontró inmunorreactividad (IR).

La figura 2 muestra la PKCα-IR en la retina del ratón. PKCα sirve como marcador para todas las células bipolares de bastones (RBC) en la retina¹⁸. A nivel de microscopía electr?...

Discusión

Este artículo ha descrito tres pasos críticos para la observación exitosa de los circuitos sinápticos y la localización de proteínas: (1) fijación rápida y débil, (2) inmunotinción previa a la inclusión y (3) postfijación e incrustación.

Proponemos que la fijación es el paso clave para el éxito de un enfoque inmuno-EM previo a la incorporación. Por lo tanto, aquí se enfatiza la importancia de un fijador fresco y una fijación rápida, denomina...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe needle	kangdelai
1% OsO4	Electron Microscopy Science	19100
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
8% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
8% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
Anti-rabbit PKC	Sigma-Aldrich	P4334
Anti-Rabbit SP	Abcam	ab67006
DAB Substrate kit	MXB Biotechnologies	KIT-9701/9702/9703
Elbow scissors	Suzhou66 vision company	54010
Electron microscope	Phillips	CM120
Epon resin	Electron Microscopy Science	14910
forcep	Suzhou66 vision company	S101A
Millipore filter paper	Merck Millipore	PR05538
Na2HPO4· 12H2O	Sigma	71650	A component of phosphate buffer
NaH2PO4· H2O	Sigma	71507	A component of phosphate buffer
Picric acid	Electron Microscopy Science	19550
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma	215511
Tris	Solarbio	917R071
Ultramicrotome	Leica
Uranyl acetate	Electron Microscopy Science	22400
VACTASTAIN ABC kit, Peroxidase (Rabbit IgG)	Vector Laboratories	PK-4001