Investigando circuitos retinianos e localização molecular por microscopia imunoeletrônica pré-incorporada

Resumo

Este protocolo descreve as etapas detalhadas da microscopia imunoeletrônica pré-incorporada, com foco na exploração de circuitos sinápticos e localização de proteínas na retina.

Resumo

A retina compreende numerosas células que formam diversos circuitos neuronais, que constituem o primeiro estágio da via visual. Cada circuito é caracterizado por características únicas e neurotransmissores distintos, determinando seu papel e significado funcional. Dados os intrincados tipos de células dentro de sua estrutura, a complexidade dos circuitos neuronais na retina apresenta desafios para a exploração. Para investigar melhor os circuitos retinianos e a conversa cruzada, como a ligação entre as vias do cone e do bastonete, e a localização molecular precisa (neurotransmissores ou neuropeptídeos), como a presença de imunorreatividade semelhante à substância P na retina do camundongo, empregamos um método de microscopia imunoeletrônica pré-incorporada (imuno-EM) para explorar as conexões sinápticas e a organização. Essa abordagem nos permite identificar conexões sinápticas intercelulares específicas e localização molecular precisa e pode desempenhar um papel orientador na exploração de sua função. Este artigo descreve o protocolo, os reagentes usados e as etapas detalhadas, incluindo (1) preparação para fixação da retina, (2) imunocoloração pré-incorporação e (3) pós-fixação e incorporação.

Introdução

A complexidade dos circuitos neuronais na retina apresenta desafios para exploração, considerando os diversos tipos de células dentro de sua estrutura ^1,2. A etapa inicial envolve a identificação de conexões sinápticas entre diferentes células e a determinação da localização celular de neurotransmissores ou neuropeptídeos específicos. À medida que os avanços da biologia molecular introduzem novas proteínas, a localização precisa na retina torna-se crucial para entender suas funções e analisar os circuitos retinianos e as conexões sinápticas ^3,4,5.

Devido à resolução limitada da microscopia de luz, a microscopia eletrônica (EM) é comumente usada para detectar as estruturas subcelulares das células nervosas. O EM possui várias classificações, sendo a microscopia eletrônica de transmissão convencional (TEM) utilizada para observar as ultraestruturas celulares 6,7,8,9. A microscopia imunoeletrônica (immuno-EM), que combina a resolução espacial do EM com a capacidade de identificação química de anticorpos que se ligam especificamente às proteínas¹⁰, destaca-se como o método ideal e exclusivo para investigar conexões sinápticas e localização de proteínas subcelulares na retina^11,12.

As técnicas de imuno-EM podem ser divididas em métodos de pré-incorporação e pós-incorporação com base na ordem de incorporação e incubação de anticorpos. Em comparação com o método pós-incorporação, a abordagem pré-incorporação é capaz de identificação em larga escala e longa distância^{13 , 14 , 15} , oferecendo uma abordagem ideal para estudar processos celulares como axônios e dendritos. Além disso, essa técnica fornece um sinal forte e amplo campo de visão, tornando-a vantajosa para investigações abrangentes da expressão de proteínas e localização molecular no citoplasma. Este método é particularmente valioso para garantir estruturas quimicamente identificadas que são visíveis em todo o citoplasma, células ou retina.

No entanto, o método pós-embedding, embora tenha menor penetração ou difusão em comparação com o método pré-embedding, não é tão sensível^16,17. Em termos simples, se o objetivo é explorar a localização de neurotransmissores específicos no citoplasma ou nos terminais sinápticos, o imuno-EM pré-incorporado é o método preferido. Por outro lado, para identificar a localização dos receptores de membrana, é mais recomendável utilizar o imunogold EM pós-incorporação.

Dadas essas considerações, optamos pelo método imuno-EM pré-incorporação para mergulhar nos circuitos da retina, incluindo a interação entre as vias do cone e do bastonete, e a localização molecular, como a distribuição e organização sináptica da imunorreatividade semelhante à substância P (SP-IR) na retina do camundongo.

Protocolo

O cuidado e o manuseio dos animais foram aprovados pelo Regulamento do Comitê de Ética da Universidade Médica de Wenzhou, de acordo com as diretrizes da ARVO. Camundongos adultos (C57BL/6J, machos e fêmeas, 8 a 12 semanas de idade) foram utilizados nesta pesquisa. O equipamento e os reagentes necessários para o estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação para fixação da retina

1. Monte os seguintes materiais e ferramentas: um microscópio de dissecação, duas pinças com pontas muito finas, tesoura, uma agulha de seringa de 1 mL (tamanho da agulha: G26) e papel de filtro.
2. Anestesiar profundamente os camundongos por injeção intraperitoneal de 2,2,2-tribromoetanol a 0,25 mg / g de peso corporal. Posteriormente, decapitar os ratos e cortar suas cabeças¹⁶.
3. Enuclee os olhos com uma tesoura de cotovelo e coloque-os em um prato de vidro contendo 4% de paraformaldeído e 0,2% de ácido pícrico em tampão fosfato 0,1 M (PB; pH 7,4).
4. Sob o microscópio de dissecação, faça um orifício no limbo da córnea usando uma agulha de seringa de 1 mL e corte o segmento anterior com uma tesoura, seguindo o orifício. Em seguida, remova a lente da superfície interna da retina com uma pinça.
5. Use duas pinças para descascar cuidadosamente a esclera até que a retina esteja completamente isolada da ocular (o tecido da retina em forma de concha separado completamente da coroide). Posteriormente, corte a retina em quatro pedaços.
6. Fixe essas seções em paraformaldeído a 4% e ácido pícrico a 0,2% em PB 0,1 M (pH 7,4) por 2 h à temperatura ambiente (RT) e, em seguida, transfira o tecido para paraformaldeído a 4% em PB 0,1 M (pH 10,4) durante a noite a 4 ° C.

2. Imunocoloração pré-incorporada

1. Após lavar em PBS 0,01 M (pH 7,4) seis vezes por 10 min cada, incubar os tecidos retinianos em borohidreto de sódio a 1% (NaBH₄) em PBS 0,01 M (pH 7,4) por 30 min.
2. Lave as seções da retina em 0,01 M PBS (pH 7,4) pelo menos seis vezes. Enquanto isso, remova o vítreo com papel de filtro e, em seguida, corte a retina em pequenas fatias entre 100-300 μm usando uma lâmina de barbear de dois gumes.
3. Após o bloqueio com 5% de soro de cabra normal (NGS) em 0,1 M PB (pH 7,4) por 1 h em RT, incubar as fatias da retina com anticorpos primários (Anti-rabbit PKCα, 1:80; Anti-Rabbit SP, 1:100) juntamente com 2% de NGS em 0,01 M PBS (pH 7,4) por 2 h em RT em um agitador. Em seguida, incubar durante 96 h (5 dias) a 4 °C num agitador.
4. Depois de lavar seis vezes por 10 min cada em 0,01 M PBS (pH 7,4), incubar as fatias da retina com o anticorpo secundário a 1:200, como IgG anti-coelho de cabra, juntamente com 2% NGS em 0,01 M PBS (pH 7,4) por 2 h em RT em um shaker. Em seguida, incubar durante 48 h (2 dias) a 4 °C num shaker.
   NOTA: Anticorpos secundários foram aplicados isoladamente em experimentos de controle.
5. Lave as listras retinianas em PBS 0,01 M (pH 7,4) seis vezes por 10 min cada antes de incubar com o reagente A e o reagente B do kit ABC a 1:100 em PBS 0,01M (pH 7,4) por 2 dias a 4 ° C. (Tanto o reagente A quanto o reagente B foram diluídos com 0,01 M PBS. Por exemplo: Uma solução: 6 μl; Solução B: 6 μl; 0,01 M PBS: 588 μl, total de 600 μl).
6. Lave as listras retinianas em tampão Tris 0,05 M (pH 7,2) três vezes por 10 min cada. Em seguida, pré-incube as listras retinianas com 5% de reagente 1 e 5% de reagente 3 do kit DAB em água destilada por 1 hora em temperatura ambiente. (A proporção, por exemplo: reagente 1: 50 μl; reagente 3: 50 μl; água destilada: 900 μl, total de 1000 μl).
7. Pinte as listras da retina com DAB. Adicionar o mesmo volume de solução de três tubos do kit DAB em sequência (reagente 1-reagente 2-reagente 3). Observe a condição de coloração usando o microscópio de dissecação. Pare a coloração quando as células ficarem marrons; Este processo leva de 10 a 20 minutos.
8. Lave as listras retinianas com tampão Tris 0,05 M (pH 7,2) três vezes por 10 min cada e depois lave em 0,01 M PBS seis vezes por 10 min cada.

3. Pós-fixação e incorporação

1. Fixe as listras retinianas em glutaraldeído a 2% por 1-2 h em temperatura ambiente (RT) e, em seguida, lave em PBS 0,01 M (pH 7,4) seis vezes por 10 min cada.
2. Incubar as listras retinianas com tetróxido de ósmio a 1% (OsO₄) em 0,1 M PB por 1 h em RT e mantê-las em local escuro.
3. Após lavar em água destilada (ddH₂O) seis vezes por 10 min cada, incubar os tecidos da retina com acetato de uranila por 1 h em RT e mantê-los em local escuro para manchar esses tecidos.
4. Coloque os tecidos da retina em soluções de acetona (50%, 70%, 80% e 90%) por 10 minutos cada, depois em 100% duas vezes por 10 minutos cada.
5. Mergulhar os tecidos retinianos numa mistura contendo o mesmo volume de acetato de uranilo e uma resina epóxi durante 1 h a uma estufa de secagem a 37 °C, seguida de uma mistura contendo acetato de uranilo e a resina (1:4) durante a noite a 37 °C.
6. Transfira os tecidos da retina suavemente usando um palito de dente para a nova resina por 1 h a 45 ° C em um forno de secagem e, em seguida, a faixa retiniana orientada é embutida na placa de incorporação com a resina.
7. Colocar a amostra numa estufa de secagem a 45 °C durante 3 h e numa estufa de secagem a 65 °C durante 48 h.
8. Molde os blocos de incorporação em trapézios e corte o bloco em seções de 1 μm de espessura com um ultramicrótomo, pinte essas seções com azul de toluidina e pré-selecione as regiões de interesse em um microscópio óptico.
9. Colete seções ultrafinas (70-90 nm) em grades de cobre e visualize-as sob um microscópio eletrônico.

Resultados

A Figura 1 mostra exemplos de experimentos de controle sem a incubação de anticorpos primários contra a proteína quinase C alfa (PKCα) ou SP, nos quais nenhuma imunorreatividade (IR) foi encontrada.

A Figura 2 mostra o PKCα-IR na retina do camundongo. PKCα serve como um marcador para todas as células bipolares de bastonetes (RBC) na retina¹⁸. No nível de microscopia el...

Discussão

Este artigo descreveu três etapas críticas para a observação bem-sucedida dos circuitos sinápticos e localização de proteínas: (1) fixação rápida e fraca, (2) imunocoloração pré-incorporação e (3) pós-fixação e incorporação.

Propomos que a fixação é o passo chave para uma abordagem imuno-EM pré-incorporação bem-sucedida. Assim, a importância do fixador fresco e da fixação rápida é enfatizada aqui, nomeando esse princípio de "pr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe needle	kangdelai
1% OsO4	Electron Microscopy Science	19100
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
8% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
8% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
Anti-rabbit PKC	Sigma-Aldrich	P4334
Anti-Rabbit SP	Abcam	ab67006
DAB Substrate kit	MXB Biotechnologies	KIT-9701/9702/9703
Elbow scissors	Suzhou66 vision company	54010
Electron microscope	Phillips	CM120
Epon resin	Electron Microscopy Science	14910
forcep	Suzhou66 vision company	S101A
Millipore filter paper	Merck Millipore	PR05538
Na2HPO4· 12H2O	Sigma	71650	A component of phosphate buffer
NaH2PO4· H2O	Sigma	71507	A component of phosphate buffer
Picric acid	Electron Microscopy Science	19550
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma	215511
Tris	Solarbio	917R071
Ultramicrotome	Leica
Uranyl acetate	Electron Microscopy Science	22400
VACTASTAIN ABC kit, Peroxidase (Rabbit IgG)	Vector Laboratories	PK-4001